このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

リーシュ マニア、ひと細胞およびマウス精巣におけるプロファイリングをポリソーム

18.2K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/57600

⸱

2018年4月8日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Biochemistry, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Department of Biological Sciences, Texas Tech University, 3CISER (Center for the Integration of STEM Education & Research), Texas Tech University

この記事について

サマリー

ポリソーム プロファイリング技術の全体的な目標は、タンパク質合成時に個々 の mRNAs のトランスクリプトーム Mrna 翻訳活性の分析です。メソッドは、タンパク質合成の制御、翻訳活性化と健康と複数の人間の病気の抑制の研究にとって重要です。

要約

右金額は、適切なタイミングで適切なタンパク質発現正常な細胞機能と急速に変化する環境での生存の基礎であります。長い間、遺伝子発現研究は、転写レベルでの研究によって支配されていた。しかし、Mrna の定常状態レベルは蛋白質の生産と相関がない、Mrna の翻訳可能性は条件によって大きく異なります。リーシュ マニア原虫寄生虫のようないくつかの生物の蛋白質の表現は翻訳のレベルではほとんど規制されています。最近の研究は、その蛋白質の翻訳調節不全、代謝、がん、神経変性疾患や他の疾患に関連付けられて示した。ポリソームのプロファイリングは、タンパク質翻訳規則を研究する強力な方法です。それは個々 の mRNAs の並進状態を測定したり、ゲノム規模での翻訳を確認することができます。この手法の基本は、ポリソーム、リボソームのサブユニットと無料 Mrna 遠心分離、細胞質の中にショ糖密度勾配による溶解分離です。ユニバーサル ポリソーム プロファイル使用されるプロトコルで 3 つの異なるモデル原虫リーシュ マニア原虫、ひと培養細胞、動物組織を紹介します。リーシュ マニア原虫の細胞は懸濁液の自由に成長し、動物組織サンプルを表しますマウス精巣培養細胞付着性単分子膜の成長します。したがって、技術はこれらの源すべてに適応です。Polysomal 分画の分析のためのプロトコルには、個々 の mRNA のレベル Rt-qpcr、によってに、西部のしみとリボソーム Rna 電気泳動による解析によるタンパク質の検出が含まれています。メソッドは、分数の質量分析法による深い RNA シーケンスによってトランスクリプトームのレベルにリボソームの Mrna 協会の検討とリボソームのタンパク質の解析によってさらに拡張できます。このメソッドは、他の生物学的モデルに簡単に調整できます。

概要

細胞の遺伝子発現制御は、転写、転写、翻訳のメカニズムによって制御されます。ディープの RNA シーケンスの進歩は、前例のないレベルでゲノム スケールで定常状態の mRNA のレベルの研究を許可します。しかし、最近の知見は、定常 mRNA レベルがない、常にタンパク質生産1,2と相関を明らかにしました。個々 のトラン スクリプトの運命は非常に複雑な内部/外部刺激、ストレスなどのような多くの要因によって異なります。タンパク質の生合成遺伝子発現の調節は、状況の変化にすばやく応答するために必要な式コントロールの別の層を提供します。ポリソーム (または"polyribosome") のプロファイリング、分離と積極的にリボソームの翻訳の可視化は、タンパク質合成の調節を研究する強力な方法です。最初の実験的応用は 1960 年代3に登場、ポリソームのプロファイリングは現在タンパク質翻訳研究4で最も重要なテクニックの 1 つ。単一の Mrna は、ポリソームの形成につながる 1 つ以上のリボソームで翻訳できます。成績証明書はシクロヘキシミド5リボソーム上停止することができ。、ショ糖勾配遠心6,7ポリソーム分別過程で Mrna はポリソームの別の番号を含むを分けることができます。,8,9. polysomal 分画の RNA 解析、により個々 の mRNAs の並進状態の変化の測定、ゲノム規模で、さまざまな生理的条件4,7,中10. メソッドは、5' UTR と 3' UTR シーケンス mRNA 訳し11の制御の役割を明らかにする、翻訳抑制12の Mirna の役割を調べる、リボソーム生合成13 の欠陥を明らかにも使用されています、および人間の病気14,15にリボソーム蛋白質の役割を理解します。過去 10 年間の中には、ヒトの疾患におけるその重要性を示す翻訳中に遺伝子発現の役割の拡大が浮上しています。がん、代謝における翻訳調節と神経変性疾患のための証拠は、圧倒的な15,16,17,18です。EIF4E 依存翻訳調節の調節不全に貢献するたとえば、自閉症関連の赤字15と FMRP14自閉症にリンクされている Mrna にリボソームの失速に関与しています。したがって、polysomal プロファイルは、複数の人間の病気の翻訳制御の欠陥を研究する非常に重要なツールです。

Polysomal 分数別の生理学的条件下での蛋白質の解析は、翻訳中のリボソームと関連因子の関数を暴き出します。ポリソーム プロファイリング手法は、酵母、哺乳類細胞、植物、原生動物10,19,20,21など多くの種で使用されています。原虫トリパノソーマリーシュ マニアなどの遺伝子発現の転写調節機構限定展示します。そのゲノムはプロモーター規制転写22を持たないコードする遺伝子クラスターに分類されます。代わりに、発達の遺伝子発現は主にタンパク質翻訳およびトリパノソーマ科種23,24で mRNA の安定性のレベルで制御されます。したがって、転写制御の不在で並進制御の理解はこれらの有機体のため特に重要です。Polysomal ・ プロファイリングは、リーシュ マニア25,26,27,28遺伝子発現の転写後調節を研究する強力なツールです。

現実では個々 の mRNAs レベルの検出の最近の進歩は時間 (RT qPCR) の量的な PCR とプロテオミクス技術と同様、次世代シーケンシングによるトランスクリプトーム、解像度、新しいレベルに polysomal プロファイルの利点をもたらします。これらのメソッドの使用は、ディープの RNA シーケンス細胞ゲノム規模での並進状態を監視するプロテオーム解析の併用による個々 の polysomal 分画の解析によってさらに拡張できます。これは、異なる生理学的および病理学的条件の下で翻訳を調節する新規分子プレイヤーの識別できます。ここでは、提案する 3 つのモデルで使用されるプロトコルをプロファイリング ユニバーサル ポリソーム: 原虫リーシュ マニア原虫、培養細胞、動物組織。異なった有機体、勾配条件の最適化、RNase 阻害剤の選択と本研究でポリソーム分数を分析する RT qPCR、西部のしみ、RNA の電気泳動の適用からのセル lysates の準備でのアドバイスを紹介します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

すべての動物の治療や研究で得られた組織の処理機関動物ケアおよび国立研究所に従ってテキサス工科大学健康科学センターで使用委員会によって承認されたプロトコルに従って行われました。健康家畜福祉ガイドライン、プロトコル番号 96005。脊椎動物を犠牲にし、機関動物ケアおよび使用委員会からガイドラインに従って組織を準備してください。このような委員会に欠けている、国立衛生研究所動物福祉ガイドラインを参照してください。アダルト (> 60 日古い) c57bl/6 マウスが使用されました。動物介護制度と国立衛生研究所動物福祉ガイドラインに従ってテキサス工科大学健康科学センターで使用の委員会によって承認されたプロトコルに従ってすべての動植物の組織が得られました。小部屋に置かれた単一のマウス、安楽死のと空気が約 30% と次第に転置された炭酸ガス麻酔、動物の苦痛を最小限に抑えます。次の呼吸の停止、組織を収穫前に動物の死を確認するのに頚部転位を使用しました。

注意: ライブリーシュ マニアとひと培養細胞のすべての作業は、バイオ セーフティ キャビネット BSL-2 認定研究室で行われました。

1. から細胞ライセートの調製リーシュ マニア主要な、培養ひと細胞およびマウス組織

注: 別のソース材料からライセート調製でいくつかの違いがあります。サッカロースの勾配の準備と polysomal の分別などを含むその他の手順は同一、サンプル ソースには依存しません。

  1. リーシュ マニア原虫細胞ライセート作製
    1. 1 x M199 中29 10% の胎仔ウシ血清 (FBS) とペニシリン/ストレプトマイシンの混合物を含む 30 mL のリーシュ マニア原虫(FV1 ひずみ) 細胞を接種する (100 単位と 100 μ g/mL 対応)1 x 105セル/ml の密度で.
      注:リーシュ マニア原虫の細胞を含むすべての手順は、バイオ セーフティ キャビネットの実施する必要があります。
    2. インキュベーターにセルを配置し、27 ° C で対数段階まで育てて (ログ半ば 5 x 106セル/mL に相当します)。成長を約 2 日間かかります。
    3. シクロヘキシミドを最終濃度 100 μ g/mL 翻訳 Mrna にリボソームを逮捕するために主要なリーシュ マニア文化に追加します。27 ° c. で 10 分のインキュベーターにセルを配置します。
    4. シクロヘキシミド処理が完了した後、50 mL の円錐管にセルを転送し、1,800 x g と 8 分破棄上清の 4 ° C で、それらをスピンします。
    5. ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) 30 mL でセルを洗浄します。8 分間 1,800 × g、4 ° C に遠心します。
    6. 上清を捨てます。DPBS の 1 mL の細胞を再懸濁します。
    7. セルの因数を取るし、3.5% ホルムアルデヒド液と混ぜます。
    8. 検定によってセルをカウントし、その濃度を測定します。および microfuge の管に必要な細胞数を転送します。0.5x108-2 × 108セル/mL から調製したライセート 1 つのショ糖勾配のローディングのために十分です。
    9. 1,800 x g でセルを回し、4 ° C で 8 分間は上澄みを廃棄します。
    10. プロテアーゼ阻害剤と RNase 阻害剤 (20 mM HEPES 島、pH 7.4 では、100 mM KCl、10 mM MgCl2、2 mM DTT、1% NP 40、1 x プロテアーゼ抑制剤のカクテル (EDTA 無添加)、200 単位/ml RNase 阻害剤) を含む換散バッファーの 1 mL に氷の上細胞ペレットを再懸濁します。
    11. ライセート 23 ゲージの針を通して 3 回渡します。液が透明になる針を通過した後。
    12. 11,200 x g で 4 ° C、ライセートを明らかにする 10 分遠心分離します。明らかにし転送に新鮮な lysate チューブし、ショ糖勾配遠心まで氷の上にそれを維持します。
    13. 収集 (後で分析) を入力としてライセートの 400-500 μ L は将来タンパク質解析用液体窒素ですぐにそれを凍結または RNA 解析のための凍結する前に RNA 精製試薬を追加します。
  2. ひと培養 HeLa 細胞から細胞ライセート作製
    1. HeLa 細胞を分割し、20 mL の 10 %fbs とペニシリン/ストレプトマイシンの混合物を含む DMEM 培地にそれらの種子 (100 単位と 100 μ g/mL 対応) セルをカウント 2 x 105セル/mL 15 cm プレート。
    2. 37 ° c、5% CO2製造元のプロトコルによると 20-24 h. 実行プラスミド DNA トランスフェクションの HeLa 細胞を成長します。
    3. 37 ° C、5% CO2でトランスフェクション後 24 h のための細胞に伝達します。
    4. シクロヘキシミドを最終濃度 100 μ g/mL 翻訳 Mrna にリボソームを逮捕し、37 ° C、5% CO2で 10 分のセルをインキュベートする成長の HeLa 細胞に追加します。培地を吸引します。氷の上の冷たい DPBS で 2 回細胞を洗ってください。
    5. プレートに換散バッファー (20 mM HEPES 島 pH 7.4 では、100 mM KCl、5 mM MgCl2、1 mM DTT、0.5% NP 40、1 x プロテアーゼ抑制剤のカクテル (EDTA 無添加) RNase 阻害剤または 1 mg/mL のヘパリンの 200 単位/ml) の 500 μ L を追加し、氷の上の細胞をこすり。
    6. および microfuge の管分離セルに転送します。0.5% と増加量のサンプルによると 5 mm MgCl2 NP 40 の濃度を調整します。
    7. ライセート 23 ゲージの針を通して 3-6 回渡します。
    8. スピン 11,200 x g と 4 ° C、8 分ライセートを明らかにします。遠心分離の後上清を新しいチューブに転送します。分光光度計を使用して、セル換散の効率を評価して、グラデーションの読み込みのサンプル量を決定します。0.1% の 0.5 mL にサンプルの 10 μ L を追加ナトリウム Dodecyl 硫酸塩 (SDS)。0.1 %sds に対しては空白です。測定吸光度 260 nm。予想される吸光度値は 15-20 単位/mL。
    9. ショ糖勾配遠心前に同じ吸光度値に換散バッファーのすべてのサンプルを希釈します。ショ糖勾配遠心まで氷のサンプルを保ちます。
  3. マウス精巣から細胞ライセート作製
    1. マウス精巣を解剖します。逃げずに小さな切開を行うと、精巣の精細管を収集し、0.1 mM 特異フッ化物 (PMSF) を添加した DPBS 5 mL を含む 15 mL の円錐管にそれらを転送します。
    2. 数回の反転によって積極的に組織をミックスします。5 分間氷の上単位重力を解決する組織を許可します。
    3. 削除し、結合細胞や組織片を含む曇りバッファーを破棄します。回手順 2-3 を繰り返します。精細管と生殖細胞の残りの白いペレットが濃縮されています。
    4. 精細管のペレットを 2 mL 遠心チューブに転送、500 x g で 1 分間でスピンが上澄みを廃棄します。
    5. 細管に換散バッファー (20 mM トリス-HCl、pH 7.4 では、100 mM KCl、5 mM MgCl2、1 mM DTT、0.5% NP 40、1 x プロテアーゼ抑制剤のカクテル (EDTA 無添加)、1 mg/mL のヘパリンまたは RNase 阻害剤の 200 単位/ml) 500 μ L を追加します。組織をカップ刻んだピペットを使用します。
    6. 小さなに懸濁液を転送 (0.5 〜 1.0 mL) Dounce ホモジナイザーです。ガラスの乳棒の 7 ~ 8 ストロークで組織を混乱させます。
    7. 1.5 mL 遠心チューブに液を転送します。
    8. 12,000 × g とライセートをオフに 8 分間、4 ° C でサンプルを遠心します。新しいチューブとストアにショ糖密度勾配にロードするまでの氷の上清を転送します。
    9. 50 μ L の入力サンプルとしてライセートを収集、将来のタンパク質分析-80 ° C ですぐにそれを凍結または RNA 解析のための凍結する前に RNA 精製試薬を追加します。

2. ショ糖勾配作製と超遠心法

  1. 2 スクロース グラデーション ソリューション (20 mM HEPES 島、pH 7.4 では、100 mM KCl、10 mM MgCl2、1 mM DTT、1 x プロテアーゼ抑制剤のカクテル)、10% ショ糖溶液または 50% ショ糖を含むを準備します。(トリス-HCl、pH 7.4 では HEPES の代わりに使用できます。)200 単位/ml 実験デザインによると RNase 阻害剤または 1 mg/mL のヘパリンを追加します。マーカー ブロックに SW 41 ローターの遠心管を置き、ブロックの上位レベルに沿って線を描画します。安定したラックにチューブを転送します。
  2. 接続層デバイス 10 mL 注射器を取るし、(上記準備) 10% ショ糖液と注射器を埋めます。チューブのマークに到達するまで軽く遠心管の下部にそれをリリースします。
  3. 50% ショ糖溶液による別の注射器を記入し、慎重にチューブの下に 10% ショ糖層を介してそのレイヤー デバイスを挿入します。優しくリリース ショ糖液チューブのマークに到達するまでから、下から開始。付属のキャップとチューブをシールします。
  4. ショ糖密度勾配を準備、グラデーション メーカー デバイスを有効にします。レベルの上または下ボタンを使用してプレートし、 DONEを押します。平準化は、勾配の直線性のために重要です。
  5. プレートを平準化後卒業生グラデーション メニューを開くを押します。グラデーション メニューのリストに移動し、SW 41 Ti ローターを選択します。上下のボタンを使用してメニューのリストから目的のショ糖密度勾配を選択します。押して使用。
  6. グラデーション メーカー プレートに勾配管ホルダーを配置します。ホルダーにチューブを転送します。6 グラデーションまで同時に準備できます。実行キーを押します。グラデーションのメーカーは、プログラムの速度と線形グラデーションを形成する角度でチューブを回転させます。グラデーションを準備する数分をかかります。
  7. プロセスが完了すると、ラックにチューブを置きます。キャップを脱ぐ。超遠心機チューブの上部からサンプル ボリュームと同じボリュームを削除します。
  8. ライセートを含む上にポリソームの 15-20260単位の 400-500 μ L を慎重にロードします。ローター バケツにチューブを置き、バランスをとる。
  9. 遠心 260,000 × g、4 ° C 2 時間 SW 41 ローターを使用しています。

3. ポリソーム分別およびサンプル コレクション

メモ: ライセート準備ソースによっていくつかの違いがありますが、グラデーションの準備とポリソームの分別のプロトコルは、同じ lysates のすべてのタイプの。

  1. 遠心の完了後、氷の上管とローター バケットを配置します。一部コレクターとグラデーション分留に電源を入れます。分留メニューをスキャンをクリックします。一部のコレクターに 24 のコレクション チューブをラックを置きます。
  2. 脱イオン水で分留側にリンス貯水池を埋めます。10 のリンスキーを押す s 分留にポンプを洗浄します。校正のためピストンに水で満たされた注射器洗浄アダプターを接続します。
  3. コンピューターの分留ソフトウェアを開きます。校正キーを押します。既定の設定を使用し、 [ok]を押します。注射器から水を注入する準備ができてください。
  4. キャリブレーションを行うに[ok]を押します。すぐに次の 5 のための水を注入する s。この時間の間に水が UV 検出器のフローセルを通過し、計測器が校正されます。記号ゼロ校正完了が表示されます。楽器は分別可能です。
  5. 注射器と洗浄アダプターを削除します。ヒントを分留のピストンに接続します。
  6. 10 の真鍮の空気のバルブを押し空気のキーを開く乾燥チューブとフロー ・ セルに s。空気バルブを閉じます。
  7. 優しくローター バケツから勾配管を削除し、それをラックに配置。管の上部にチューブ ホルダー キャップを適用し慎重にチューブ ホルダーにチューブを移動し、位置でロックします。
  8. プレース ホルダー、分留のピストンの下で。多くの場合、polysomal バンドは、目で見ることができます。分数とボリュームの必要な設定を紹介 (500 μ L/分画、24 画は、通常十分な)。適切なファイルを名前します。[Ok]をクリックし、グラフに行くボタンを押します。次のウィンドウでは、スキャンの開始を押します。OKを押して設定が表示されます。コレクターが最初の分数に樋から移動し、ピストンがチューブに移動します。ピストン グラデーションの上に達するとき、それは選択された速度まで減速して分数が収集されます。完了すると、ピストンは勾配管から移動します。
  9. 最後の分数を取得する分留に真鍮の空気のバルブを押し空気のキーを開きます。
  10. 氷の上には、ラックからチューブを移動します。
  11. RNA 精製試薬各分数とフラッシュの 2 つの容積は RNA の浄化まで液体窒素で凍結を追加します。また、蛋白質を分析する場合は、西部 (参照セクション 8) しみのそれらを集中する 10% の最終的な集中にトリクロロ酢酸を追加します。

4. Mrna RT qPCR データ解析中にレベルの正規化のため合成 RNA体外の準備

メモ:エシェリヒア属大腸菌OmpA mRNA は、正規化のこのプロトコルで使用されます。研究生物の Mrna と豊富な id を持たない他の RNA (哺乳類やリーシュ マニア) 使用することができます。

  1. OmpA 遺伝子30を含んでいるプラスミッドから標準 PCR の反作用によって SP6 プロモーターを含む OmpA DNA フラグメントを準備します。
  2. 100 μ L の混合物の準備: 80 mM HEPES 島、pH 7.5、16 mM MgCl2, 2 mM 3 mM GTP 10 mM DTT、3 mM 3 mM CTP、ATP 3 mM UTP、スペルミジン、0.5 U/μ L RNase 阻害、3 μ L SP6 RNA ポリメラーゼ DNA PCR OmpA の 1 μ g、0.005 U/μ L ピロホスファターゼ。
  3. 2 h 40 ° C で孵化させなさい。
  4. RNA 精製キットによって RNA を浄化します。
  5. 分光光度計による濃度を測定し、agarose のゲルの電気泳動で確認します。

5 グラデーションの分数と cDNA 作製から RNA の隔離

メモ: は、リボヌクレアーゼ阻害剤はリボヌクレアーゼ阻害剤として使用した場合、このプロトコルの RNA の浄化のために直接進みます。ただし、リボヌクレアーゼ阻害剤として使用する場合、ヘパリンは逆転写酵素 cDNA の準備で使用を抑制します。したがって、換散バッファーとグラデーションでヘパリンを使用していた場合、RNA の浄化を追加は必要となります。ヘパリンを使用していた場合、cDNA 合成 RNA を準備するセクション 6 を参照してください。

  1. RNA 精製試薬サンプルを解凍、20 を追加 RT qPCR 結果の正規化のための内部統制として合成 RNA の ng。1 つの変更を除いてメーカーのプロトコルに従って RNA の準備を進めます。1 μ L の RNA グレード グリコーゲン (20 μ g) 事前のイソプロパノールの沈殿物を追加します。RNase フリー水の 20-25 μ L の RNA ペレットを溶解します。
    注: グリコーゲンはキャリアとして機能し、損失を回避し、浄化の間に RNA の餌を視覚化するのに役立ちます。OmpA mRNA は、RT qPCR 反応でさらなる正常化に使用されます。
  2. 十分な収量を確保するため、分光光度計を用いた RNA 濃度を測定します。40 代、60 代と prepolysomes として monosomes を含有する RNA 画分の平等なボリュームを兼ね備えてください。2-4 リボゾームを含む分数を光ポリソームと組み合わせるし、重いポリソームと分数の 5-8 のリボソーム結合します。
  3. 合計分数からの RNA の 5-10 μ L を使用すると、キットを使用して、製造元の推奨事項を次の Cdna を準備できます。
  4. ヌクレアーゼ フリー水の 80 μ L を cDNA の 20 μ L に追加します。-20 ° C で cDNA サンプルを凍結します。

6. RNA 精製ヘパリン汚染から

注: ヘパリンは核酸逆転写酵素などの酵素の処理を抑制します。したがって、換散バッファーおよび/またはグラデーションにヘパリンを使用する場合は、この追加の浄化のプロトコルを使用します。

  1. 浄化された RNA サンプルを 1 M 最終濃度 LiCl を追加します。
  2. サンプルをミックスし、氷上で 1 時間インキュベートします。
  3. 16,000 x g でおよび 4 ° C、15 分のサンプルをスピンします。
  4. ピペットを使用して可能な限り完全上清を除去します。
  5. 約 5 分のペレットを風乾します。
  6. 再 RNase フリーの水の最初のボリュームでペレットを中断します。
  7. 260 吸光光度測定を行う RNA 濃度を決定するための nm。通常、サンプルの損失は最小限です。

7. RT qPCR と mRNA の分布のデータ解析

  1. 10.2 μ L の水、SYBR グリーンの 20 μ L、遺伝子特異的プライマー (2.5 μ M の各セット) の 4.8 μ L、5 μ L の cDNA を組み合わせて、よく混ぜ、384 ウェル プレートにトリプリケートの井戸あたり 10 μ L を読み込みます。
  2. 粘着フィルムでプレートをしっかりとカバーし、5 分 1,800 x g でプレートを遠心分離機します。
  3. リアルタイム PCR 装置を用いて qPCR 反応表 1に示すように条件を設定します。
  4. 値と比較 CT (ΔΔCT) 法31は説明32変更の 1 つとして prepolysomes、ライトおよび重いポリソームで mRNA の分布の割合 (%) を計算サイクルしきい値 (CT) を使用します。RT qPCR データ解析におけるデータの正規化合成 RNA (OmpA ここ) を使用します。合成 RNA は、相対的な Mrna レベルを計算し、グラデーションの異なる分数でそれらを比較することができます正規化コントロールを提供します。

8. 西部にしみが付くことによって Polysomal 分画におけるタンパク質の解析

  1. 株式 100% (w/v) から最終濃度 10% を選択した画分 (500 μ L) にトリクロロ酢酸 (TCA) を追加、少なくとも 15 分間、5 分間遠心する、および microfuge の氷の上を保つ、上澄みを廃棄、氷冷アセトンで 2 回洗浄、S の 25 μ L に溶解電気泳動用 DS ページ サンプル読み込みバッファー。
  2. SDS ページの読み込み、次の転送 PVDF 膜に標準的な電気泳動を行います。ウエスタンブロット33に進みます。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

この研究では、3 つの異なるソースの polysomal のプロファイリング技術の応用について述べる: 寄生リーシュ マニア原虫、培養ひと細胞およびマウス精巣。リーシュ マニア原虫の細胞は自由に懸濁液中の液体媒体の成長、ひと培養細胞はプレートに付着性単分子膜の成長し、マウス精巣組織サンプルを表します。メソッドは、懸濁液、組織、または別の有機体からさまざまな種類および培養細胞の種類で自由に成長した細胞の他のタイプを簡単に調整できます。アプローチは、4 つの主要な手順で構成されています: ライセート調製、サッカロースの勾配の準備と遠心手順、ポリソーム分別およびサンプル コレクション画分の分析が続きます。さまざまなソースからの細胞は、収集および洗浄針や Dounce ホモジナイザーを通過に換散バッファーの分離します。遠心分離、ライセートを明らかに細胞の残骸を削除する使用されます。勾配分画法の方式は、図 1 aに表示されます。連続ショ糖密度勾配は、勾配メーカーで 10% と 50% の...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

ショ糖密度勾配によるポリソーム分別が RNA と結合し、タンパク質画分の分析は個々 の mRNAs または全体 translatome の並進状態だけでなく、並進を規定する蛋白質の要因の役割を分析するための強力な方法通常の生理や病気の状態の間に機械。Polysomal プロファイリングリーシュ マニア転写制御は主として不在、遺伝子発現制御が主に発生しますを含む trypanosomatids などの生物の翻訳制御の研究に特に適している手法は、します。中に翻訳します。

ここでは、3 つのモデルで使用されるポリソーム分別のプロトコルについて述べる:リーシュ マニア寄生虫、ひと培養細胞およびマウス組織。ポリソーム分別手順は本質的にこの試験で使用される異なった有機体のための同じただし、lysate の準備いくつかの違いがあります。リーシュ マニア原虫の細胞液体文化で育つし、セルがカウントされますように溶解前にグラデーションの読み込みと同じ遠心分離によって収集されます。人間の細胞を洗浄し、直接板の上に分離できます。等しい荷重は、光学濃度に...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者はチン ・ リーのオーディオ録音との助けをありがちましょう。テキサス工科大学医療科学センターからスタートアップ資金によって支えられたし、神経科学研究と治療 (CTNT) のための卓越性のセンター A.L.K.; に PN CTNT 2017-05 AKHRJDHW を与える研究NIH グラントによって部分的に K.Z. ジェームス c. ハフマンとクリステン ・ r ・ デバカ R01AI099380 CISER (幹統合教育研究センター) 学者、プログラムによってサポートされていました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Instruments:
グラジBiocomp Instruments Inc.108
ピストングラジエント分留装置Biocomp Instruments Inc.152
フラクションコレクターGilson, Inc.FC203B
NanoDrop OneThermo ScientificNanoDrop One
ニコン倒立顕微鏡ニコンECLIPSE Ts2-FL/TS2
2720 サーマルサイクラーライフサイエンス社 Applied Biosystems by Life Technologies4359659
CO2インキュベーターパナソニック ヘルスケア株式会社MCO-170A1CUV
HERATHERMインキュベーターThermo Scientific51028063
Biological Safety Cabinet, class II, type A2NuAire Inc.NU-543-400
Revco 冷凍庫Revco TechnologiesULT1386-5-D35
ベックマン L8-M Ultracentifugeベックマン・コールターL8M-70
遠心分離機エッペンドルフ5810R
遠心分離エッペンドルフ5424
超遠心分離機 ローター SW41ベックマン・コールター331362
スイングバケットローターエッペンドルフA-4-62
固定角ローターエッペンドルフF-45-30-11
クオンツスタジオ 12K Flex リアルタイムPCRマシン 285880228Applied Biosystems by life technologies4470661
TC20 自動セルカウンターバイオ・ラッド145-0102
血球計算盤ハウサー・サイエンティフィック02-671-51B
ソフトウェア 
トライアックスソフトウェア バイオコンプインスツルメンツ株式会社
材料:
計数スライド、細胞カウンター用デュアルチャンバーBio-Rad145-0011
1.5 mL 微量遠心チューブUSA Scientific1615-5500
オープントップポリクリア遠心チューブ、(14 mm x 89 mm)Seton Scientific7030
シリンジ、5 mLBD
BD シリンジ 3 mL23 ゲージ 1 インチ ニードルBD10020439
Nunclon Delta 定盤、14 cmThermo Scientific168381
Nunclon Delta 定盤、9 cmThermo Scientific172931
Nalgene 急流 90 mm フィルターユニット、500 mL、0.2 aPESThermo Scientific569-0020
BioLite 75 cm3 フラスコThermo Scientific130193
Nunc 50 mL 円錐形遠心分離管Thermo Scientific339653
Chemicals:
Trizol LSAmbion by Life Technologies10296028
HEPESFisher ScientificBP310-500
Trizma baseSigmaT1378-5KG
ダルベッコ修正イーグルの中高グルコース (DMEM)シグマD6429-500ML
ウシ胎児血清 (FBS)シグマF0926-50ML
ペニシリン-ストレプトマイシン (P/S)シグマP0781-100ML
リポフェクタミン 2000Invitrogen11668-019
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)SigmaD8537-500ML
塩化マグネシウム六水和物 (MgCl2x6H2O)Acros OrganicsAC413415000
塩化カリウム (KCl)SigmaP9541-500G
Nonidet P 40 (NP-40)Fluka (Sigma-Aldrich)74385
組換えルナシンリボヌクレアーゼ阻害剤PromegaN2511
ヘパリンナトリウム塩Sigma H3993-1MU
cOmplete Mini EDTAフリープロテアーゼ阻害剤ロシュ・ダイアグノスティック
グリコーゲンThermo ScientificR0551
ウォーターシグマW4502-1L
シクロヘキシミドSigmaC7698-1G
クロロホルム フィッシャー サイエンティフィック 194002
ジチオトレイトール(DTT)フィッシャーサイエンティフィBP172-5
チジウムブロマイッシャーサイエンティフィBP-1302-10
チレンジアミン四酢酸二ナトリウム脱水(EDTA)フィッシャーサイエンティフィックS316-212
ティメムライフテクノロジーズ22600050
プロマイシン二塩酸塩シグマP8833-100MG
スクロースフィッシャーサイエンティフィックS5-3KG
トリプシン-EDTA溶液シグマT4049-100MLhgh
容量cDNA逆転写酵素キットライフサイエンス技術による応用バイオシステム4368814
パワーSYBRグリーンPCRマスターミックスライフサイエンス応用バイオシステム4367659 HCl
Fisher ScientificA144SI-212
イソプロパノールフィッシャー サイエンティフィックBP26324
水酸化カリウム (KOH)シグマ221473-500G
抗 RPL11 抗体アブカムab79352
リボソームタンパク質 S6 (C-8) 抗体サンタクルーズ バイオテクノロジー インクsc-74459
1xM199SigmaM0393-10X1L
塩化リチウムΣL-9650
ジメチルスルホキシド (DMSO)Fisher ScientificD128-500
ゲルローディングバッファー IIThermo ScientificAM8546G
UltraPure AgaroseThermo Scientific16500-100
トリクロロ酢酸 (TCA)フィッシャーサイエンティフィックA322-100
スーパーシグナル ウェストピコ PLUS 化学発光基質サーモサイエンティフィック34580
ホルムアルデヒドフィッシャーサイエンティフィBP531-500
ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)シグマL5750-1KG
フッ化フェニルメチルスルホニル (PMSF)シグマP7626-5G
RNeasy ミニキットQiagen74104
アデノシン 5&プライム;-三リン酸二ナトリウム塩水和物 (ATP)シグマA1852-1VL
シトシン 5'-三リン酸二ナトリウム塩水和物 (CTP)シグマC1506-250MG
ウリジン 5'-三リン酸三ナトリウム塩水和物 (UTP)シグマU6625-100MG
グアノシン5'-三リン酸ナトリウム塩水和物(GTP)ΣG8877-250MG
SP6 RNAポリメラーゼNEBM0207S
ピロホシャターゼΣI1643-500UN
スペルミジンΣS0266-1G
エントマスター 機 309646ス 11836170001ックエドフィックエオプによるック

参考文献

  1. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  2. Capewell, P., et al. Regulation of Trypanosoma brucei Total and Polysomal mRNA during Development within Its Mammalian Host. PLoS One. 8 (6), e67069(2013).
  3. Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. A multiple ribosomal structure in protein synthesis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 49, 122-129 (1963).
  4. Piccirillo, C. A., Bjur, E., Topisirovic, I., Sonenberg, N., Larsson, O. Translational control of immune responses: from transcripts to translatomes. Nature Immunology. 15 (6), 503-511 (2014).
  5. Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
  6. Masek, T., Valasek, L., Pospisek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
  7. Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
  8. Zuccotti, P., Modelska, A. Studying the Translatome with Polysome Profiling. Methods in Molecular Biology. 1358, 59-69 (2016).
  9. Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), e15(2017).
  10. Arava, Y., et al. Genome-wide analysis of mRNA translation profiles in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 100 (7), 3889-3894 (2003).
  11. Gandin, V., et al. nanoCAGE reveals 5' UTR features that define specific modes of translation of functionally related MTOR-sensitive mRNAs. Genome Research. 26 (5), 636-648 (2016).
  12. Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish. Science. 336 (6078), 233-237 (2012).
  13. Zanchin, N. I., Goldfarb, D. S. Nip7p interacts with Nop8p, an essential nucleolar protein required for 60S ribosome biogenesis, and the exosome subunit Rrp43p. Molecular Cell Biology. 19 (2), 1518-1525 (1999).
  14. Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
  15. Gkogkas, C. G., et al. Autism-related deficits via dysregulated eIF4E-dependent translational control. Nature. 493 (7432), 371-377 (2013).
  16. Robichaud, N., Sonenberg, N. Translational control and the cancer cell response to stress. Curr Opin Cell Biol. 45, 102-109 (2017).
  17. Gordon, B. S., Kelleher, A. R., Kimball, S. R. Regulation of muscle protein synthesis and the effects of catabolic states. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 45 (10), 2147-2157 (2013).
  18. Ishimura, R., et al. RNA function. Ribosome stalling induced by mutation of a CNS-specific tRNA causes neurodegeneration. Science. 345 (6195), 455-459 (2014).
  19. Petersen, C. P., Bordeleau, M. E., Pelletier, J., Sharp, P. A. Short RNAs repress translation after initiation in mammalian cells. Molecular Cell. 21 (4), 533-542 (2006).
  20. Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 111 (1), E203-E212 (2014).
  21. Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 14 (11), R128(2013).
  22. De Gaudenzi, J. G., Noe, G., Campo, V. A., Frasch, A. C., Cassola, A. Gene expression regulation in trypanosomatids. Essays in Biochemistry. 51, 31-46 (2011).
  23. Alves, L. R., Goldenberg, S. RNA-binding proteins related to stress response and differentiation in protozoa. World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 78-87 (2016).
  24. De Pablos, L. M., Ferreira, T. R., Walrad, P. B. Developmental differentiation in Leishmania lifecycle progression: post-transcriptional control conducts the orchestra. Current Opinions in Microbiology. 34, 82-89 (2016).
  25. Soto, M., et al. Cell-cycle-dependent translation of histone mRNAs is the key control point for regulation of histone biosynthesis in Leishmania infantum. Biochemical Journal. 379, 617-625 (2004).
  26. McNicoll, F., et al. Distinct 3 '-untranslated region elements regulate stage-specific mRNA accumulation and translation in Leishmania. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35238-35246 (2005).
  27. Folgueira, C., et al. The translational efficiencies of the two Leishmania infantum HSP70 mRNAs, differing in their 3 '-untranslated regions, are affected by shifts in the temperature of growth through different mechanisms. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35172-35183 (2005).
  28. Dumas, C., Chow, C., Muller, M., Papadopoulou, B. A novel class of developmentally regulated noncoding RNAs in Leishmania. Eukaryotic Cell. 5 (12), 2033-2046 (2006).
  29. Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression. Molecular Cell Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).
  30. Karamyshev, A. L., Johnson, A. E. Selective SecA association with signal sequences in ribosome-bound nascent chains: a potential role for SecA in ribosome targeting to the bacterial membrane. Journal of Biological Chemistry. 280 (45), 37930-37940 (2005).
  31. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  32. Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Polysome Fractionation to Analyze mRNA Distribution Profiles. Bio Protocols. 7 (3), (2017).
  33. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  34. Patrick, A. E., Karamyshev, A. L., Millen, L., Thomas, P. J. Alteration of CFTR transmembrane span integration by disease-causing mutations. Molecular Biology of the Cell. 22 (23), 4461-4471 (2011).
  35. Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
  36. van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO Journal. 33 (3), 265-276 (2014).
  37. Morita, M., et al. mTOR Controls Mitochondrial Dynamics and Cell Survival via MTFP1. Molecular Cell. 67 (6), 922-935 (2017).
  38. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

ショ糖密度勾配超遠心分離溶解液調製フラクション回収RNA解析ウェスタンブロットリボソーム結合翻訳制御モデル生物
リーシュ マニア、ひと細胞およびマウス精巣におけるプロファイリングをポリソーム
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。