突起力顕微鏡: 細胞突起が開発した力を定量化する方法

Summary

ここでは、エキスタチン適用対応フィルム地形画像の自動解析するフィルムの調製から突出力を評価するために使用する実験手法を詳しく説明します。

Abstract

多数の生物学的文脈で動物細胞を機械的な力を開発することによって、環境物理的にやり取りする必要があります。これらのうち、牽引力はよ特徴付けられた、されているが、基板に直交細胞突起力測定技術の不足があります。付着性のセルの基板上で突出力を測定する実験装置を考案しました。準拠ホルムバール シート メッキ細胞変形この基板、ナノメートル スケールでの原子間力顕微鏡 (AFM) によって生成された地形にマップされます。フォース値は、前方の細胞構造の幾何学に基づく変形分布の解析から、抽出されます。したがって、時間の経過とともに細胞の個々 の突出の単位によって力を測定できます。この手法は、力の発生とその突起を含む多くの細胞プロセス制御の研究を有効になります。ここでは、その人間の大食細胞によって形成されるエキスタチンによって生成された前方力を測定への応用について述べる.

Introduction

動物細胞は、物理的に行列とその環境¹を構成する他の細胞と対話します。これは、移行、体を内面化、外部情報を取得を区別するために必要です。このようなプロセスでセルは機械力を生成する必要がある、その生物学的挙動、例えば増殖の監督と近年多くの研究が示している、力を生成し、その環境をプローブする細胞の能力の影響か分化^2,3。ターンでは、細胞の力の測定は力生成の規制を勉強し、細胞行動と組織の運命^4,5にその意義を理解する主要な援助です。

近年では、その環境では⁶セルを出せる力を測定する多数の技術の開発を目撃しました。これらの大半は牽引力細胞出す携帯電話プローブまたは変形可能な基板をはめると、明らかに尽力されています。しかし、細胞外の環境に突起に関連する機械的な力測定技術の不足に苦しむ、日でなく特徴にしています。

この制限を克服するためには基板に直交に加わる力を測定する手法を提案します。それは細胞細胞基質の変形を測定し、軍の関与を推測することが可能となって、直交方向に変形することができます薄い弾性シートをめっきで構成されます。基板形状、原子間力顕微鏡によるナノスケールの分解能で測定し、変形から力の評価は、前方の細胞構造^7,8,の幾何学の知識に依存しています⁹。

ここでは、セットアップとエキスタチン、三次元環境^{10、11、間葉系移行の大食細胞によって形成される前方接着構造によって生成された力を測定への応用について述べる 12,13,14,15,16,17}。この手法が力の発生とその突起を含む多くの細胞プロセス制御の理解を進めると考えています。

Protocol

1. ホルムバール コーティング グリッドの準備

1. 純粋なアセトンで電子顕微鏡グリッドをきれいしてろ紙に乾燥させる.純粋なエタノールと顕微鏡スライドをきれい、レンズ ペーパーで拭くし、ブロワーでほこりを取り除きます。
2. ホルムバールの下の部分でのソリューションを含むフィルム キャスト装置の漏斗にエタノール洗浄ガラス スライドを垂直方向に配置します。漏斗の上をカバーしてください。
3. レベルがスライドの 3 分の 2 に達するまでホルムバール溶液 (二塩化エチレンは 0.5%) 100 mL アトマイザー電球が付いているポンプします。
4. 1 分のためのソリューションにスライドをしてください。
5. 安定パラレルテク ホルムバール ソリューションを排出する装置のバルブを開きます。10 15 mL/秒の流量が 30-80 nm のホルムバール フィルムを得られます。フィルムの厚さは、ホルムバール溶液の濃度によって、排水速度によって決まります。
   注: バルブをゆっくり開いて、圧力を介して空気弁で排水率を制御できます。排水をより速くより厚いフィルム。実習でホルムバール流量から膜厚を予測することは困難だから我々 ホルムバール映画のいくつかのバッチを準備し、AFM による厚さを制御 (手順 2 を参照)。
6. 商工会議所からスライドを削除し、繊細な任意の液体ホルムバールを削除するろ紙上で乾燥させます。
7. かみそりの刃を持つホルムバール フィルムから 20 mm × 50 mm の四角形をカットします。
8. クリーンの蒸留水をビーカーを記入し、ゆっくりと映画をオフにフロートするために水に垂直方向にスライドを突入: フィルムは水面に浮かぶべきであります。
9. 光沢のあるフィルム上のグリッドを場所乾燥アセトン洗浄が立ち向かいます。
10. グリッドのいくつかの上に丸いガラス coverslip (Ø 12 mm) を配置します。この coverslip の膜厚を測定するのに役立つでしょう (手順 2 を参照)。
11. それに合うようにサイズ変更された白いステッカーで顕微鏡スライドをカバーします。映画全体がスライドに準拠してまでフローティング ホルムバール フィルムの境界線に垂直方向にスライドを浸しなさい。ろ紙をスライドから余分な水分を削除して、それは室温で一晩乾燥させてください。

2. 膜厚の測定

1. ピンセットでスライドからそれをデタッチする、coverslip の周りホルムバールをカットします。
2. ペンで、coverslip の下のグリッドの位置をマークします。
3. Coverslip からデタッチするマーク グリッドの周りホルムバールをカットします。したがって、穴残りホルムバール シートで、膜厚を測定することができます。PBS の coverslip をカバーし、顕微鏡のスライド ガラスの上に置きます。
4. ゴールデン ストライプ春の先端に表示されないかどうかを確かめて、原子間力顕微鏡ガラス ブロックのシリコン窒化カンチレバーをマウントします。
   注: 感度とカンチレバーのばね定数する必要があります以前較正されて PBS で。
5. AFM モジュール上にガラス ブロックをマウントし、顕微鏡の上にモジュールを配置します。
6. 観測室ホルムバール コーティング coverslip を置き、500 μ L の PBS でそれをカバーします。
7. コンタクト モードと 0.5 nN の力セット ポイントで原子間力顕微鏡を用いたホルムバール シートの穴の境界線をスキャンします。
8. 高さ測定の参照としてガラス coverslip 表面を使用し、断面の高さとホルムバール厚を評価 (実行ホルムバール バッチごとの少なくとも 10 測定)。

3. グリッド上のセルのシード

1. 無菌フードの下で上、両面粘着テープのストリップ (12 mm × 3 mm) を配置します。
2. ホルムバール コーティング グリッドをピンセットで切り取って逆さまに接着剤ストリップ (グリッドの縁のみがテープに接続する必要があります)。ホルムバール フィルムは、coverslip に直面する必要があります。
3. まあ文化にこのデバイスを置きます。
4. ひと単球¹⁶から区別される 10 の⁴大食細胞を含む FCS なし RPMI の 10 μ L の液滴を配置します。
   注: を確認ホルムバール コーティングの損傷を防ぐためにピペット チップでグリッドに触れないようにします。
5. (37 ° C、5% CO₂) 細胞付着させる 30 分間インキュベートします。
6. 2 ml の 10% の FCS を含む RPMI の井戸を埋めます。
7. 細胞の AFM 観察する前に付着する CO₂を 5% と 37 ° C で 2 時間デバイスを孵化させなさい。

4 Podosome 誘起変形の地形計測

1. ガラス底ペトリ皿に倍増した両面粘着テープの 2 つのストリップを固執します。
   2 つのストリップ間の距離はグリッドの直径よりも小さくなる必要があります。
2. 慎重に粘着テープからマクロファージとメッキ グリッドをデタッチします。
3. 裏返して、グリッド セルをガラスに直面するために、2 つの接着剤のストリップ間グリッドを固執します。
4. 2 つのグリッドは、新しい倍増両面接着剤のストリップ修正: AFM チップにアクセス可能なグリッドの中央の領域を残して 2 つの接着剤ストリップしたがってサンドイッチされ、グリッド。
   グリッドが固定もあり、ねじれていない; 注: を確認します。そうでなければ AFM カンチレバーはホルムバール表面に近づくことができるかもしれない。
5. 10 mM HEPES (pH 7.4) を添加した予熱の 37 ° C 培養液 (10 %fcs と RPMI) 2 mL をシャーレをご記入ください。
6. 37 ° C 皿ヒーターに培養皿を置きます。
7. 原子間力顕微鏡ステージ上皿ヒーターをインストールします。
8. 37 ° C で安定化システムします。
9. 0.5 nN の力で接触モード エキスタチンを検索する最初のグローバル イメージを作成し、ホルムバール地形 3 Hz で約 20 nm 大ピクセルします。
   メモ: は、グリッドの端近くをスキャンしないでください。

Results

上記のプロトコルでは、マクロファージ エキスタチン ホルムバール基板上で前突荷重を定量化する実験のセットアップを準備する方法について説明します。これは原子間力顕微鏡を使って実現されますが、図 1に示します。

エキスタチン JPK データ処理ソフトウェアを使用しての下の膨らみの地形イメージを分析する場合、3 次多項式適合は各スキャン ラインから独立して減算する必要があります。Podosome 誘起バンプの高さの最大値は、画像の側に z カラー スケールを追加することによって評価できます。TIFF 形式でエクスポートされた後、三次元地形画像では専用自家製 ImageJ マクロ利用可能なオンライン⁸を使用してをさらに解析します。このマクロは修正された高さイメージ上の膨らみが決まりし、力マップ (図 2

Discussion

材料特性

ホルムバール、私たちのケースで、変形可能な膜材料の選択は、いくつかの要件を満たす必要があります。材料必要がある可視光線を通す、明視野と蛍光顕微鏡で観察できるように限られた自己蛍光を展示します。薄膜の粗さは、10 をかなり下回っている必要があります nm 細胞接着に対する任意の地形の影響を避けるために、AFM イメージングによる細胞突起のクリアな観察を許可します。最後に、膜のヤング率と材料の厚さに依存する剛性が podosome サイトで発生する典型的な応力のいくつかの観察可能な変形性能を維持しながらエキスタチンの形成を誘導するのに十分高いする必要があります。周りが 10-100 kPa。ホルムバール素材、30-80 nm の薄膜の準備は、これらすべての制約との間の良い妥協点です。ホルムバール膜の厚さを調整することにより、剛性をエキスタチン⁷の力覚の特性を研究し調整できることに気づいて価値があります。

再現性とホルムバール...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
200メッシュニッケルグリッド	電子顕微鏡科学	G200-Ni
濾紙	Sigma-Aldrich	1001-055
顕微鏡スライド	フィッシャーサイエンティフィック	10235612
白いステッカー 26 x 70 mm	エイブリー	DP033-100
出口にバルブを備えたフィルム鋳造装置	電子顕微鏡科学	71305-01
かみそり刃	電子顕微鏡 科学	72000
エタノール	VWR	1.08543.0250
アセトン	VWR	20066.321
二塩化エチレンの Formvar 0.5% 溶液	電子顕微鏡科学	15820
12 mm カバースリップ	VWR	631-0666
倒立顕微鏡	Carl Zeiss	Axiovert 200
間力顕微鏡	JPK Instruments	NanoWizard III
温度制御サンプルホルダー	JPKインスツルメンツ	バイオセル バイオセル
窒化ケイ素カンチレバー、公称スプリング定数 N/m	Veecoインスツルメンツ	MLCT-AUHW
PBS	Gibco	14190-094
両面粘着テープ	APLI AGIPA	118100
RPMI 1640	Gibco	31870-025
FCS	Sigma-Aldrich	F7524
HEPES	シグマアルドリッチ	H0887
35 mmガラス底ペトリ皿	WPI	FD35-100