このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

レンチ ウイルス媒介トランスジェニック マウスの生産: シンプルで高効率な創設者の直接の研究法

9.3K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/57609

⸱

2018年10月7日

 ,  ,  , 
1UPMC Univ Paris 06, INSERM U1127, CNRS UMR 7225, Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, ICM, Sorbonne Universités, 2UPMC Univ Paris 06, INSERM UMRS1166, Institute of Cardiometabolism and Nutrition, Sorbonne Universités

この記事について

サマリー

ここでは、受精卵母細胞の囲卵腔のレンチウイルスベクターの単純な注射によって transgene の統合および創設者トランスジェニック マウスに高効率の生産を促進するためにプロトコルを提案する.

要約

ほぼ 40 年間は、前核 DNA 注入はトランスジェニック マウスに遺伝子のランダムな統合を生成する標準的な方法を表します。このようなルーチンの手順が世界中で広く利用されて、transgene の統合の創設者動物の低収量の結果の悪い効果の主な制限が存在します。注入された受精卵の着床後に生まれた動物の数パーセントしか遺伝子を統合しています。対照的に、レンチウイルスベクターは統合的な遺伝子導入のための強力なツールをヘッジホッグ受精卵の使用により、創設者の高効率生産 70% 以上の平均収量を持つトランスジェニック マウス。さらに、遺伝子組換え動物を生成する任意のマウスの緊張を使用ことができますおよび遺伝子発現の浸透度がきわめて高く、DNA マイクロインジェクションに比べてレンチウイルスベクターを介した遺伝子導入で 80% 以上。レンチウイルスベクターによって貨物をすることができます DNA のフラグメントのサイズは 10 kb に制限されている、このメソッドの主要な制限を表します。シンプルで簡単に受精卵の透明帯の下に注入の手順を実行を使用して、50 以上の創設者動物はマイクロインジェクションの単一のセッションで生成できます。このようなメソッドは、創設者動物、急速な利得と損失関数学または画面ゲノム DNA 領域の制御および遺伝子発現生体内で調整する機能のために直接実行する高い適応です。

概要

1980 年にゴードンらの先駆的な仕事を示した偽妊娠マウスに着床した受精卵前核の男性のにプラスミド DNA 注入は統合トランスジェニック動物の生産をもたらすことができる、プラスミド DNA の1。トランスジェニック哺乳類が生成されることを実証では、両方の基礎科学と医療薬学研究の新規分野への道を開く、ライフ サイエンスの世界に大きな影響を与えた。過去 4 年の間、DNA マイクロインジェクション ルーチンの練習となっています。トランスジェニック マウスの膨大な数が生産されている、標準的な方法すべてのマウス系統の完全に使用可能ではないと時間のかかる戻交配2,3が必要です。他の種への応用のまま挑戦4全体の transgene の統合収量生まれた動物5の数の割合に制限されます。また、transgene の統合の効果は、前核 DNA インジェクションの貧しい全体的な利回りを説明する制限要因を表します。この点で、統合ウイルスベクター貨物に最も効率的なツールし遺伝子を統合し、こうして大幅統合収穫、遺伝子サイズ 10 kb6 を超えることのできないという唯一の制限を増加する新しい手段を提供できます。.

レンチウイルスベクター擬似エンベロープ蛋白の水疱性口内炎ウイルス (VSV) 型指定された pantropic および高度統合遺伝子伝達ツール、受精卵7を変換する使用ことができます。卵子の周囲の透明帯自然ウイルス障害とレンチ ウイルスのベクトルを伝達できるように渡される必要があります。トランスジェニック動物はマイクロ ドリルや透明帯8,9の削除後変換受精卵母細胞によって生成されています。ただし、囲卵腔に透明帯の下に注入はロイスと同僚の7で最初に定義されている受精卵を変換する最も簡単な方法のように見えます。

レンチウイルスベクターの囲卵腔注入では、生まれた動物の 70% 以上は、トランスジェニック動物の生産に高収率をことができます。このような利回りは標準的な前核DNA 注入7,10,11を使用して達成することができます最高の収量より 10 倍以上高い。この文脈では、注射の 1 つのセッションは少なくとも 50 トランスジェニック創設者 (F0) を生成します。創設者の多数は、したがって、トランスジェニック マウスの行を生成することがなく F0 マウスに対して直接遺伝子効果の表現と互換性があります。この利点は transgene 効果の迅速なスクリーニングを可能、週間以内に体内の利得と損失関数の研究を実行に特化。また、エンハンサーと転写因子11,12によってバインドされている DNA モチーフをマップする調節 DNA 配列することができます急速に上映されるも。前核の注射で遺伝子は通常ユニークな軌跡の複数コピーを統合します。レンチ ウイルスのベクトル統合は軌跡10,13あたり単一コピーとして多遺伝子座で発生します。したがって、統合遺伝子座の多様性より堅牢な新しい生成モデルを作るトランスジェニック創設者にみられる非常に高い式浸透に関連付けられている可能性が最も高いです。

重要なは、DNA の前核の注入を使用して、プロシージャの間に前核の可視化は絶対に必要があります。この技術的な制限は、多種多様なマウス系統から受精卵の使用を防止します。したがって、特定のトランスジェニック モデルの生産目的のマウスの遺伝子を転送する少なくとも 10 連続戻交配続いて寛容ひずみにおける動物の生産を要求するどの前核が表示されないためにのひずみひずみ。レンチウイルスベクター注射囲卵腔が表示常に、注射は非常に特定のスキルを必要はありません。例として、前核注入に適さない NOD/SCID トランスジェニック マウス ウイルスベクター注射14得られています。

ここでは、包括的なプロトコルが 1 つのセル段階の胚の囲卵腔注射レンチウイルスベクターを用いた遺伝子改変マウスの簡単な生産を許可するように表示されます。遺伝子発現のいずれかで制御ユビキタスまたはセル特定のプロモーターで詳しく説明します。

PTrip ΔU3 レンチ ウイルスのバックボーンは、この研究は15で使用されました。このベクター U3 シーケンスを U3 プロモーター活性を外し、自己不活化ベクトル (罪)16を生成する部分的に削除されているレプリケーション欠陥レンチウイルスベクターを作り出すことができます。P8.91 カプセル化プラスミド (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6、水胞性口炎ウイルス (VSV) 糖 G17、および pTRIP ΔU3 のエンコーディング pHCMV G と HEK 293 t 細胞のトランスフェクションによって生産されたレンチウイルスベクター株式組換えのベクトル。詳細な運用手順は、補足的なメソッドとして提供されます。

高価レンチウイルスベクターの在庫の生産、バイオ セーフティ レベル II 条件 (BSL-2) の下で実行されます。これは BSL 3 で生産されなければならない遺伝子を除いてほとんど transgenes に当てはまります。したがって、ほとんどの場合のための BSL 2 条件での生産は十分です。さらに、使用と生産は、遺伝子組み換え作物 (GMO) を扱うほとんどの国の規制当局の切断されます通常。(P24 キャプシド蛋白質の 2 μ g) の下に複製無能な罪レンチウイルスベクターの限られた量は、欧州連合推奨事項に従ってフランス GMO 代理店によって前述の BSL 1 条件下で使用できます。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

動物の仕事を含むすべての手順は、倫理的な承認を受けたし、フランス研究番号 APAFIS #5094 20 16032916219274 v6 の下教育省と 05311.02 によって承認されています。PHENOPARC は、フランス農水省認定番号 B75 の下で認定されている ICM 動物施設 13 19。総合的なプロトコルでは、図1 にまとめられている正確な時間枠内で各手順を実行する必要があります。

1. 動物の購入および基本的な化合物の合成

  1. 動物の購入
    1. 25 精管男性 B6CBAF1/JRj は 8 週齢 (♀C57Bl/6JRj、♂CBA/JRj の間元から F1 世代を越える) を注文します。
      注: は、到着時に男性を分離します。男性の精管は少なくとも 1 年間再利用できます。
      ケージを 3 週間ごとに変更します。
    2. 10 週齢は、少なくとも 50 の動物のプールを保持する 50 の B6CBAF1/JRj 女性を注文します。
    3. 8 週齢は、10-15 C57BL/6JRj の肥沃な男性を注文します。
    4. 4 週齢は、30 の C57BL/6JRj 女性を注文します。
  2. 麻酔および安楽死
    1. 300μL ケタミン ・ キシラジン ミックス、腹腔内注入量を用いて麻酔 (150μg/g 体重、0.15μg の用量でキシラジンの用量でケタミン g 本体重量/)。動物は、体の温度を調整するパッドを加熱下で配置されます。手順を開始する前に、動物の尻尾をつまんで反射神経をチェックします。
    2. 安楽死は、頚部転位によって行われました。斬首は、動物の死を確認する第 2 の方法として含まれていた。胚の安楽死は、斬首によって行われました。
      注意: 到着時に許可動物施設 (処理や交尾) に習慣になって 1 週間以上。重要なは、遺伝子組換えの行を含む任意のマウス系統は、肥沃な男性と排卵の肥沃な女性として利用できます。ひずみの選択は、科学的な質問の要件によるとすべきであります。
  3. ホルモン製剤
    1. 1 凍結乾燥 PMSG バイアルに PSMG (妊娠馬血清ゴナドトロピン) バッファーの 910 μ L を追加、100 μ 因数を作る、-20 ° C で保存
      注: 各因数には 11 マウス用 55 UI が含まれています。最初の使用後 2 週間以上、PMSG 因数を決してしてください。
    2. 2730 μ L 1 hCG (ひと絨毛性ゴナドトロピン) バッファーの凍結乾燥バイアル hCG を追加します。100 μ 因数をし、-20 ° C で保存
      注: 各因数には 11 マウス用 55 UI が含まれています。
  4. ヒアルロニダーゼ準備
    1. ヒアルロニダーゼの M2 10 mg/mL の原液を入手し、50 μ 因数を中長期の 3 ml のバイアル 1 を再構築します。その後、-20 ° C で保存します。
  5. 手術ツール準備
    1. オートクレーブを使用してすべての手術ツールを滅菌します。

2. 女性ドナーの排卵

  1. 12 h を使用して動物施設におけるデイ - 夜サイクル 14-3 日で PMSG を注入します。HCG 注射の直後に日-1 とチームメイトの午前 12 肥沃な男性で hCG を挿入します。
  2. PMSG の 100 μ L の 1 因数に無菌の 0.9 %nacl 溶液の 1 mL を追加-3 日 (55 UI)。腹腔内任意のデッド ボリュームがない注射器を使用して 100 μ L で C57BL/6JRj 女性 10 名を挿入します。
    注: 各マウス PMSG の 5 の UI が表示されます。
  3. -1 日に hCG の 100 μ L の 1 因数に無菌の 0.9 %nacl 溶液の 1 mL を追加 (55 UI)。腹腔薄めた hCG (5UI) の 100 μ L で PMSG 注射を受けたマウスを挿入します。任意のデッド ボリュームがない注射器を使用します。ゆっくりと注入を実行し、液体が漏洩しないように、針を削除する前に待機します。
    注: 各マウス hCG の 5 の UI が表示されます。HCG の注射は PMSG 後 46 h を行わなければなりません。
  4. HCG 注射後直接スタッド オスのケージに各 C57BL/6JRj の女性を配置します。
  5. 0 日目の朝に膣にプラグを確認し、受精卵を収集するために肯定的な女性を使ってください。

3. B6CBAF1/jRj 偽妊娠女性の準備します。

  1. 採卵 (日-1) 2 B6CBAF1/JRj 女性と 17 で前日精管男性を仲間します。
    注: 女性のサイクルの同期を回避する別のケージから起きている女性でメイトに非常に重要です。これは膣にプラグを得る収量を高めます。さらに、過去 2 日以内に変更されているオスのケージにメスを追加しません。ケージが汚い場合、雄の繁殖行動の有効性が高い。

4. 受精卵コレクション

  1. 準備
    1. 1450 μ M2 をヒアルロニダーゼ作業ソリューションを準備するヒアルロニダーゼ原液に追加します。
    2. 100 mm シャーレで受精卵を生産し、室温で維持するために使用女性あたりヒアルロニダーゼ実用的なソリューションの 100 μ L の一滴を配置します。
    3. 4 井戸のプレートに M16 の 500 μ L を追加します。2 井戸注入するレンチウイルスベクターの種類ごとを使用: 1 つも挿入された卵とその他が含まれます非注入されたもの。5% CO2の大気中の 37 ° C の定温器に 4 のウェル プレートを配置します。
  2. 胚の採取及び取扱のピペットを準備します。
    1. 炎の硬質ガラス キャピラリー チューブの中心を回転させることによりガラス ヘマトクリット管 (75 mm/60 μ L) を柔らかきます。
    2. 可能であり、管の約 300 μ m プルきちんと休憩を取得する冷却管の内部の直径を取得するプルとしてすぐに熱から毛細血管を削除します。
  3. 卵管を収集します。
    1. 0 日 9 で頚部転位による C57BL/6JRj 女性を安楽死させます。死は、斬首によって確認されます。
      注: この安楽死法、IACUC によって承認された、欧州の推奨事項に従います。
    2. 大きな水平切開をハサミで腹腔内を開くを実行します。卵管は子宮と卵巣の間に位置します。
    3. Mesometrium とカーブタイプ鉗子で著名な血管を運ぶ膜を削除します。
    4. カーブタイプ鉗子で卵巣から卵管を区切ります。
    5. 曲線はさみを使用して卵巣から卵管をカットするのにガイドとしてカーブタイプ鉗子を使用します。
    6. 卵管を引き、子宮から曲線はさみでカットします。
      注意: は、受精卵が含まれて腫れた乳頭を触れないでください。滅菌器具を使用して全体の手順を実行します。
    7. M2 培地 (35 mm ディッシュ) 室温で収集したすべての卵管を配置します。
    8. 同じ 100 μ L ヒアルロニダーゼ作業ソリューション (0.3 mg/mL) 中 2 卵管を配置します。
  4. 受精卵から卵丘細胞を削除します。
    1. 2 インスリンは注射器を使用して、顕微鏡の下で: ヒアルロニダーゼ作業ソリューションに卵管を保持するために最初の 1 つと 2 つ目、乳頭を引き裂くし、分散する受精卵。
    2. 卵を収集するために準備ガラス ピペットを取るし、チューブと 0.22 μ m のフィルターのすべての卵を吸引するマウスピースのマウントに接続します。すべての卵を収集し、連続通過で M2 媒体の 100 μ L の 6 滴、別に洗ってください。
    3. 場所は、M16 中 5% CO2の大気と加湿の 37 ° C の定温器に受精卵を洗浄しました。

5. 作るインジェクション ピペット

  1. 外径 1 mm の薄肉ガラス キャピラリー チューブ (長さ 10-15 cm) を使用して、水平方向のピペットの引き手に毛細血管をクランプします。
    注: 最も水平ピペット引き手、3 つのパラメーターことができます調整する: 熱量、加熱と引きの強さと時間遅延を引っ張るします。図 2 aで 1 つのような注入の pipets を取得するこれらのパラメーターを調整します。DNA マイクロインジェクションを日常的に実行しているユーザーは、標準の設定を使用して、暖房と引っ張ってピペット チップのグローバルの形状を変更する間の遅延を調整する」を参照してください。

6. ピペット持株を作る

  1. 注入のピペットを使用して、ホールディング ピペットを準備します。
  2. マイクロフォージに注入するピペットを取り付けます。80 を 100 μ m 径の先端の鋭利な対称を取得するマイクロフォージとピペットをカットします。マイクロフォージ鋭いヘッジなしの対称的なラウンド形状を得るために熱のヒントをポーランド語します。

7. レンチ ウイルス ベクターを含むインジェクション ピペットの準備

  1. 冷凍レンチ ウイルス株によくある破片をペレットに 2 分間、160 x g のレンチウイルスベクター懸濁液を遠心します。
  2. 上清を回復し、クラス II の安全キャビネットで新しい 0.5 mL の管にそれを転送します。
  3. 5 マイクロ ローダーを使用しての手順で説明されているインジェクション ピペットに 1 μ L の上清を転送します。
  4. 右のマイクロマニピュレーターの計測器ホルダーにインジェクション ピペットを設定します。ホールディング ピペットを左のマイクロマニピュレーターに接続します。
    注: のレンチウイルスベクターの伝達力価は、創始者生産の有効性に直接関連付けが。高効率のため (> 70%)、ウイルスのベクトルを使用して、100 の範囲の価と p24 キャプシド蛋白質/μ L の ng。価が 10 を超えるべき価伝達単位 (TU) で表す場合、9 TU/mL。レンチウイルスベクター株式は p8.91 試験管プラスミドと 293 t 細胞のトランスフェクションによって生成される必要があります pHCMV G、補足方法18で説明されているように水胞性口炎ウイルス (VSV) の糖蛋白質 G をエンコードします。

8. マイクロ射出成形

  1. 光パラフィン オイル (胚テスト) M2 中うつ病スライド カバーの中心の 8 μ L を分注蒸発を避けるために。
  2. 場所 20 卵にできるだけ分散した少なくともとしてドロップ。
    注意: 胚を沈殿させた場合は、泡を行いません。
  3. インジェクション ピペットの先端が開いていることを確認します。されていない場合は、ホールディング ピペットでインジェクション ピペットをタップします。
  4. 20 の噴射時間のガラスシリンジを設定 s。
    メモ: ウイルスの懸濁液の粘度は、囲卵腔にウイルスのベクトルの分散の明確に可視化できます。射出圧力は 20 内全体のスペースを埋めるために調整する必要があります, 10 ~ 100 の容積を表す噴射の s の Pl射出圧力が 600 hPa を超えない。
  5. 2 プロ核と、実体顕微鏡下でホールディング ピペットで 2 極体が含まれている 1 つの受精卵を吸引します。
  6. マイクロインジェクター 8.4、囲卵腔内に記載されている設定を使用して、卵を注入します。
    注意: は、インジェクション ピペットで細胞膜を触れないでください。
  7. 20 卵のバッチで利用可能なすべて受精卵を注入し、5% CO2の大気と加湿の 37 ° C の定温器に事前に加熱された M16 中すぐに注入された卵を配置します。
    注: は、胚の転送前に注入後 30 分以上の挿入された卵を孵化します。

9. B6CBAF1/JRj 偽妊娠の女性に胚を転送します。

  1. B6CBAF1/JRj パイプカット男性と B6CBAF1/JRj 雌を交尾後交尾プラグ 16 h を確認します。ちょうど卵のコレクションを開始する前にこれを行います。
  2. 注入された胚の注入のピペットを準備します。
    1. 前述の収集および処理 (手順 4.2) の胚の胚の注入のピペットを作る。長さで約 4-5 cm の狭い部分で約 150 μ m の内径とピペットを選択します。
      注: 先端は炎卵や卵管に損傷を減らすために研磨をする必要があります。
      1. ピペットの肩のすぐ上光パラフィン オイル (胚テスト) と入力します。
      2. 小さな気泡、M2 の中規模、および最終的に第 2 空気の泡を吸引します。
      3. 胚を胚と一緒に卵管に注入される媒体の容量を最小限に抑えるために互いの背後にある 1 つを作成します。
      4. 約 1 つの胚の幅の光パラフィン オイル (胚テスト) の非常に小さなドロップをロードすることによって終了します。
        注意: は、ピペットを処理しながら、優しくすること。
  3. 胚移植。
    1. すべての器具を滅菌します。
    2. 滅菌 0.9% 食塩のケタミンの体重 g あたり 150 μ g とキシラジンの体重 g あたり 0.15 μ g を含む 300 μ の腹腔内注入による女性を麻酔します。
    3. 動物の尻尾を鉗子でつまんで麻酔深度を確認し、subcutaneouly 0.1 mg/kg の前にプロシージャを開始 (ブプレノルフィン) 鎮痛剤を注入します。
    4. 最後の肋骨のレベルで脊髄に沿って背中の両側に 2 cm を剃る。
    5. 加熱パッドや滅菌フィールドでは、女性のマウスを置きます。マウス背面の中央に 2 cm × 2 cm のウィンドウをカットします。
    6. 皮膚の消毒液 (10% ポビドン ヨウ化) を適用し、はさみで 1 cm の横切開を作る卵巣 (オレンジ色) が体壁を介して表示されるまで皮膚を横方向にスライドします。
    7. 両眼手術顕微鏡下で高級ハサミで体壁卵巣のすぐ上に 5 mm の切開を確認します。
    8. 非外科的ブルドッグ留め具付き脂肪パッドをピックアップし、卵巣、卵管、子宮の上部を引き出します。
    9. 膨大部を視覚化し、膨大部に卵巣をリンクしている卵管セグメント上 vannas ハサミ、ヘミセクションを作る。
    10. 転送胚ピペットを紹介し、注入ピペットで最初の空気の泡で停止、膨大部に卵をお届けします。
    11. 2 回目の卵管に手順を繰り返します。
    12. 傷クリップで皮膚をクローズ アップ。
    13. 場所回復で動物の部屋 (39 ° C、30-60 分) まで完全に目を覚まし。
    14. 鎮痛剤注射 12 時間後、痛みや苦痛の兆候の場合 48 h を繰り返します。
    15. 手術後 7-10 日傷のクリップを取り外します。
    16. 注入後は 3 日おき、ウェイト カーブに従うことによって注入された女性の妊娠を確認してください。重要な体重増加は注入後 10 〜 12 日間を観察することができ、妊娠を示すものになります。
      注: ここでは今後すべての胚推定トランスジェニック創設者を表しています。これらの創設者の表現型は、すべての発達段階でまたはこれらのトランスジェニック動物の世代にリンクされた科学的な質問によると出生後に分析できます。

10. ジェノタイピング トランスジェニック創設者

  1. 10 ミリメートル pH 8; トリス塩酸を含む遺伝子型バッファーを準備します。5 ミリメートルの EDTA、pH 8.0 0.2 %sds (w/v)、50 mM NaCl。0.22 μ m のフィルターを通してジェノタイピング バッファーを殺菌し、数ヶ月常温で保存します。
  2. (胚) のために初期胚胚体外膜または 500 μ L に (生まれた動物) の尾の小さな作品ジェノタイピング バッファーをフィルター処理し、プロティナーゼ K の 15 μ L (20 mg/mL) を追加します。55 ° C で一晩インキュベートします。
  3. ライセート 5 分 15,000 × g で遠心し、PCR 反応の清 1 μ L を使用します。ライセートは、数ヶ月 4 ° C で格納することができます。
  4. 1 x PCR バッファー、1.5 mM MgCl2、各消化サンプルの 1 μ L、1 UI の Taq DNA ポリメラーゼ 0.2 μ M 各 PCR のプライマーの dNTPs の 200 μ M を含む 20 μ L 反応量の遺伝子断片の PCR 増幅を実行します。ネガティブ コントロールとして使用 1 μ H2o.肯定的な制御として遺伝子を含んでいるレンチウイルスベクター プラスミッドの DNA を使用します。
  5. EGFP の検出のためには、使用を説明します。
    eGFP 前方プライマー: 5' 3' GACCACATGAAGCAGCACGACTTCT
    eGFP 逆プライマー: 5' 3' TTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCT
  6. たちで PCR 増幅を実行: 94 ° c、60 ° C で 1 分 1 分の 35 サイクルに続いて 94 ° C で 4 分、72 ° c. で 2 分
  7. 図 2 bに示すように 300 bp eGFP PCR 製品を視覚化するために 2% の agarose のゲルの PCR の製品をロードします。
    注: 300 bp PCR バンドを示すすべての個人は eGFP 遺伝子を統合している、遺伝子組み換えとして見なすことができます。
  8. トランスジェニック動物の遺伝子発現を分析します。たとえば、実行組織として染色図 3と図 4に示す補足の方法で説明し、。
    注: 両方地球科学的問題に応じて適切な方法を使用して、遺伝子発現解析と表現型解析を実行する必要があります。

11. 遺伝子コピー数の定量

  1. 量的な PCR のための DNA のサンプルを準備します。
    1. 種の DNA 抽出 (gDNA) プロティナーゼ K ライセートから 10.3 の製造元の指示に従って商業キットを使用しての手順で取得します。
    2. 260 吸光光度法による gDNA を定量化する nm。
    3. 各 gDNA サンプル 10 ng/μ L の最終濃度を薄くしなさい。
    4. 各サンプルの準備 5 シリアル希薄 (1:5) で H2O 以下の濃度で 6 チューブを取得する: 10 ng/μ L、2 ng/μ L、0.4 ng/μ L、0.08 ng/μ L、0.016 ng/μ L、0.0032 ng/μ L
  2. 定量的 PCR (qPCR) 反応混合物を準備します。
    1. QPCR のプライマー ミックスを準備します。QPCR 用それぞれのプライマーのカップル、前方プライマー (100 μ M プライマー原液) を 10 μ l 添加、逆プライマー (100 μ M) の 10 μ L を追加し、80 μ H2o.
      注: eGFP を増幅、TCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCA 前方、逆 TTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCG のプライマーを使用します。Cdx2遺伝子は、qPCR (ゲノムごとの 2 つのコピー) のノーマライザーとして使用されます。Cdx2ノーマライザー GCCAGGGACTATTCAAACTACAGG 前方、逆 GACTTCGGTCAGTCCAGCTATCTT のプライマーを使用します。
    2. EGFP プライマー ミックスと Cdx2 プライマー ミックスの 2 qPCR ミックスを準備します。各 gDNA の重複 6 希釈液を増幅するための十分な qPCR ミックスを準備します。QPCR 反応 1 つにはには、3.8 μ H2O、x 反作用の組合せ蛍光緑 2 の 5 μ L とプライマー ミックスの 0.2 μ L が含まれています。
      注:、テストする各のトランスジェニック動物の 24 の qPCR 反応を行います。反応混合物は、384 よく qPCR 用に提供しています。
    3. それぞれの動物テスト、配布: Cdx2 qPCR ミックスの 9 μ L eGFP qPCR ミックス ・ 12 井戸 9 μ L と 12 の井戸。EGFP qPCR ミックスを含む 2 井戸と eGFP qPCR ミックスを含む 2 の井戸に各 gDNA 希釈の 1 μ L を追加します。
    4. 各 qPCR の 2 のまま井戸ミックスどの gDNA を H2O ネガティブ コントロールとして交換されました。
  3. QPCR マシンに 384 ウェル プレートを配置し、次の実行しているプロトコルを適用: 95 ° C、50 で 10 分サイクル、10 95 ° C および 60 ° C で 1 分で s
  4. データを分析します。各 gDNA をテストするには、Ct 値を合計 gDNA 量 (重複の 6 ポイント) のログの関数としてプロットします。最小二乗法で線形回帰を使用してカーブに合わせて、y 軸の切片に対応する Ct 値を推定します。Cdx2 基準 eGFP コピー数を計算する eGFP と正規化された Cdx2 の推定の Ct 値を使用 (2 のコピー) 標準的な 2ΔdCt法11を使用しています。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

トランスジェニック動物は、ここで提示されたプロトコルを使用して生成されました。代表の結果両方のユビキタスと細胞タイプ特定の遺伝子発現を示します。

導入遺伝子の発現

ユビキタスのプロモーターは、持続的かつ効率的な方法で遺伝子を表現する基本的な研究ツールです。このようなプロモーターは、小規模および大規模な動物の生体内での遺伝子導入細胞の in vitroトランスフェクションからアプリケーションの非常に大きい変化に使用されます。

レンチウイルスベクターは、サイトメガロ ウイルス (CMV) プロモーターまたは CAG 鶏アクチン プロモーターと CM...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

レンチウイルスベクターここで説明した受精卵母細胞の囲卵腔注入は、収集された胚の合計数を基準にして遺伝子胚の 70% 以上が得られた形質転換の胚の生産で起因しました。この結果、以前のレポートに一貫した手順2,7,10、11,12の特異性を例証します。表 1に示したすべてのデータを比較すると、重要な機能が強調表示できます。まず、注入された卵の数は、正常な形態を持っていたまたは文化で数時間後溶解しないすべての挿入された卵に対応しました。注入された卵の 93% は、レンチウイルスベクター囲卵腔内注入による急速な毒性のほぼ完全な欠如を示唆して移植されました。注入された卵の 44% だけ生き残ったし、移植されたので DNA 注入を考慮したとき、状況は劇的に異なるです。さらに、収集した胚移植卵に...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者はある利益相反を開示します。

謝辞

レンチ ウイルスのベクトル生産および動物それぞれ住宅での技術支援の原稿と iVector Phenoparc ICM コアの重要な読書、マガリ ・ デュモンとローランド メローニに感謝します。この作品は、Institut Hospitalo ユニヴェルシテール ・ デ ・神経科学 Translationnelles デによって支えられたパリ、Investissements d'Avenir ANR-10-IAIHU-06 IHU-A-ICM。広報協会・ デ ・ ラング ・ フランセーズのための資金を受け取った注ぐ流動デュ Diabète et des 病気 Métaboliques (ALFEDIAM) と共同 JDRF INSERM 付与/。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
PMSG 50UIシグマG4527
hCG 5000UIシグマCG5-1VL
NaClシグマ7982
100 mm ペトリ皿ダットシャー353003
4 ウェル ヌンク皿ダットシャー56469体外受精ディッシュ
M2 ミディアムシグマM7167
M16 ミディアムシグマM7292
0,22 &マイクロ;m シリンジフィルターダッシャー146611
ヒアルロニダーゼ 酵素 30mgシグマH4272マウス胚 テスト済み
インスリンセリン セリンジVWR613-3867テルモ Myjector
湾曲鉗子Moria2183
湾曲ハサミMoriaMC26
校正済みマイクロキャピラリーピペット用吸引器チューブアセンブリシグマA5177-5EA
ホウケイ酸ガラスキャピラリーハーバード製装置GC 100-10
横型マイクロピペットプーラー成重PN-30
マイクロフォージ重MF-900
倒立顕微鏡ニコントランスファーマン NK2 5188ホフマン変調コントラスト照明が必要
マイクロマニピュレーターエッペンドルフセルトラム エア
コントローラー 保持ピペットエッペンドルフフェムトジェット
鉱物油シグマM8410マウス胚テスト済み
マイクロインジェクターエッペンドルフフェムトジェットDNAまたはウイルスベクターの注入に使用できます
デュモン #5 鉗子モリアMC 40
バンナス マイクロハサミモリア9600
イソフルランセントラベットISO005ISO-VET 100%250ml
オクリゲルセントラベットOCR002
ビドンヨウデュアセントラベットVET001テジン120ml
ブプレノルフィンセントラベットBUP002プレケア0,3mg / ml 10ml
トリスHClシグマT5941ズマ塩酸塩
EDTASigmaE9884
SDSSigma436143
NaClSigmaS7653粉末
プロテイナーゼ KΣP2308 
oneTaq キットNEBM0480L
プライマーEurogentec
ストリップ 8 PCR チューブ4titude4ti-0781
96 ウェル サーマルサイクラーApplied Biosystems4375786Veriti
Genomic DNA ミニキットinvitrogenK1820-02
Nanodrop 2000Thermo ScientificND-2000C 
qPCR Master mixRoche4887352001SYBR Green 
マルチウェルプレート 384Roche5217555001
qPCR 装置 384 wellRoche5015243001LightCycler 480
成ポベブトリ

参考文献

  1. Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of the National Academy of Science USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
  2. Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M. Improved engraftment of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient (SCID) mice carrying human cytokine transgenes. Journal of Experimental Medicine. 182 (6), 2037-2043 (1995).
  3. Miyakawa, Y., et al. Establishment of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor producing transgenic SCID mice. British Journal of Haematology. 95 (3), 437-442 (1996).
  4. Hirabayashi, M., et al. A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit, and pig genomes. Experimental Animals. 50 (2), 125-131 (2001).
  5. Isola, L. M., Gordon, J. W. Transgenic animals: a new era in developmental biology and medicine. Biotechnology. 16, 3-20 (1991).
  6. Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).
  7. Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
  8. Ewerling, S., et al. Evaluation of laser-assisted lentiviral transgenesis in bovine. Transgenic Research. 15 (4), 447-454 (2006).
  9. Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors. Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).
  10. Park, F. Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis. Physiological Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).
  11. van Arensbergen, J., et al. A distal intergenic region controls pancreatic endocrine differentiation by acting as a transcriptional enhancer and as a polycomb response element. PLoS One. 12 (2), e0171508(2017).
  12. Friedli, M., et al. A systematic enhancer screen using lentivector transgenesis identifies conserved and non-conserved functional elements at the Olig1 and Olig2 locus. PLoS One. 5 (12), e15741(2010).
  13. Sauvain, M. O., et al. Genotypic features of lentivirus transgenic mice. Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).
  14. Punzon, I., Criado, L. M., Serrano, A., Serrano, F., Bernad, A. Highly efficient lentiviral-mediated human cytokine transgenesis on the NOD/scid background. Blood. 103 (2), 580-582 (2004).
  15. Zennou, V., et al. The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain. Nature Biotechnology. 19 (5), 446-450 (2001).
  16. Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F. H., Verma, I. M. Development of a self-inactivating lentivirus vector. Journal of Virology. 72 (10), 8150-8157 (1998).
  17. Yee, J. K., et al. A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Science USA. 91 (20), 9564-9568 (1994).
  18. Castaing, M., et al. Efficient restricted gene expression in beta cells by lentivirus-mediated gene transfer into pancreatic stem/progenitor cells. Diabetologia. 48 (4), 709-719 (2005).
  19. Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (4), 1607-1611 (2000).
  20. Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants. Proceedings of the National Academy of Science USA. 88 (11), 4626-4630 (1991).
  21. Norrman, K., et al. Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells. PLoS One. 5 (8), e12413(2010).
  22. Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C. J., Li, P. Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA. Journal of Virology. 75 (22), 11253-11260 (2001).
  23. Ohtsuka, M., et al. One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT). BMC Genomics. 16, 274(2015).
  24. Tasic, B., et al. Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (19), 7902-7907 (2011).
  25. Sumiyama, K., Kawakami, K., Yagita, K. A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection. Genomics. 95 (5), 306-311 (2010).
  26. Garrels, W., et al. Cytoplasmic injection of murine zygotes with Sleeping Beauty transposon plasmids and minicircles results in the efficient generation of germline transgenic mice. Biotechnology Journal. 11 (1), 178-184 (2016).
  27. Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
  28. Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16, (2015).
  29. Philippe, S., et al. Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 103 (47), 17684-17689 (2006).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

M16 M2
レンチ ウイルス媒介トランスジェニック マウスの生産: シンプルで高効率な創設者の直接の研究法
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。