複雑な人間の病気に貢献する遺伝的変異の同定機構を識別することができます。ここでは、候補者の遺伝子または遺伝子パスウェイ解析低コストでカバレッジを最大化、コホートに基づく研究に従う方法多重遺伝子型を示します。
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この記事について
サマリー
要約
複雑な病気の多くの場合疾患感受性に貢献する複数の一般的な遺伝子変異によって支えられています。ここでは、ジェノタイピング マルチプレックス アッセイ質量分析法を用いた臨床コホートで遺伝子経路の連合を調査するコスト効果の高いタグ単一ヌクレオチド多型 (SNP) アプローチについて述べる。例として食品アレルギー候補遺伝子座Interleukin13 (IL13) を調べた。このメソッドは、領域内の共有連鎖不平衡 (LD) を利用して効率的にカバレッジを最大化します。選択した LD SNPs、設計されています多重アッセイに同時に分析するまで 40 の異なる Snp の有効化費用対効果を高めます。ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) は単一のヌクレオチドの拡張子、ターゲット遺伝子を増幅するため使用され、amplicons マトリックス支援レーザー脱離/イオン化-時間 flight(MALDI-TOF) 質量分析装置を使用して測定されます。Raw 出力を厳格な品質管理の定義と切り取りトレードオフを使用してソフトウェアを呼び出す遺伝子で解析、確率が高い遺伝子型の決定しデータ分析のための出力します。
概要
人間の複雑な疾患の遺伝的変異が疾患感受性に貢献、これらの亜種の定量化は理解病因、治療レスポンダーの高リスク患者のグループを識別するために有用かもしれない。確かに、精密医療の約束は患者サブグループ1を識別するためにゲノム情報を利用したに依存しています。残念ながら、どこ疾患表現型の相当な遺伝的多様性、低浸透度と変数表現力によって支えられている、複雑な病気の生物学領域内コホート サイズ ゲノム全体小説的なアプローチのための要件候補者は、しばしば膨大2です。また、標的候補遺伝子アプローチから始まる疾患病因3に固有の遺伝子/経路について事前の仮説。経路解析ツールは、探検するために多数の候補経路を生成する標的遺伝子座の病態生理学を調査するため使用されます。ここで人間のコホート研究4に適した 1 つの試金と Snp の数百人に数十の調査を可能にする多重遺伝子型アプローチを紹介します。このアプローチは比較的高スループット、数百、数千の新規探索研究誘因する DNA サンプルや特定経路の調査を許可します。ここで説明する方法は、比較的迅速かつ安価な方法で識別リスク対立遺伝子および臨床特徴との関連付けに役立ちます。このプラットフォームは、微生物感染症7ひと乳頭腫ウイルス
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プロトコル
ここで使用される遺伝物質倫理的によって承認された使用するためオフィス子供 HREC (人間研究倫理委員会) (CDF/07/492)、人間サービス HREC 部の (10/07) と王立子供病院 (RCH) HREC (27047)。
1. 設計多重アッセイ
- 試金のデザインの SNP リストを準備します。
- Haploview (https://www.broadinstitute.org/haploview/downloads) のタガー機能にターゲット領域を入力します。必要なバリエーションの数が少ない目的の地域の完全なカバレッジを提供する SNPs のリストを生成するターゲット地域にまたがる SNPs 間 LD (相関, r2) を使用します。など、キャプチャするすべての対立遺伝子がユーザー定義のしきい値を超える関連 SNPs のリストを生成 (e.g。、r2 ≥0.8)。
- フォワード、リバース、および拡張子のプライマーに適したシーケンスの同定
- 選択の分析設計ツールに SNPs の生成するリストを入力します。
注: 次の手順は、材料のテーブルで指定されている、代表的な結果を生成するために使用アッセイ デザイン ツールに適用されます。 - 分析設計ツールを起動する....
- 選択の分析設計ツールに SNPs の生成するリストを入力します。
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結果
上記プロトコルを使用我々 は誤は食品アレルギーの場合とコントロール9のコホートにおける Th2 免疫遺伝子IL13の SNPs をタグ付け。関心領域内の遺伝的変異が食品アレルギー リスクを増加させるかどうかをテストするのには、祖先とその他の潜在的な共変量調整後のロジスティック回帰分析を行った。テーブル 109は、1 つのバリアント rs1295686 チャレンジで実績のある食物アレルギーに関連付けられていることを示し同じを使用してレプリケーション コホートにおけるこの協会多重遺伝子型アプローチを確認しました。2 つのコホートから結果のメタ分析は、FA (表 11)9 IL13の協会の強力な証拠を提供されています。我々 は遺伝子と推測、祖先有益な SNP マーカー パネルを使用して公開されたパネル
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ディスカッション
ここでは、質量分析法による多重遺伝子型解析法を示します。代表的な結果は、MALDI-TOF 質量分析法4分析化学と材料表13に掲げると共に PCR を使用して生成されました。このプラットフォームでは、合計 40 時間以内 9 SNPs の 1,255 個人 11,295 遺伝子型をラボで生成されます。
生成し、食物アレルギーと独立した複製 phenotyped 探索臨床コホート研究における候補遺伝子IL13の SNP データの分析によって遺伝的仮説に答える手法の有用性を示す.プラットフォームは DNA の品質を下げるため比較的堅牢で、最小限の出発原料、唯一 10 の入力を必要とする ng。プロトコルで重要な手順次のとおりです: 最大多重アッセイに SNP 含める対象地域の成功したシングル PCR 増幅器の増幅成功を確保するためのアッセイ デザイン プロセスのトラブルシューティングの注意ヌクレオチド拡張子拡張反応と質量スペクトル データを.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
著者の謝辞があります。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ゲノムDNA | - | - | 1 μ5〜10ng/&muの濃度のLL |
| プライマー:フォワードおよびリバース増幅および伸長 | IDT | - | プライマーの設計に関する原稿セクション1.2.1を参照 |
| 脱イオン水 | 例:ミリQ水 | - | 18.2 MΩで脱イオン化。cm 抵抗率 |
| ジェノタイピング試薬キット iPLEX Gold Chemistry 試薬セット | Agena Bioscience | #10148-2 | には、2.2.1、2.3.1、2.4.2、チップおよび樹脂 |
| PCRプレート(384ウェル) | Abgene | #ABGAB-1384 | AbgeneのMassARRAYシステムプレートには、互換性のある |
| マイクロピペットの | シングルおよび8チャンネル | ||
| 遠心分離機があります | 384ウェルプレートに対応 | ||
| 2.2.4、2.3.2、2.4.3に詳述されているPCRプログラムに対応した | サーモサイクラー | ||
| ディンプル樹脂プレート | Agena Bioscience | 6mg, 384-well | |
| プレートローテーター | |||
| MassARRAY Analyzer 4 System | Agena Biosciences | MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight) 質量分析計。 | |
| RS1000 ナノディスペンサー | Agena Biosciences | ||
| Assay Design Suite | Agena Biosciences | マルチプレックスジェノタイピングアッセイの設計に使用されるツール | |
| Hot Start Taq | DNAポリメラーゼ酵素 | ||
| 樹脂 | Agena Biosciences | iPLEXキット付属 |
参考文献
- Aronson, S. J., Rehm, H. L. Building the foundation for genomics in precision medicine. Nature. 526 (7573), 336-342 (2015).
- Ball, R. D. Designing a GWAS: power, sample size, and data structure. Genome-Wide Association Studies and Genomic Prediction....
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再版と許可
