ニワトリ胚組織の開発培養法

サマリー

今回、切片培養ニワトリ胚の器官を成長するプロトコル体外。このメソッドを使用すると、ニワトリ胚のティッシュの開発を学べる、文化環境の制御の高度を維持しながら。

要約

ニワトリ胚は、脊椎動物の発展のため信頼性の高いモデル有機体として使用されます。そのアクセシビリティと短い潜伏期間最適実験のためです。現在、鶏胚におけるこれらの発達の経路の研究は、阻害剤とローカライズされたサイトで、さまざまな方法を使用して低濃度で薬を適用することによって行われています。同時に全体の胚は、胚の感受性などを扱う際に問題の物理的な制限の多くを回避しながらホストの有機体から分離組織の研究を可能にする手法は、体外で細胞の培養潜在的に致命的な化学物質の高用量。培養ニワトリ胚半分頭、生体外で、現在確立された方法を超えて発達過程の検討のための新しい機会を提示するためのプロトコルを培養、切片を紹介します。

概要

ニワトリ (ギャラス) 生物学の分野でよく使用される優秀なモデル生物であります。その潜伏期間は約 21 日と迅速かつ効率的な実験を行う同時に多くの卵を孵化することができます。おそらく最も重要なは、胚はまた容易に操作、キーの発達過程とこれらのプロセスを駆動する蛋白質および遺伝子の広範な研究を有効にします。

ニワトリ胚目を介して数異なったティッシュのような他の多くのボディ システムの相互作用を開発する複雑な器官であります。このメソッドにより、研究開発の高度な段階で特にこれらの組織の開発のです。たとえば、多層の網膜は神経系の発達を学ぶものに特に関心のあります。眼瞼、強膜、レンズ vitreal 体、角膜などの他の眼組織の研究を有効にする別の方法は研究者に利点が。鶏胚の目には、平らな骨、膜内骨誘導および脊椎動物¹の骨化の研究のためのモデルとして使用できる強耳小骨のシリーズも含まれています。

現在、胚を研究するために使用するメソッド数があります。誘発抑制抗体または他阻害分子の^2,3, 外科的移植⁴阻害剤で浸したマイクロ ビーズとエレクトロポレーション⁵レセプター遺伝子を使用することができますすべてのメソッドまたは胚の興味の蛋白質。同様のメソッドは、リポタンパクリパーゼ蛋白質に使用されます。これらのメソッドは、制限ではないです。たとえば、萌芽期の開発を変更する化学物質を使用している場合は、胎児に対する致死効果を評価しなければならないとこれの生存を確保するため十分な低用量でのアプリケーションのローカライズされたサイトに前述のメソッドの使用を制限、胚。

体外の組織培養研究に有機体の広い範囲で使用されています、上記の制限の一部をバイパスに使用することができます。たとえば、大腿骨⁶羽芽^7、8、および手足⁹鶏のすべてを調べたマウス¹⁰および根の精巣と¹¹植物の茎を持っている組織培養の方法を使用しています。これらのメソッドは温度を変動し、栄養素の可用性を変更する機能など、組織開発の制御の高度科学者を付与します。全胚から組織の分離では、はるかに少ないより高い濃度でグローバル規模で操作研究ができ、化学物質の致死的な影響を受け。体外培養のもう一つの顕著な利点は、組織の細胞環境の保全組織の配置は比較的変わらない、異なったティッシュのタイプ⁹間の相互作用を研究することが可能となっています。したがって、体外養殖開きますドア追加実験アプローチ体内またはovo のモデルでは利用できません。

現在、化学物質を使用して萌芽期鶏眼研究開発は特に困難です。初期胚胚体外膜数カバー胚、ミクロ粒子のニキビトリートメントまたは化学薬品の適用が困難それにつれて、さらに複雑なメソッドがすでに困難胚にも卵の内で非常にアクティブです。このプロトコルは、目およびその周囲の組織、また眼内の発達過程を検討する新たな機会を提供しながら、これらの障壁を排除することに簡単にアクセスできます。このプロトコルは、萌芽期の目の強膜の小骨の誘導の研究に設立されました。

プロトコル

注: 胚の段階、ハンバーガーとハミルトン¹² (HH) ステージング テーブルを使用します。

1. 胚培養

1. 受精鶏卵で 37 ° C ± 1 ° C ~ 40% 湿度、滅菌温度制御のインキュベーターで孵化させなさい。
2. 卵 1 を有効に 1 日あたり x HH34 に孵化するようにし、(8 日後受精)。

2. 準備中と材料の殺菌

1. 12 胚、蒸留水、0.85% ひよこ生理食塩水、12 ガラス ピペット、紙ペーパー、半多孔質フィルター紙の 24 2.5 cm × 2.5 cm の正方形および鋼線の 24 2.5 cm × 2.5 cm 正方形の 1 ボックスの 1 L の 2 L メッシュ下方に湾曲したエッジのオートクレーブ。材料を滅菌するオートクレーブで 121 ° C、15 分以上。
   注: マテリアルのオートクレーブは事前に行うことができます。
2. 側面、棚、ドアを拭くことによって 70% エタノールでインキュベーターを滅菌します。オートクレーブを含む場所 2 プラスチック容器に蒸留水湿度を維持するために孵化器の中。37 ° C ± 1 ° C ~ 40% 湿度に文化のインキュベーターを prewarm します。インキュベーターが完全に暗い;ドアが透明の場合は、アルミ箔でカバーします。
3. 100 mL の培養液とペニシリンの 1 mL を prewarm 文化のインキュベーターでそれらを配置することによって。
4. ペーパー タオルでワークスペースをカバーし、ベンチを 70% エタノールを噴霧して消毒します。同様の方法で 2 組の鉗子、解剖はさみ、かみそりの刃、70% エタノールとプラスチック スプーンを消毒します。
5. 場所 12 滅菌 100 mm ペトリ皿と 24 滅菌 35 mm シャーレ用ベンチ。滅菌バッグでの使用まで、料理を確認します。

3. 胚の準備

注: この時点から文化の汚染を避けるために防塵マスクを着用します。細菌や真菌感染を台無しに文化とインキュベーターのすべての文化にすぐに広がっていることの危険性があります。

1. 亀裂は、卵を開き、0.85% ひよこ生理食塩水を含む 100 mm のペトリ皿に胚を転送します。解剖学的特徴によると胚のハンバーガーとステージングのガイドライン¹²ハミルトンと胚を確認の段階は、HH34 にあります。
2. 首を切り、二等分する殺菌かみそりの刃を使用して正中線で胚の頭。滅菌鉗子を使用して、脳を削除します。くちばしをそのまま。

4. 文化セットアップ

1. 1 つの 100 mm ペトリ皿内 35 mm のペトリ皿の場所 2。
2. 各 35 mm のペトリ皿の中のスチール ワイヤ メッシュを配置します。
3. 鉗子を使用すると、上を向いて目を 2.5 cm × 2.5 cm 半多孔質フィルター紙に切断 2 分離の頭の 1 を転送します。組織が安全であり、それを少し傾けることによってオフにスリップしていませんを確認します。
4. 眼組織とろ紙を 1 上眼組織の発生段階を作成する 35 mm ペトリ皿のスチール ワイヤ メッシュの上に置きます鉗子を使用して、慎重に。
5. 4.3 や 4.4 他の半分の頭で手順を繰り返します。
6. 滅菌ガラス ピペットを使用して、フィルター ペーパーのレベルに到達するまでそれぞれ 35 mm のペトリ皿に直接培養液を追加することは慎重に。栄養培地で半分の頭を漬けないでください。
7. 10,000 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシンの 50 μ L を各シャーレで培養液に追加します。
8. 小さな広場にティッシュ ペーパーの部分を折るし、100 mm ペトリ皿の中に置きます。オートクレーブの蒸留水で湿ら します。
9. 4 日間で 37 ° C ± 1 ° C ~ 40% 湿度滅菌、暗いインキュベーターに培養皿を配置します。
10. それぞれの胚の手順 3 と 4 を繰り返します。
    注: 胚の数必要によって異なります特定の実験;ここでは、12 の胚のプロトコルについて述べる。

5 文化の維持

1. 一日に一回、新鮮なオートクレーブ蒸留水でインキュベーターでプラスチック容器をトップします。
2. 細菌や真菌感染症のすべての文化を毎日確認します。文化の崩壊を持っているまたは媒体が色を変更された感染しています。感染しているすべての文化を破棄します。

6. 固定

1. インキュベーターからすべての料理を削除次の養殖。
2. ピンセットのペアを使用して、慎重組織を引き裂くように注意して、ろ紙から目を取り外します。
3. 4% のパラホルムアルデヒドの 4 ° C で一晩リン酸緩衝生理食塩水 x 1 または室温で一晩 10% 中性緩衝ホルマリンの眼組織を修正します。
4. リン酸緩衝生理食塩水 x 1 に 4 ° C で組織を保存します。

結果

このメソッドを使用すると、ニワトリ胚目でく体外の開発 (HH34) の 8 日目から 4 日間培養します。Ovo の開発の 4 日間は、HH38 に対応します。

この培養方法は、まぶた (図 1 b) に目を囲む羽芽の開発をサポートします。これらの羽芽はありません現在ovo でHH34 で前培養 (図 1 a)、ovoに¹³ (図 1)、養殖期間中に羽芽の開発を開始することを示します。まぶたと瞬膜成長、養殖 (図 1 b).の中に目をカバーするためまぶたは表示後

ディスカッション

このプロトコル (HH34) は 8 日目胚から鶏の目の成長を達成するために確立された組織培養技術を活用の in vitroの 4 日間。このグリッド培養法は、もともと Trowell¹⁵によって記述されていた。ニワトリ胚目¹⁵の分離組織層の間の誘導信号を研究するためにグリッドを持つ半多孔性膜を利用したピントとホールの 1991年研究¹⁶からプロトコルを最適化されています。このメソッドを使用して、ゴキブリは培養 14 日間の古い鶏大腿骨⁶です。このメソッドは、マウス組織^6,17を養殖に効果的な実証されても。ろ紙の使用は、飽和または組織を浸せず効果的に媒体からの栄養素を取る組織ことをプロトコルの成功に不可欠です。

栄養培地で適切な pH は最適な成長にとって重要...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
35 mm細胞培養シャーレ	コーニング	353001	イージーグリップ組織培養ディッシュ、ポリスチレン、非発熱性
100 mm細胞培養シャーレ	コーニング	353003	組織培養ディッシュ、ポリスチレン、非発熱性
ペーパーティッシュ	Kimtech	34155	Kimtechサイエンスブランドタスクワイパー、カートンワイヤーメッシュあたり280
	n / a	n / a	ステンレス鋼の金網(格子サイズ0.7 mm)
使い捨てガラスピペット	VWR	14673-010	ホウケイ酸ガラス使い捨て5 3/4 "
栄養培地	Gibco	12591-038	Fitton-Jackson修正、[+] フェノールレッド(BGJB)
ペニシリン-ストレプトマイシン	シグマ-アルドリッチ	P4458	10000ユニット/ mLペニシリンストレプトマイシン溶液安定化
フィルターペーパーWhatman		1454 090	多孔質の濾紙90mm
の受精鶏の卵	ダルハウジー大学農業大学	n/a	は地元の農場から得ることができる塩化
ナトリウム(NaCl)	EMD	SX0420-3	ナトリウムの結晶、試薬の等級
1 Lガラス瓶	VWR	89000-240	1 Lのpyrexオートクレーブ可能なガラス瓶
のエタノール	フィッシャーサイエンティフィ		BP82011 70%分子生物学グレードの
タッパーウェアコンテナ	n / a	n / a	店で購入および滅菌EtOH
使い捨てカミソリブレードVWR		55411-050	シングルエッジ工業用かみそりブレード(外科用炭素鋼)
プラスチックスプーンn	/ a	n / a	店で購入および滅菌EtOH
防塵マスク	3M	n / aで滅菌	3M 8500 コンフォート マスク
パラホルムアルデヒド	Sigma-Aldrich	P6148	パラホルムアルデヒド、試薬グレード、結晶性
中性緩衝ホルマリン	フィッシャー サイエンティフィック	72210	10% 中性緩衝ホルマリン
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)	該当なし	該当	なし10X リン酸緩衝生理食塩水 pH 7.4 (137mM NaCl、2.5mM KCl、4.3mM Na2HPO4、1.4mM KH2PO4)
15 ml falcon tubes	VWR	21008-216	滅菌済み遠心分離管
鉗子	FST	n/a	細かい鉗子
ひよこ生理食塩水	該当なし	該当なし	0.85%NaCl
ティンフォイル	n/a	n/a	店で買った
ペーパータオル	n/a	n/a	店で買った