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方法論記事

敷地内に陽極 respiring 細菌を豊かに自立の電気化学的セットアップ

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DOI:

10.3791/57632

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2018年7月24日

 ,  ,  , 
1International Center for Materials Nanoarchitectonics, National Institute for Materials Science, 2Department of Earth Sciences, University of Southern California, 3Department of Applied Chemistry, The University of Tokyo

この記事について

サマリー

敷地内の微生物濃縮またはその場で栽培技術は培養困難な微生物イチイ、特に低バイオマスまたは砂岩極端な環境からの分離を実現できます。ここでは、細胞外の電子輸送 (EET) ことができる微生物の系統を豊かにするための外部電源を使用せず電気化学のセットアップを説明します。

要約

嫌気性の呼吸 (細胞外の電子輸送 [EET] と呼ばれる) 不溶性の鉱物への電子輸送と相まって微生物のエネルギーの生産と特に多くの地下環境の持続性にとって重要と考えられています。水溶性ターミナル電子アクセプターを欠けています。EET-ことができる微生物は様々 な環境から分離されている、EET の細菌の多様性はまだ不十分な理解、特にサンプル困難な低エネルギーや地下などの極端な環境生態系。ここでは、ターミナルの呼吸系の電子受容体として、陽極を用いた EET できる細菌を豊かにするオンサイト電気化学システムについて述べる.この負極は、非生物的酸素還元反応を触媒できる陰極に接続されます。電極電位を安定させるため、ポテンシオスタットを使用する electrocultivation メソッドを使ってこの方法を比較すると、2 電極方式には、外部電源は不要です。ヒマラヤ スギ、カリフォルニア州北部の地上蛇紋岩化サイトのアルカリ池で利用当社敷地内の濃縮の例を提示します。ミネラル還元菌を育成しようとする前、成功しなかった可能性がありますこのサイトの低バイオマスの性質や微生物を減らす金属の低いの相対的な豊かさであります。私たち 2 電極濃縮を実装する前に、溶存酸素濃度の鉛直分布を測定しました。カーボンを配置することができましたこれを感じた陽極とプラチナめっき炭素水深嫌気性と好気性をサポートする陰極処理、それぞれ。敷地内のインキュベーション後我々 はさらに研究室では、陽極の電極を濃縮し、表面接続型と比較して明確な群集または通常杉で観測されたバイオ フィルムのコミュニティを確認しました。この強化はその後杉から最初無k 微生物の分離をもたらした。この敷地内の微生物濃縮法低バイオマスからまたはサンプルの生息地が困難な EET 対応の細菌の分離が向上する可能性があります。

概要

酸化還元酵素1を介した細胞の外側に電子を行う細胞の電子輸送 (EET) プロセスによって、ターミナル電子アクセプターとして固相鉱物を利用するいくつかのミネラルを減少させる微生物を示されています。EET は、微生物と無機物プロセスはまたエネルギー応用と微生物燃料電池2、電極合成3バイオレメディエーション4などの環境技術だけではなく、重要です。新しい EET できる細菌は非常に後に求められて、5の基礎または応用の観点から広く研究されています。ただし、のみこれらの細菌の生態学や生物地球化学的意義への洞察力は制限があります。EET-ことができる微生物の大半はアクア、堆積物、または嫌気性消化研究室6,の固体電子アクセプター MnO2Fe2O3構え電極などを使用してから次の濃縮分離されています。7,8しますただし、これらのメソッドは、しばしば似たようなコンソーシアムを生成し潜在的低エネルギーや低バイオマス システム、研究室や培養環境9に適応するこれらの微生物の能力をバイアスに支配する可能性がありますより敏感のイチイを欠場。.通常低いバイオマス環境で大量のサイトから水は細菌細胞を集中フィルターします。ただし、EET できる細菌はしばしば嫌気性代謝を展示し、酸素暴露がさらに阻害するまたはその栽培を防ぐためしたがって。酸素にさらすことがなく細胞を集中するオンサイト方法論代替 EET できる細菌の単離を促進できます。ここでは、外部電源を必要とせず、長期間以上 EET できる微生物を豊かにするための敷地内電気化学的手法のセットアップの詳細を報告します。

杉10、カリフォルニア州北部で高アルカリ性泉から electrocultivation 実験を使用してこの敷地内の電気化学的手法について述べる.ヒマラヤ スギのばねの地球化学は地下に蛇紋岩化作用の影響を受けます。温泉は、この機能的無酸素環境11EET を介して微生物のエネルギー生産の可能性を強調表示空気水インターフェイスの下で検出限界以下の酸素濃度と、高還元。ただし、(16 s rRNA またはメタゲノム解析) 杉から EET できる微生物をサポートする証拠はないです。この環境は、電子受容体、限られた端末電子アクセプター、ベア鉱物 (はすなわち、蛇紋岩化作用に起因する鉄などのミネラルを含む不溶性ミネラルを使用しての可能性として特徴づけられているにもかかわらず磁鉄鉱) に広範囲にわたって調査12されていません。我々 は、したがって、EET できる微生物 (図1)13を豊かにする、ヒマラヤ スギの高 pH 春キャンプ場春の電気化学的体制を展開しました。

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プロトコル

1. 環境培養の 2 電極システムの構築

  1. 陽極材料の調製と炭素の治療は、電極 (図 2) を感じた。
    1. 必要なバイオマス濃縮によって次元が同じに感じたカーボンをカットします。30 分 90% エタノールで各電極を浸す、少なくとも 8 回を各洗浄後 1 分間 sonicating、脱イオン水ですすぐ。
    2. 1 M HCl、各洗浄のため 12 時間の最小の攪拌で 2 回電極を洗浄します。
    3. 6-12 h または液体がなくなるまで暖かい (37 ° C) オーブンで電極を乾燥させます。
    4. ポリテトラフルオロ エチレン平板 (非粘着面) の製造元のプロトコルごとのグラファイトのエポキシを使用してチタン線に電極を接続します。
      注: 好気性の腐食への高い耐性のためチタン線を使いました。
    5. 120 ° C 6 h で電極を焼きます。
    6. チタン線間の抵抗をテストし、炭素オーム計で感じ、ワイヤーとフェルト電極間抵抗は 5 ω 未満であることを確認します。
  2. 炭素上の白金の electroplation を感じた陰極材料の調製用電極
    1. カーボン フェルト電極、ガラス容器で 12 h 最低 2 M コで 1.1 の手順で準備が水没します。
    2. 電気化学的洗浄も参照 (RE) と対向電極 (CE) を収容する 3 電極反応電極 (WE) を作業として電極を配置します。我々 は、接続日時、および CE ワニ口クリップでポテンシオスタットを。オーム計ですべての接続を確認します。
      注意: Ag/agcl (飽和 KCl) を使用して電極と白金線として日時と CE、それぞれ。
    3. 身のこなしで 1.0 V 対.電極銀/塩化銀 600 の 2 M (全体の電極が水没する十分な量を使用して) 島を含む電解質溶液で s。(これはガラス製) 電気化学リアクターから電極を取り出します。脱イオン水で電極を各洗浄後 1 分間 sonicating 少なくとも 8 回すすぎます。少なくとも 12 時間の 100 ° C で電極を乾燥させます。
    4. めっき液を準備するには、2 M 硫酸の 1 L にクエン酸 100 g、硫酸ナトリウムの 5 g、リン酸二水素ヘキサクロロ白金酸 (IV) 六水和物 2 g を追加します。
    5. 重量を量る掃除手順 1.2.1–1.2.2 の準備として電極を乾燥し、1.2.3 のステップで準備としてめっき液で電極をカバーします。3 回 30 のめっき液で電極を超音波それぞれ秒。
    6. -0.2 で電極の電位を投げかけてによって電極を電気メッキ V vs. Ag/agcl 460 のめっき液で s。脱イオン水で 2 回電極を洗い、プラチナの廃棄物を破棄します。
    7. 20 sonicating に少なくとも 3 回、脱イオン水に電極を洗浄後各リンス s。さらに少なくとも 3 回の超音波処理なしをすすいでください。
    8. 少なくとも 12 h. 重量を量る電極炭素めっきプラチナを定量化する 100 ° C で乾燥の電極は、電極を感じた。

2. 建設および 2 電極システムの設置

  1. 自然の環境で各電極の設置場所の調査。
    1. 溶存酸素 (DO) プローブを用いた酸素濃度を決定します。
    2. サイトでの深さを確認します。
      注: 陽極の望ましい環境条件、一貫した水和と無酸素状態であった。必要な場合は、光からアノードをシールドで酸素の光合成の影響を削除します。陰極の配置のための理想的な条件が一貫して水和し、表面近傍の水好気します。必要に応じて、陰極の表面の接触を維持するためにフロートを取り付けます。
  2. 燃料電池型 2 電極培養システムの構築
    1. 2 本の線をねじることによって (1 つの陽極と 1 つのプラチナ メッキの陰極) 電極から所望の長さの絶縁電線・ チタン線のリードを接続します。耐水性ワックスとの接続をカバーし、マリン グレード熱収縮チューブを使用してさらに保護します。
    2. 知られている抵抗の抵抗によって、カソードとアノード 2 本のワイヤを接続します。
      注: 生物学的システムの低い抵抗器 (10 に 1,000 Ω) はより一貫性のある生物学的活性の結果します。必要な場合、高抵抗はネガティブ コントロールとしての生物学的活性を防ぐ。抵抗とリード線との間の任意の接続の腐食を防ぐためには、熱収縮チューブを保護します。
  3. 測定電圧と時間の経過とともに温度ログです。
    1. 燃料電池反応から現在の生産を推定するため抵抗の両端間の電圧を確認してください。
    2. (製造元のプロトコルを見なさい) アノードとカソードにつながる適切に接続されたデータ ログ出力電圧計を使用して時間をかけて電圧差を測定します。
      注: 同時温度データロギング オプション、ですが、この情報は現在ではなく、非生物的に生物学的変動の変化に関連を助けることができます。
  4. データロガーとの電気的接続の保護
    1. ロガーおよびすべての電気接続を雨から保護するために静止したおよび/またはプラスチック製の袋を使用します。
    2. ビニール袋や強風から守るためにしっかりとケーブルを修正します。図 1に例を示します。

3. 自然環境から電極サンプル集

  1. アノード サンプルの品質の酸素混入による破壊を防止するには、嫌気性条件下で電極を収集します。
  2. 電極のサンプルを収集する前に、少なくとも 30 分は、嫌気性の場所にテスト チューブを置きます。たとえば、試験管と入れて蓋別々 に内嫌気性ボトルに池の下部に。
  3. ワイヤー カッターを持つ電極からチタン鉛を削減、穏やかに、試験管に電極のサンプルを収集し、嫌気性ゾーンのシールします。サンプルを新鮮に保つために、サンプルのコレクションの直後に 4 ° C でサンプルを保存します。
    注: また、電極が直接メディアに転送無酸素 (N2パージ)。(鈴木らによって記述された杉媒体を用いてください。11) には微生物の発育に十分な栄養素を提供するために水溶液の地球化学のサイトで測定され、改正から設計されました。このメディアは、異なる実験のため変更されました。

4. 現在の生産および DNA 分析のため実験室の確認

  1. 電極にアタッチする微生物コンソーシアの現在の生産能力の電気化学的確認。
    1. サンプリングされた電極、白金線、Ag/agcl (飽和 KCl) と電気化学リアクター14,15を構築電極と、我々 は、CE、嫌気性チャンバーで、それぞれ。杉中可溶性炭水化物電子ドナーを含む電気化学リアクターを入力します。
    2. 0.2 で身のこなしは電極電位 V vs. Ag/agcl と現在の生産量。
  2. 微生物の DNA を用いた電極サンプルからの DNA 抽出キット (材料の表を参照してください)。
    1. 70% のエタノールの嫌気グローブ ボックスの内側をきれいにしアルミ箔上に滅菌皿を置きます。
      注: 嫌気性チャンバーはパラジウム触媒存在下で酸素を清掃する 〜 2-3% 程度の水素雰囲気を維持することによって 1 ppm 未満の酸素濃度を維持します。
    2. グローブ ボックス内電気化学リアクターを開き、皿、試料電極を入れて、DNA キットで使用される管にフィットするサイズにカットします。製造元のプロトコルを続行します。

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結果

現在の生産は、図 3に示すように、電圧データロガーを使用して約 3ヶ月間正常に測定しました。今回は、春に影響を与える強力な秋の雨のため、春の長い安定した潜伏期間だったので選ばれました。短い期間は、長い期間は、バイオマスのより強力な濃縮を提供することが、十分な可能性があります。電気化学的培養後 2 電極システムの接続を確認し、システムの腐食の証拠は認められなかった.高い現在生産は 100 kΩ 耐陰性対照と比較して低抵抗 (1,000 Ω) 2 電極システムで観察されました。最初の月で徐々 に現在生産増加は、成長、蓄積または次の別の 2 ヶ月間安定した現在の生産電極の表面に微生物の宿泊施設に提案するかもしれない。興味深いことに、現在の生産に電解濃縮の全期間を通じて約 24 h サイクルように発振。

微生物フローラの制御電極に付着することの現在の生産能力を確認するため 3 電極電気化学リアクターを...

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ディスカッション

記述研究で微生物共同体、現在の生産現場の連動の濃縮を示す.現在サポート微生物活動のこのシステムの短期および長期の時間をかけて観測されたパターンをスケーリングします。機能 2 電極 (燃料電池型) システム構築のための重要なステップは識別して安定した水位と場所と環境中の酸素濃度を利用しました。陽極は嫌気性の条件の下で保管され、電極電位差 EET できる細菌の嫌気性の呼吸を促進する間、陰極は気液界面での酸素にさらされます。

研究所の原子炉ではなく環境の電気化学的システムで毎日電流振動を観測しました。この電流変動が認められたため、夜明けと夕暮れ - 日光の効果の認められた時間最大と最小の電流、昼間の間におよび/または温度が微生物の現在の生産の変化を説明できます。温度、日光および/またはその他の環境変数展開が可能さらにコントロールの理解と微生物の電子流のドライバー環境システム。また、追加の日光をブロック要素が削除または電極上の酸素の光合成および/または潜在的な光反応の影響を軽減するために助けることができるは、EET の最適の条件をより刺激するために役立つことができます。た...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

私たちに、杉の木へのアクセスを許可しての長期潜伏場所のコンサルティングのロジャー ・ Raiche、デビッド ・ マクロリーを認識したいと思います。2013-2014 シーズン中にまた杉フィールド クルーに感謝: 志野鈴木、石井俊一、グレッグ ウェンジャー、グレイソン ・ チャドウィック、ボニータ ラム、マシュー シェクター。志野鈴木と洞察力に富んだ研究、サポートを培養するためのハイス ・ キューネンのおかげで追加します。この作品は、若手 A と B の科学振興費助成会から 17 H 04969 と 26810085 をそれぞれ番号と日本代理店の補助金を通じて医療研究開発 (17gm6010002h0002) のため賄われていた。米国の資金、暗いエネルギー生物調査 (C-デビ) (OCE0939564)、NASA 宇宙生物学研究所は-生命地下 (ない LU) (NNA13AA92A) 米国の世界的な海軍研究局 (N62909-17-1-2038)、センターによって提供されます。この作品の一部を日本社会の一員として科学振興のため行った: アネット ・ ロウ (PE15019) 東京大学橋本和仁研究室でポスドク研究員短期プログラム。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
カーボンフェルトシートn/an/aアノードおよびカソード
チタン線Nilaco CooporationTI-451485燃料電池システム
グラファイトエポキシ電解lncn/a
電極とTi wire
を接続するために使用されます 乾燥オーブンヤマトDY300電極を焼く
導電性グラファイトエポキシを固化させる
デジタルマルチメーターフルーク616-1454のオーム値
を確認するために
溶存酸素プローブSper Science#  850045で酸素
濃度をチェックするために環境
抵抗Sodial燃料電池
システムの構築に使用
導線Pico81141s燃料電池
システムの構築に使用
電圧計とデータロガーT&DコーポレーションVR-71データ記録に使用
ヘキサクロロ白金水素(IV) 六水和物和光18497-13-7エレクトロポレーションに使用
クエン酸和光038-06925エレクトロポレーションに使用
硫酸和光192-04696エレクトロポレーションに使用
HCl和光083-01095電極洗浄に使用
ガラスシリンダーN/AN/Aカスタムメイド、電気化学反応器
PTFEカバーとベースN/AN/Aカスタムメイド、電気化学反応器のカバーと基礎として使用
ブチルゴムN/AN/Aカスタムメイド、電気化学反応器の各コンポーネントの間に挿入
セプタGL科学3007-16101電気化学反応器の注入口として使用
インジウムスズドープ酸化物(ITO)電極ジオマテックNo.0001作用電極として使用、5Ω/sq
Ag/AgCl KCl飽和電極北斗電工HX-R5参照電極として使用、 Φ0.30mm
プラチナ線ニラコクーポレーションPT-351325対極に使用
NaHCO3和光191-01305シーダーズメディア(CMS)に使用
CaCO3和光030-00385CMSに使用
NH4Cl光011-03015CMS
に使用MgCl<サブ>2 &ブル;6H2O和光135-00165CMS
NaOHに使用 和光198-13765CMSに使用
Na2SO4和光194-03355CMSに使用
K2HPO4和光164-04295CMS
CABSサンタクルスSC-285279CMS
インキュベータリカキカイLTI-601SD予備栽培
オートクレーブマシンタカラトミー精工株式会社LSX-500電気化学反応器と培地の滅菌に使用
クリーンベンチSANYOMCV-91BNF電気化学反応器と培地が他の微生物で汚染されるのを防ぐために使用されます
遠心分離機セパレーターエッペンドルフ5430R回転速度 最大6000回;gは窒素
ガス発生装置プエク(株)が必要です。PNTN-2窒素ガスボンベ ガス発生器の代わりにも使用可能
紫外可視分光器島津製作所 UV-1800細胞密度の最適化に使用
ポテンショスタットバイオロジックVMP3バイオフィルム形成や動力学同位体効果実験に使用
サーマルウォーターサーキュレーターAS ONETR-1A電気化学反応器の温度維持に使用
ファラデーケージ北斗電工HS-201S電気化学実験に使用
嫌気性チャンバーCOYTypeB (ビニール)嫌気性条件下での実験
を行う
超クリーンDNA抽出キットMoBio
に使用 の構築に使用されます。は 抵抗として使用 ム 和に使用 ーに使用 東京

参考文献

  1. Nealson, K. H., Saffarini, D. Iron and manganese in anaerobic respiration: environmental significance, physiology, and regulation. Annual Reviews of Microbiology. 48, 311-343 (1994).
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