方法論記事

リーシュ マニア、ひと細胞およびマウス精巣におけるプロファイリングをポリソーム

DOI：

10.3791/57600

⸱

2018年4月8日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Biochemistry, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Department of Biological Sciences, Texas Tech University, 3CISER (Center for the Integration of STEM Education & Research), Texas Tech University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ポリソーム プロファイリング技術の全体的な目標は、タンパク質合成時に個々 の mRNAs のトランスクリプトーム Mrna 翻訳活性の分析です。メソッドは、タンパク質合成の制御、翻訳活性化と健康と複数の人間の病気の抑制の研究にとって重要です。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

右金額は、適切なタイミングで適切なタンパク質発現正常な細胞機能と急速に変化する環境での生存の基礎であります。長い間、遺伝子発現研究は、転写レベルでの研究によって支配されていた。しかし、Mrna の定常状態レベルは蛋白質の生産と相関がない、Mrna の翻訳可能性は条件によって大きく異なります。リーシュ マニア原虫寄生虫のようないくつかの生物の蛋白質の表現は翻訳のレベルではほとんど規制されています。最近の研究は、その蛋白質の翻訳調節不全、代謝、がん、神経変性疾患や他の疾患に関連付けられて示した。ポリソームのプロファイリングは、タンパク質翻訳規則を研究する強力な方法です。それは個々 の mRNAs の並進状態を測定したり、ゲノム規模での翻訳を確認することができます。この手法の基本は、ポリソーム、リボソームのサブユニットと無料 Mrna 遠心分離、細胞質の中にショ糖密度勾配による溶解分離です。ユニバーサル ポリソーム プロファイル使用されるプロトコルで 3 つの異なるモデル原虫リーシュ マニア原虫、ひと培養細胞、動物組織を紹介します。リーシュ マニア原虫の細胞は懸濁液の自由に成長し、動物組織サンプルを表しますマウス精巣培養細胞付着性単分子膜の成長します。したがって、技術はこれらの源すべてに適応です。Polysomal 分画の分析のためのプロトコルには、個々 の mRNA のレベル Rt-qpcr、によってに、西部のしみとリボソーム Rna 電気泳動による解析によるタンパク質の検出が含まれています。メソッドは、分数の質量分析法による深い RNA シーケンスによってトランスクリプトームのレベルにリボソームの Mrna 協会の検討とリボソームのタンパク質の解析によってさらに拡張できます。このメソッドは、他の生物学的モデルに簡単に調整できます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

細胞の遺伝子発現制御は、転写、転写、翻訳のメカニズムによって制御されます。ディープの RNA シーケンスの進歩は、前例のないレベルでゲノム スケールで定常状態の mRNA のレベルの研究を許可します。しかし、最近の知見は、定常 mRNA レベルがない、常にタンパク質生産1,2と相関を明らかにしました。個々 のトラン スクリプトの運命は非常に複雑な内部/外部刺激、ストレスなどのような多くの要因によって異なります。タンパク質の生合成遺伝子発現の調節は、状況の変化にすばやく応答するために必要な式コントロールの別の層を提供します。ポリソーム (または"polyribosome") のプロファイリング、分離と積極的にリボソームの翻訳の可視化は、タンパク質合成の調節を研究する強力な方法です。最初の実験的応用は 1960 年代3に登場、ポリソームのプロファイリングは現在タンパク質翻訳研究4で最も重要なテクニックの 1 つ。単一の Mrna は、ポリソームの形成につながる 1 つ以上のリボソームで翻訳できます。成績証明書はシクロヘキシミド5リボソーム上停止することができ。、ショ糖勾配遠心6,

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

すべての動物の治療や研究で得られた組織の処理機関動物ケアおよび国立研究所に従ってテキサス工科大学健康科学センターで使用委員会によって承認されたプロトコルに従って行われました。健康家畜福祉ガイドライン、プロトコル番号 96005。脊椎動物を犠牲にし、機関動物ケアおよび使用委員会からガイドラインに従って組織を準備してください。このような委員会に欠けている、国立衛生研究所動物福祉ガイドラインを参照してください。アダルト (> 60 日古い) c57bl/6 マウスが使用されました。動物介護制度と国立衛生研究所動物福祉ガイドラインに従ってテキサス工科大学健康科学センターで使用の委員会によって承認されたプロトコルに従ってすべての動植物の組織が得られました。小部屋に置かれた単一のマウス、安楽死のと空気が約 30% と次第に転置された炭酸ガス麻酔、動物の苦痛を最小限に抑えます。次の呼吸の停止、組織を収穫前に動物の死を確認するのに頚部転位を使用しました。

注意: ライブリーシュ マニアとひと培養細胞のすべての作業は、バイオ セーフティ キャビネット BSL-2 認定研究室で行われました。

1. から細胞ライセートの調製リーシュ マニア主要な、培養ひと細胞およびマウス組織

注: 別のソース材料からライセート調製でいくつかの違いがあります。サッカロースの....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究では、3 つの異なるソースの polysomal のプロファイリング技術の応用について述べる: 寄生リーシュ マニア原虫、培養ひと細胞およびマウス精巣。リーシュ マニア原虫の細胞は自由に懸濁液中の液体媒体の成長、ひと培養細胞はプレートに付着性単分子膜の成長し、マウス精巣組織サンプルを表します。メソッドは、懸濁液、組織、または別の有機体からさまざまな種類および培養細胞の種類で自由に成長した細胞の他のタイプを簡単に調整できます。アプローチは、4 つの主要な手順で構成されています: ライセート調製、サッカロースの勾配の準備と遠心手順、ポリソーム分別およびサンプル コレクション画分の分析が続きます。さまざまなソースからの細胞は、収集および洗浄針や Dounce ホモジナイザーを通過に換散バッファーの分離します。遠心分離、ライセートを明らかに細胞の残骸を削除する使用されます。勾配分画法の方式は、図 1 aに表示されます。連続ショ糖密度勾配は、勾配メーカーで 10% と 50% の.......

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ショ糖密度勾配によるポリソーム分別が RNA と結合し、タンパク質画分の分析は個々 の mRNAs または全体 translatome の並進状態だけでなく、並進を規定する蛋白質の要因の役割を分析するための強力な方法通常の生理や病気の状態の間に機械。Polysomal プロファイリングリーシュ マニア転写制御は主として不在、遺伝子発現制御が主に発生しますを含む trypanosomatids などの生物の翻訳制御の研究に特に適している手法は、します。中に翻訳します。

ここでは、3 つのモデルで使用されるポリソーム分別のプロトコルについて述べる:リーシュ マニア寄生虫、ひと培養細胞およびマウス組織。ポリソーム分別手順は本質的にこの試験で使用される異なった有機体のための同じただし、lysate の準備いくつかの違いがあります。リーシュ マニア原虫の細胞液体文化で育つし、セルがカウントされますように溶解前にグラデーションの読み込みと同じ遠心分離によって収集されます。人間の細胞を洗浄し、直接板の上に分離できます。等しい荷重は、光学濃度に.......

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者が明らかに何もありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者はチン ・ リーのオーディオ録音との助けをありがちましょう。テキサス工科大学医療科学センターからスタートアップ資金によって支えられたし、神経科学研究と治療 (CTNT) のための卓越性のセンター A.L.K.; に PN CTNT 2017-05 AKHRJDHW を与える研究NIH グラントによって部分的に K.Z. ジェームス c. ハフマンとクリステン ・ r ・ デバカ R01AI099380 CISER (幹統合教育研究センター) 学者、プログラムによってサポートされていました。

....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Instruments:
グラジBiocomp Instruments Inc.108
ピストングラジエント分留装置Biocomp Instruments Inc.152
フラクションコレクターGilson, Inc.FC203B
NanoDrop OneThermo ScientificNanoDrop One
ニコン倒立顕微鏡ニコンECLIPSE Ts2-FL/TS2
2720 サーマルサイクラーライフサイエンス社 Applied Biosystems by Life Technologies4359659
CO2インキュベーターパナソニック ヘルスケア株式会社MCO-170A1CUV
HERATHERMインキュベーターThermo Scientific51028063
Biological Safety Cabinet, class II, type A2NuAire Inc.NU-543-400
Revco 冷凍庫Revco TechnologiesULT1386-5-D35
ベックマン L8-M Ultracentifugeベックマン・コールターL8M-70
遠心分離機エッペンドルフ5810R
遠心分離エッペンドルフ5424
超遠心分離機 ローター SW41ベックマン・コールター331362
スイングバケットローターエッペンドルフA-4-62
固定角ローターエッペンドルフF-45-30-11
クオンツスタジオ 12K Flex リアルタイムPCRマシン 285880228Applied Biosystems by life technologies4470661
TC20 自動セルカウンターバイオ・ラッド145-0102
血球計算盤ハウサー・サイエンティフィック02-671-51B
ソフトウェア 
トライアックスソフトウェア バイオコンプインスツルメンツ株式会社
材料:
計数スライド、細胞カウンター用デュアルチャンバーBio-Rad145-0011
1.5 mL 微量遠心チューブUSA Scientific1615-5500
オープントップポリクリア遠心チューブ、(14 mm x 89 mm)Seton Scientific7030
シリンジ、5 mLBD
BD シリンジ 3 mL23 ゲージ 1 インチ ニードルBD10020439
Nunclon Delta 定盤、14 cmThermo Scientific168381
Nunclon Delta 定盤、9 cmThermo Scientific172931
Nalgene 急流 90 mm フィルターユニット、500 mL、0.2 aPESThermo Scientific569-0020
BioLite 75 cm3 フラスコThermo Scientific130193
Nunc 50 mL 円錐形遠心分離管Thermo Scientific339653
Chemicals:
Trizol LSAmbion by Life Technologies10296028
HEPESFisher ScientificBP310-500
Trizma baseSigmaT1378-5KG
ダルベッコ修正イーグルの中高グルコース (DMEM)シグマD6429-500ML
ウシ胎児血清 (FBS)シグマF0926-50ML
ペニシリン-ストレプトマイシン (P/S)シグマP0781-100ML
リポフェクタミン 2000Invitrogen11668-019
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)SigmaD8537-500ML
塩化マグネシウム六水和物 (MgCl2x6H2O)Acros OrganicsAC413415000
塩化カリウム (KCl)SigmaP9541-500G
Nonidet P 40 (NP-40)Fluka (Sigma-Aldrich)74385
組換えルナシンリボヌクレアーゼ阻害剤PromegaN2511
ヘパリンナトリウム塩Sigma H3993-1MU
cOmplete Mini EDTAフリープロテアーゼ阻害剤ロシュ・ダイアグノスティック
グリコーゲンThermo ScientificR0551
ウォーターシグマW4502-1L
シクロヘキシミドSigmaC7698-1G
クロロホルム フィッシャー サイエンティフィック 194002
ジチオトレイトール(DTT)フィッシャーサイエンティフィBP172-5
チジウムブロマイッシャーサイエンティフィBP-1302-10
チレンジアミン四酢酸二ナトリウム脱水(EDTA)フィッシャーサイエンティフィックS316-212
ティメムライフテクノロジーズ22600050
プロマイシン二塩酸塩シグマP8833-100MG
スクロースフィッシャーサイエンティフィックS5-3KG
トリプシン-EDTA溶液シグマT4049-100MLhgh
容量cDNA逆転写酵素キットライフサイエンス技術による応用バイオシステム4368814
パワーSYBRグリーンPCRマスターミックスライフサイエンス応用バイオシステム4367659 HCl
Fisher ScientificA144SI-212
イソプロパノールフィッシャー サイエンティフィックBP26324
水酸化カリウム (KOH)シグマ221473-500G
抗 RPL11 抗体アブカムab79352
リボソームタンパク質 S6 (C-8) 抗体サンタクルーズ バイオテクノロジー インクsc-74459
1xM199SigmaM0393-10X1L
塩化リチウムΣL-9650
ジメチルスルホキシド (DMSO)Fisher ScientificD128-500
ゲルローディングバッファー IIThermo ScientificAM8546G
UltraPure AgaroseThermo Scientific16500-100
トリクロロ酢酸 (TCA)フィッシャーサイエンティフィックA322-100
スーパーシグナル ウェストピコ PLUS 化学発光基質サーモサイエンティフィック34580
ホルムアルデヒドフィッシャーサイエンティフィBP531-500
ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)シグマL5750-1KG
フッ化フェニルメチルスルホニル (PMSF)シグマP7626-5G
RNeasy ミニキットQiagen74104
アデノシン 5&プライム;-三リン酸二ナトリウム塩水和物 (ATP)シグマA1852-1VL
シトシン 5'-三リン酸二ナトリウム塩水和物 (CTP)シグマC1506-250MG
ウリジン 5'-三リン酸三ナトリウム塩水和物 (UTP)シグマU6625-100MG
グアノシン5'-三リン酸ナトリウム塩水和物(GTP)ΣG8877-250MG
SP6 RNAポリメラーゼNEBM0207S
ピロホシャターゼΣI1643-500UN
スペルミジンΣS0266-1G
エントマスター 機 309646ス 11836170001ックエドフィックエオプによるック

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  2. Capewell, P., et al. Regulation of Trypanosoma brucei Total and Polysomal mRNA during Development within Its Mammalian Host.

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

RNA

関連記事