今回、切片培養ニワトリ胚の器官を成長するプロトコル体外。このメソッドを使用すると、ニワトリ胚のティッシュの開発を学べる、文化環境の制御の高度を維持しながら。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
ニワトリ胚は、脊椎動物の発展のため信頼性の高いモデル有機体として使用されます。そのアクセシビリティと短い潜伏期間最適実験のためです。現在、鶏胚におけるこれらの発達の経路の研究は、阻害剤とローカライズされたサイトで、さまざまな方法を使用して低濃度で薬を適用することによって行われています。同時に全体の胚は、胚の感受性などを扱う際に問題の物理的な制限の多くを回避しながらホストの有機体から分離組織の研究を可能にする手法は、体外で細胞の培養潜在的に致命的な化学物質の高用量。培養ニワトリ胚半分頭、生体外で、現在確立された方法を超えて発達過程の検討のための新しい機会を提示するためのプロトコルを培養、切片を紹介します。
概要
ニワトリ (ギャラス) 生物学の分野でよく使用される優秀なモデル生物であります。その潜伏期間は約 21 日と迅速かつ効率的な実験を行う同時に多くの卵を孵化することができます。おそらく最も重要なは、胚はまた容易に操作、キーの発達過程とこれらのプロセスを駆動する蛋白質および遺伝子の広範な研究を有効にします。
ニワトリ胚目を介して数異なったティッシュのような他の多くのボディ システムの相互作用を開発する複雑な器官であります。このメソッドにより、研究開発の高度な段階で特にこれらの組織の開発のです。たとえば、多層の網膜は神経系の発達を学ぶものに特に関心のあります。眼瞼、強膜、レンズ vitreal 体、角膜などの他の眼組織の研究を有効にする別の方法は研究者に利点が。鶏胚の目には、平らな骨、膜内骨誘導および脊椎動物1の骨化の研究のためのモデルとして使用できる強耳小骨のシリーズも含まれています。
現在、胚を研究するために使用するメソッド数があります。誘発抑制抗体または他阻害分子の2,3, 外科的移植4阻害剤で浸したマイクロ ビーズとエレクトロポレーション5レセプター遺伝子を使用することができますすべてのメソッドまたは胚の興味の蛋白質。同様のメソッドは、リポタンパクリパーゼ蛋白質に使用されます。これらのメソッドは、制限ではないです。たとえば、萌芽期の開発を変更する化学物質を使用している場合は、胎児に対する致死効果を評価しなければならないとこれの生存を確保するため十分な低用量でのアプリケーションのローカライズされたサイトに前述のメソッドの使用を制限、胚。
体外の組織培養研究に有機体の広い範囲で使用されています、上記の制限の一部をバイパスに使用することができます。たとえば、大腿骨6羽芽7、8、および手足9鶏のすべてを調べたマウス10および根の精巣と11植物の茎を持っている組織培養の方法を使用しています。これらのメソッドは温度を変動し、栄養素の可用性を変更する機能など、組織開発の制御の高度科学者を付与します。全胚から組織の分離では、はるかに少ないより高い濃度でグローバル規模で操作研究ができ、化学物質の致死的な影響を受け。体外培養のもう一つの顕著な利点は、組織の細胞環境の保全組織の配置は比較的変わらない、異なったティッシュのタイプ9間の相互作用を研究することが可能となっています。したがって、体外養殖開きますドア追加実験アプローチ体内またはovo のモデルでは利用できません。
現在、化学物質を使用して萌芽期鶏眼研究開発は特に困難です。初期胚胚体外膜数カバー胚、ミクロ粒子のニキビトリートメントまたは化学薬品の適用が困難それにつれて、さらに複雑なメソッドがすでに困難胚にも卵の内で非常にアクティブです。このプロトコルは、目およびその周囲の組織、また眼内の発達過程を検討する新たな機会を提供しながら、これらの障壁を排除することに簡単にアクセスできます。このプロトコルは、萌芽期の目の強膜の小骨の誘導の研究に設立されました。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
注: 胚の段階、ハンバーガーとハミルトン12 (HH) ステージング テーブルを使用します。
1. 胚培養
- 受精鶏卵で 37 ° C ± 1 ° C ~ 40% 湿度、滅菌温度制御のインキュベーターで孵化させなさい。
- 卵 1 を有効に 1 日あたり x HH34 に孵化するようにし、(8 日後受精)。
2. 準備中と材料の殺菌
- 12 胚、蒸留水、0.85% ひよこ生理食塩水、12 ガラス ピペット、紙ペーパー、半多孔質フィルター紙の 24 2.5 cm × 2.5 cm の正方形および鋼線の 24 2.5 cm × 2.5 cm 正方形の 1 ボックスの 1 L の 2 L メッシュ下方に湾曲したエッジのオートクレーブ。材料を滅菌するオートクレーブで 121 ° C、15 分以上。
注: マテリアルのオートクレーブは事前に行うことができます。 - 側面、棚、ドアを拭くことによって 70% エタノールでインキュベーターを滅菌します。オートクレーブを含む場所 2 プラスチック容器に蒸留水湿度を維持するために孵化器の中。37 ° C ± 1 ° C ~ 40% 湿度に文化のインキュベーターを prewarm します。インキュベーターが完全に暗い;ドアが透明の場合は、アルミ箔でカバーします。
- 100 mL の培養液とペニシリンの 1 mL を prewarm 文化のインキュベーターでそれらを配置することによって。
- ペーパー タオルでワークスペースをカバーし、ベンチを 70% エタノールを噴霧して消毒します。同様の方法で 2 組の鉗子、解剖はさみ、かみそりの刃、70% エタノールとプラスチック スプーンを消毒します。
- 場所 12 滅菌 100 mm ペトリ皿と 24 滅菌 35 mm シャーレ用ベンチ。滅菌バッグでの使用まで、料理を確認します。
3. 胚の準備
注: この時点から文化の汚染を避けるために防塵マスクを着用します。細菌や真菌感染を台無しに文化とインキュベーターのすべての文化にすぐに広がっていることの危険性があります。
- 亀裂は、卵を開き、0.85% ひよこ生理食塩水を含む 100 mm のペトリ皿に胚を転送します。解剖学的特徴によると胚のハンバーガーとステージングのガイドライン12ハミルトンと胚を確認の段階は、HH34 にあります。
- 首を切り、二等分する殺菌かみそりの刃を使用して正中線で胚の頭。滅菌鉗子を使用して、脳を削除します。くちばしをそのまま。
4. 文化セットアップ
- 1 つの 100 mm ペトリ皿内 35 mm のペトリ皿の場所 2。
- 各 35 mm のペトリ皿の中のスチール ワイヤ メッシュを配置します。
- 鉗子を使用すると、上を向いて目を 2.5 cm × 2.5 cm 半多孔質フィルター紙に切断 2 分離の頭の 1 を転送します。組織が安全であり、それを少し傾けることによってオフにスリップしていませんを確認します。
- 眼組織とろ紙を 1 上眼組織の発生段階を作成する 35 mm ペトリ皿のスチール ワイヤ メッシュの上に置きます鉗子を使用して、慎重に。
- 4.3 や 4.4 他の半分の頭で手順を繰り返します。
- 滅菌ガラス ピペットを使用して、フィルター ペーパーのレベルに到達するまでそれぞれ 35 mm のペトリ皿に直接培養液を追加することは慎重に。栄養培地で半分の頭を漬けないでください。
- 10,000 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシンの 50 μ L を各シャーレで培養液に追加します。
- 小さな広場にティッシュ ペーパーの部分を折るし、100 mm ペトリ皿の中に置きます。オートクレーブの蒸留水で湿ら します。
- 4 日間で 37 ° C ± 1 ° C ~ 40% 湿度滅菌、暗いインキュベーターに培養皿を配置します。
- それぞれの胚の手順 3 と 4 を繰り返します。
注: 胚の数必要によって異なります特定の実験;ここでは、12 の胚のプロトコルについて述べる。
5 文化の維持
- 一日に一回、新鮮なオートクレーブ蒸留水でインキュベーターでプラスチック容器をトップします。
- 細菌や真菌感染症のすべての文化を毎日確認します。文化の崩壊を持っているまたは媒体が色を変更された感染しています。感染しているすべての文化を破棄します。
6. 固定
- インキュベーターからすべての料理を削除次の養殖。
- ピンセットのペアを使用して、慎重組織を引き裂くように注意して、ろ紙から目を取り外します。
- 4% のパラホルムアルデヒドの 4 ° C で一晩リン酸緩衝生理食塩水 x 1 または室温で一晩 10% 中性緩衝ホルマリンの眼組織を修正します。
- リン酸緩衝生理食塩水 x 1 に 4 ° C で組織を保存します。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
このメソッドを使用すると、ニワトリ胚目でく体外の開発 (HH34) の 8 日目から 4 日間培養します。Ovo の開発の 4 日間は、HH38 に対応します。
この培養方法は、まぶた (図 1 b) に目を囲む羽芽の開発をサポートします。これらの羽芽はありません現在ovo でHH34 で前培養 (図 1 a)、ovoに13 (図 1)、養殖期間中に羽芽の開発を開始することを示します。まぶたと瞬膜成長、養殖 (図 1 b).の中に目をカバーするためまぶたは表示後
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
このプロトコル (HH34) は 8 日目胚から鶏の目の成長を達成するために確立された組織培養技術を活用の in vitroの 4 日間。このグリッド培養法は、もともと Trowell15によって記述されていた。ニワトリ胚目15の分離組織層の間の誘導信号を研究するためにグリッドを持つ半多孔性膜を利用したピントとホールの 1991年研究16からプロトコルを最適化されています。このメソッドを使用して、ゴキブリは培養 14 日間の古い鶏大腿骨6です。このメソッドは、マウス組織6,17を養殖に効果的な実証されても。ろ紙の使用は、飽和または組織を浸せず効果的に媒体からの栄養素を取る組織ことをプロトコルの成功に不可欠です。
栄養培地で適切な pH は最適な成長にとって重要...
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
著者感謝したいグレゴリー ・ ハラー (サスカチュワン大学) プロトコルの開発に彼の準備作業のため。著者も感謝したいニコラス ・ ジョーンズ (マウント ・ サン ・ ヴァンサン ・大学) 彼の技術的専門知識と撮影と原稿のオーディオ/ビジュアル部分の生産に関するご案内のため。ダニエル ・ アンドリュースは、MSVU と自然科学工学研究会議のカナダ (レベル)経由から学部学生研究奨励賞の資金によって支えられました。タマラ A. フランツ スティーブンオデンダールスーターは、レベル検出補助金によってサポートされます。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 35 mm細胞培養シャーレ | コーニング | 353001 | イージーグリップ組織培養ディッシュ、ポリスチレン、非発熱性 |
| 100 mm細胞培養シャーレ | コーニング | 353003 | 組織培養ディッシュ、ポリスチレン、非発熱性 |
| ペーパーティッシュ | Kimtech | 34155 | Kimtechサイエンスブランドタスクワイパー、カートンワイヤーメッシュあたり280 |
| n / a | n / a | ステンレス鋼の金網(格子サイズ0.7 mm) | |
| 使い捨てガラスピペット | VWR | 14673-010 | ホウケイ酸ガラス使い捨て5 3/4 " |
| 栄養培地 | Gibco | 12591-038 | Fitton-Jackson修正、[+] フェノールレッド(BGJB) |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | シグマ-アルドリッチ | P4458 | 10000ユニット/ mLペニシリンストレプトマイシン溶液安定化 |
| フィルターペーパーWhatman | 1454 090 | 多孔質の濾紙90mm | |
| の受精鶏の卵 | ダルハウジー大学農業大学 | n/a | は地元の農場から得ることができる塩化 |
| ナトリウム(NaCl) | EMD | SX0420-3 | ナトリウムの結晶、試薬の等級 |
| 1 Lガラス瓶 | VWR | 89000-240 | 1 Lのpyrexオートクレーブ可能なガラス瓶 |
| のエタノール | フィッシャーサイエンティフィ | BP82011 70%分子生物学グレードの | |
| タッパーウェアコンテナ | n / a | n / a | 店で購入および滅菌EtOH |
| 使い捨てカミソリブレードVWR | 55411-050 | シングルエッジ工業用かみそりブレード(外科用炭素鋼) | |
| プラスチックスプーンn | / a | n / a | 店で購入および滅菌EtOH |
| 防塵マスク | 3M | n / aで滅菌 | 3M 8500 コンフォート マスク |
| パラホルムアルデヒド | Sigma-Aldrich | P6148 | パラホルムアルデヒド、試薬グレード、結晶性 |
| 中性緩衝ホルマリン | フィッシャー サイエンティフィック | 72210 | 10% 中性緩衝ホルマリン |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) | 該当なし | 該当 | なし10X リン酸緩衝生理食塩水 pH 7.4 (137mM NaCl、2.5mM KCl、4.3mM Na2HPO4、1.4mM KH2PO4) |
| 15 ml falcon tubes | VWR | 21008-216 | 滅菌済み遠心分離管 |
| 鉗子 | FST | n/a | 細かい鉗子 |
| ひよこ生理食塩水 | 該当なし | 該当なし | 0.85%NaCl |
| ティンフォイル | n/a | n/a | 店で買った |
| ペーパータオル | n/a | n/a | 店で買った |
参考文献
- Franz-Odendaal, T. A. Towards understanding the development of scleral ossicles in the chicken, Gallus gallus. Developmental Dynamics. 237 (11), 3240-3251 (2008).
- Scholey, J. M. Functions of motor proteins in echinoderm embryos: an argument in support of antibody inhibition experiments. Cell Motility and the Cytoskeleton. 39 (4), 257-260 (1998).
- Horakova, D., et al. Effect of FGFR inhibitors on chicken limb development. Development, Growth & Differentiation. 56 (8), 555-572 (2014).
- Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. Journal of Visualized Experiments. (101), e52943(2015).
- Luz-Madrigal, A., Grajales-Esquivel, E., Del Rio-Tsonis, K. Electroporation of Embryonic Chick Eyes. Bio-protocol. 5 (12), e1498(2015).
- Roach, H. I. Long-term organ culture of embryonic chick femora: a system for investigating bone and cartilage formation at an intermediate level of organization. Journal of Bone and Mineral Research. 5 (1), 85-100 (1990).
- Jung, H. S., et al. Local inhibitory action of BMPs and their relationships with activators in feather formation: implications for periodic patterning. Developmental Biology. 196 (1), 11-23 (1998).
- McKinnell, I. W., Turmaine, M., Patel, K. Sonic Hedgehog functions by localizing the region of proliferation in early developing feather buds. Developmental Biology. 272 (1), 76-88 (2004).
- Smith, E. L., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. A new take on an old story: chick limb organ culture for skeletal niche development and regenerative medicine evaluation. European Cells & Materials. 26, 91-106 (2013).
- Sato, T., et al. In Vitro Spermatogenesis in Explanted Adult Mouse Testis Tissues. PLoS One. 10 (6), e0130171(2015).
- Ochoa-Villarreal, M., et al. Plant cell culture strategies for the production of natural products. BMB Reports. 49 (3), 149-158 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Yu, M., et al. The developmental biology of feather follicles. The International Journal of Developmental Biology. 48 (0), 181-191 (2004).
- Jabalee, J., Hillier, S., Franz-Odendaal, T. A. An investigation of cellular dynamics during the development of intramembranous bones: the scleral ossicles. Journal of Anatomy. 223 (4), 311-320 (2013).
- Trowell, O. A. The culture of mature organs in a synthetic medium. Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).
- Pinto, C. B., Hall, B. K. Toward an understanding of the epithelial requirement for osteogenesis in scleral mesenchyme of the embryonic chick. Journal of Experimental Zoology. 259 (1), 92-108 (1991).
- Mbiene, J. P., MacCallum, D. K., Mistretta, C. M. Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia. Journal of Comparative Neurology. 377 (3), 324-340 (1997).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129(2015).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of Visualized Experiments. (8), e306(2007).
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
