開発とマウス免疫寛容樹状細胞の機能解析

Summary

ここでは、開発し免疫寛容樹状細胞 (TolDCs) の特徴し、その免疫療法の有用性を評価するためのプロトコルを提案する.

Abstract

外国の抗原に対する調整の応答のタイトなバランスを維持することによって免疫システムが作動して共生生物に由来する抗原と同様に自己抗原に対する応答のない状態を維持します。この免疫恒常性の中断は、慢性炎症、自己免疫疾患の開発につながることができます。樹状細胞 (Dc) は、外国の抗原に対する免疫応答を開始するナイーブ T 細胞を活性化に関与する生得の免疫組織のプロフェッショナルな抗原提示細胞です。しかし、Dc は行動を維持し T 細胞寛容を促進し、どちらか自己免疫または慢性炎症状態の発展に貢献するエフェクター細胞を抑制する TolDCs にも区別できます。TolDCs の私達の理解の最近の進歩は、その分化条件を調節することによって DC 耐性が得られることを示唆しています。この現象は、多数の免疫疾患で免疫寛容を破る原因の TolDC 療法の開発の途方もない成長につながっています。臨床免疫マウスモデルで成功した研究はさらに自己免疫疾患の治療に TolDCs の免疫療法の有用性を検証しました。今日、TolDCs 防御免疫をそのまま残しながら病原性自己免疫反応をターゲットに様々 な免疫疾患における免疫寛容を回復のための診療所で有望な免疫療法のツールとなっています。TolDCs を誘導するために複数のラボで戦略の配列が提案されているが、これらの細胞の機能的な細胞の表現型を特徴付けることは一貫性はありません。このプロトコルは、大量合成部の 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic と TolDCs にそれらを区別するために使用される一意のメソッド内の骨髄由来の Dc の開発のステップ バイ ステップ ガイドを提供します酸-フッ素-プロピル-アミド (CDDO DFPA)、および TolDCs の必須の分子シグネチャの分析を含む、彼らの表現型を確認するための技術。最後に、我々 は多発性硬化症の前臨床モデルでの免疫応答の in vitroとin vivoのテストで TolDC 関数を評価する手法を示す.

Introduction

樹状細胞 (Dc) 生来の免疫システムの不可欠な部分し最初発見され¹主プロフェッショナルな抗原提示細胞として、1973 年にラルフ ・ スタインマンと Zanvil コーンによって特徴付けられます。Dc リンク自然免疫と適応免疫システム²に二次リンパ器官の T 細胞と B 細胞で主要組織適合遺伝子複合体 (MHC) に処理された抗原提示することで免疫活性化に重要な役割を果たすことが示されています。哺乳類の免疫系に骨髄の Dc、Dc (Pdc)³形質としてされている Dc の少なくとも 2 つのカテゴリがあります。従来の Dc (cDCs) CD11c 表現によって特徴付けられる未熟な Dc (Idc)体外骨髄前駆細胞や末梢血単球を用いたからと区別することができますと呼ばれ、また、骨髄性の Dc顆粒球マクロファージ ・ コロニー刺激因子 (GM-CSF) と IL-4 マウスや人間種、それぞれ⁴で。

『 危険 』 を活性化信号を病原体関連分子パターン (種緑化) または損傷関連分子パターン (湿気がある)、様々 なパターン認識受容体結合を介して成熟した Dc (Mdc) として免疫原性 Dc に向けて Idc 成熟をドライブするなど、DC の表面⁵。さらに免疫原性 Dc プライム ナイーブ T 細胞の増殖・分化アップレギュレーションを介して MHCII²、共刺激リガンド (CD80、CD86、CD40)⁶サイトカイン、その他水溶性メディエーター⁷。免疫原性 DCs からプロ炎症性仲介人の生産のカスケードは、サイトカインを介した T 細胞の分化に不可欠です。たとえば、IFN-γ および il-12 が th1 細胞分化⁸と IL-1, 必要な IL-6 と IL-23 は重要ナイーブ T 細胞 Th17 細胞⁹に向かって偏光です。成熟した Dc は、外国の抗原に反応する、自己抗原による自由な DC の活性化が耐アブレーションを原因し、その活性化組織破壊^{10 につながる自己反応性 T 細胞を生成することによって自己免疫疾患の開発の促進}.

最近の報告では、DC の可塑性、その組織微小環境の内で異なるキューとやり取りして異なるエフェクター/サプレッサー DC サブセットに区別するために彼らの能力によって例示の明確な証拠を提供しています。IL-10¹¹TGF-β¹²HO 1¹³などの抗炎症メディエーターは、Dc (TolDCs) 免疫寛容を誘導することによって免疫抑制に重要な役割を再生する示されています。これらの TolDCs は、規制機能を取得し、¹⁴T 細胞増殖を抑制します。また、Dc による共刺激の欠如と TolDCs から抗炎症メディエーターの生産両方は制御性 T 細胞 (Treg) の誘導に貢献、Th1 と th17 細胞分化と拡大¹⁵も効果的に抑制します。過去の二十年でに、TolDCs の治療の可能性はいくつかの調査で、報告されています。これらの研究でex vivoの管理自己免疫疾患¹⁶の異なる前臨床モデルで TolDCs の改善だけでなく病的症状を生成がまた^{17 の患者で免疫の許容の開発につながった ,18}。興味深いことに、今日 TolDCs 療法として考えられている代替または補助アプローチを含む、いくつかの臨床試験で自己免疫疾患のタイプ 1 糖尿病¹⁹、関節リウマチ^{20, 21}、多発性硬化症 (MS)^22,23,24Crohn 病²⁵。

各種 TolDCs の開発に採用されているプロトコルがあり、いくつかの研究所は、生成と TolDCs の表現型特性の方法を報告しています。造血前駆細胞からの in vitro TolDCs 再現性をもって生成し、安定して免疫寛容状態体内^26,27,28,29でそれらを維持するために、これらのメソッドを使用することができます。Idc は、様々 な免疫調節薬剤や抗炎症性サイトカインへの露出によって TolDCs に変換できます。たとえば、ビタミン D3 は IL-10 生産を増大させる、DCs から IL 12 分泌を抑制し、それにより免疫抑制機能³⁰を後押しする知られているよく知られている薬剤です。また、Dc がリポ多糖 (LPS) などの強力な炎症性刺激にさらされるデキサメタゾン³¹、ラパマイシン³²、コルチコステロイド³³などいくつかの薬剤が示されているを誘発する、CD40、CD80、CD86、MHCII³⁴DC 表面発現を減らすことによって TolDC の表現型。IL-10 および TGF-β が DC 耐性³⁵とこれらのサイトカインの両方に複合暴露を誘導するためにほとんど研究抗炎症性サイトカインが Dc³⁶抗原の表現型を誘導するために示されています。

免疫寛容の表現型マーカーではなく、DC は機能特性によって定義される偉大な TolDCs の細胞および機能特性評価のための一貫した方法を開発する必要があります。厳格かつ一貫性のあるプロトコルが一貫性のある評価と免疫寛容 DC 表現型の特性の確立必要があります我々 効果的かつ再現性をもって TolDC の表現型を誘導する新しいエージェントの能力を比較している場合さらに、実験室。ここで提供詳細なプロトコル マウスの造血前駆細胞から Idc を分離してその後 TolDCs、Idc に変換する能力の評価の下で新しいエージェントの有効性を分析するステップ バイ ステップのメソッドを提供する堅牢ですTolDCs の機能および表現型特性の in vitroとin vivoの両方。この説明には、その表面配位子、サイトカインのプロファイル、および体外免疫機能によって TolDCs を特徴づける精巧なメソッドが含まれています。我々 も MS、実験的自己免疫性脳脊髄炎 (EAE) の前臨床モデルでこれらの TolDCs の潜在的な治療上のアプリケーションを探索する方法の例を提供します。この確立されたプロトコルは TolDCs の誘導を促進するために新しいエージェントのキャパシティを評価する調査官を助け、TolDC 治療開発の範囲を拡大するための努力を容易に。

Protocol

ケース ウェスタン リザーブ大学医学部の制度的動物ケアおよび使用委員会によって承認された手続きに準拠してすべての研究を行った。

1. 骨髄由来樹状細胞 (黒谷)

1. オートクレーブを介してすべての手術器具を滅菌し、クラス II 生物学的安全キャビネット充当安全手順で実験を実行します。
2. 8-10 週齢の c57bl/6 マウスを安楽死させる CO₂箱を用いた。解離性の基板上にマウスを置くし、70% エタノールでリンスします。外科はさみを用いて脛骨腓骨、大腿骨の骨を切除し、10 cm 培養皿の中の 70% のエタノールで配置します。
3. ティッシュを解剖する外科ブレードと鉗子を使用して 10 cm の蓋の上可能な限り、料理の文化し、脛骨と大腿骨 6 cm 培養皿の中の 70% のエタノールのそれらを置くに分離します。
4. 脛骨と大腿骨の両方の端をトリミングするのにには、外科ブレードを使用します。12 ml の PBS を含む円錐管に骨の一方の端から骨髄の内容をフラッシュするのに 23 G 針付き 3 ml シリンジ 3 mL PBS を使用します。骨の両端の 3 倍この手順を繰り返します。
5. 5 分間 300 x g で細胞懸濁液を遠心します。
6. 上澄みを除去し、赤の血液細胞を削除する 5 分の 1 ml ACK 溶解バッファーで細胞ペレットを再懸濁します。
7. 9 ml PBS ACK 溶解バッファーと 300 x g で 5 分間遠心を希釈するを追加します。
8. 上澄みを除去し、10 ml の培地 (RPMI 1640 プラス L-グルタミン、10 %fbs、1% 非必須アミノ酸 (100 x)、10 mM HEPES、50 nM β-メルカプトエタノール、および 5% ペニシリン/ストレプトマイシン) で再懸濁します。
   注: エンドトキシン濃度は、FBS で 0.1 未満 EU/ml をなければなりません。
9. 細胞懸濁液を 40 μ m の細胞ストレーナを通過しの細胞懸濁液 20 μ l を取るし、トリパン ブルーの cytometer による生きているセルの数をカウントするの 80 μ l で混ぜます。
10. 1 x 10 の⁶セル/15 ng/ml GM-CSF と 10 ng/ml IL 4 ml に細胞数を調整します。
11. 1 x 10⁶セル/6 ウェル プレートの各ウェルに ml の 3 ml をプレートし、37 ° C、5% CO₂、および CO₂インキュベーターの湿度 95% でセルを孵化させなさい。
    注: 1 つのマウスの骨髄細胞は周辺 3 6 ウェル プレート 2 から配置することができることを示す 10 の⁷セル × 3-5。
12. 3 日目、各ウェルに 2 ml の新鮮な PBS を追加各ウェルからすべて 3 ml の培養液を削除し、すべての非付着性のセルを削除することを確認するプレートを軽く渦巻き模様します。
13. 15 ng/ml GM-CSF と 10 ng/ml 各ウェルに IL 4 3 ml の新鮮な培養液を交換してください。37 ° C、5% CO₂、および CO₂インキュベーターの湿度 95% でセルを孵化させなさい。
14. 5 日各ウェルで 15 ng/ml GM-CSF と 10 ng/ml IL 4 別 3 ml の新鮮な培養液を直接追加します。37 ° C、5% CO_2、および CO₂インキュベーターの湿度 95% でセルを孵化させなさい。
    注: 各ウェルの容量は 6 ml では今です。
15. 7 日には、10 分間氷の上プレート全体を置きます。優しく各 Idc として懸濁液に、緩く付着黒谷を取り除くために培養液をピペットします。
    注: 付着性マクロファージはまだプレートに接続されています。低温と優しく手順は、さらに実験に影響を与える DC の活性化を避けるためにキーです。
16. 5 分の 300 x g で細胞懸濁液を遠心し、さらに実験のための新鮮な培養液で再懸濁します。
    注: 黒谷は、フローサイトメトリーによる CD11c 抗体の蛍光標識で識別できる、図 1でのさらなる実験の黒谷のゲーティング方針を示した。

2. TolDC 遺伝子とタンパク質のプロファイルを特徴します。

1. 37 ° C、5% CO₂および CO₂インキュベーターの湿度 95% で 1 時間インキュベート培と 100-400 nM の CDDO DFPA の有無で 1 × 10⁶黒谷/ml 6 ウェル プレートのウェルあたり 2 ml をプレートします。
   注: CDDO-DFPA、合成部核因子 (赤血球由来 2) - のようだ - 2 の要因 (Nrf2) 誘導と核因子 κ B (NF-κ B) の阻害剤Idc、IL-10、ビタミン D3、デキサメタゾン湾 11-7085 などから TolDCs の誘導のために他のエージェントを適用し、この手順を各エージェントのための最適な条件を変更します。
2. Mdc (インキュベーション時間は mRNA やタンパク質の測定により異なります) を誘発する 4 24 時間インキュベート LPS の 10 または 100 ng/ml を追加します。
3. 軽く各ウェルに培養液をピペット、1 ml ピペットを用いて細胞懸濁液を収穫します。それぞれ細胞や培養上清を収集するために 5 分の 300 × g で遠心分離機します。
4. 刺激リガンドなどのフローサイトメトリーによる細胞ペレットから表面配位子を分析: CD40、CD80、CD86、MHC-II、OX40L、ICOSL、または抑制配位子: PD L1、L2 PD、ILT3、ILT4。
5. 細胞ペレットからの RNA を隔離し、RNA および量的なリアルタイム PCR (qRT PCR)、ELISA、サイトカイン プロフィール、遺伝子やタンパク質の培養上清中のサンプルをそれぞれ分析します。
   注: たとえば、炎症性サイトカイン: TNF-α、肝腎、edn 誌 1、IL-6、イリノイ-12 と IL-23、または抗炎症サイトカイン: IL 4, IL-10 IL 15、TGF-β 1 と HO-1。

3 TolDCs の機能を評価するIn VitroとIn Vivo

1. T 細胞の同系の拡散の試金
   1. オートクレーブを介してすべての手術器具を滅菌し、クラス II 生物学的安全キャビネット充当安全手順で実験を実行します。
   2. 0.5% ウシ血清アルブミン (BSA) と 500 ml の PBS に 2 ミリメートルの EDTA を使用して MAC バッファーを準備します。0.2 μ m フィルターを介してフィルタ リング バッファーを滅菌します。
      注: は、次の実験中に氷の上バッファーを保持します。
   3. CD4 を取得する⁺ T 細胞、安楽死 OT II T 細胞受容体 (TCR) 遺伝子組換えマウス 8-10 週齢 CO₂箱を用いた。解離性の基板上にマウスを置くし、70% エタノールでリンスします。外科はさみとピンセットを使用して腹部の左側から脾臓を分離します。
   4. 6 cm 培養皿に 2 ml の PBS で脾臓を入れ、40 μ m の細胞ストレーナーを渡すことによって脾臓をミンチに 3 ml シリンジの押し棒の後ろに使用します。
   5. 細胞懸濁液と 300 x g で 5 分間遠心を収集します。
   6. MAC バッファーの 400 μ l 細胞ペレットを再懸濁します。
   7. CD4 の 100 μ l を追加⁺ T 細胞ビオチン抗体カクテル 4 ° C、5 分で。
      注: 抗体カクテル バインド CD4 を除く他のセルタイプに⁺ T 細胞、CD8a、CD11b、CD11c、CD19、CD25、CD45R など (B220)、CD49b (DX5) CD105、反 MHC クラス II、テル-119、および TCRγ/δ。
   8. 10 分のための 4 ° C での MAC バッファー 300 μ l、200 μ l 抗ビオチン ビーズ (材料表) を追加します。
   9. 強磁性球 (材料表) の列で構成される場所と磁気で一緒に事前色分解フィルター フィールド、MAC バッファーの 3 ml でそれをすすいでください。
   10. 9 ml の MAC バッファーを加えて、細胞と 300 × g で 5 分間遠心します。
   11. 3 ml の MAC バッファーで細胞ペレットを再懸濁します、列に適用されます。収集の流れを含む CD4⁺ T 細胞。
   12. MAC バッファーの 3 ml の別列を洗っても流れを収集します。
   13. 脾のパンの Dc を得るためには、CO₂箱を用いた 8-10 週齢 c57bl/6 マウスを安楽死します。解離性の基板上にマウスを置くし、70% エタノールでリンスします。外科はさみとピンセットを使用して腹部の左側から脾臓を分離します。D コラゲナーゼ溶液 2 ml を含む 6 cm 培養皿で脾臓を置く (2 mg/ml コラゲナーゼ D はカルシウム、マグネシウムを含む HBSS で解散)。
   14. 1 ml シリンジ、25 G 針 2 回脾臓にコラゲナーゼ D 溶液 1 ml を注入します。小さなハサミで小さな断片に脾臓をカットします。
   15. 振るし、25 分間室温でインキュベートします。
   16. 5 分間室温で 0.5 M の EDTA の 500 μ l を追加します。
       注: 3.1.13-3.1.14 からのステップは、DCs の収率を増加させるための重要なです。
   17. 今 40 μ m の細胞ストレーナーを渡すことによって脾臓スラリーをミンチし、5 分の 300 × g で遠心分離して細胞懸濁液を収集する 3 ml シリンジの押し棒の裏を使用します。
   18. 350 μ l MAC バッファー、FcR ブロッキング試薬 50 μ l、100 μ l パン樹状細胞ビオチン抗体カクテルの 10 分のための 4 ° C でので細胞ペレットを再懸濁します。
       注: カクテルの Dc によって表されない抗原に対する抗体。
   19. 5 分間 300 x g で MAC バッファーおよび遠心分離機の 9 ml を追加してセルを洗浄します。
   20. MAC バッファーの 800 μ l 細胞ペレットを再懸濁します、10 分のための 4 ° C で反ビオチン ビードの 200 μ l を追加します。
   21. Dc を収集する 3.1.9-3.1.11 からの手順を繰り返します。
   22. 別 3 ml の MAC バッファーの列 2 回洗っても流れを収集します。
   23. 15 分の 37 ° C で 1 μ M CFSE と 100-400 nM CDDO DFPA 37 ° C で 1 時間別々、ラベル CD4⁺ T 細胞 (1 x 10⁷/ml) の有無で 2 x 10⁵ Dc/ml を扱う、PBS で洗浄、2 x 10⁶ T 細胞/ml で最終濃度を取得するボリュームを再調整するとします。
   24. 次に、96 ウェル プレートで共培養 CD4 の CFSE ラベルの同じボリュームの処理樹状細胞の 100 μ l⁺ T 細胞、1:10 を取得する上記の手順から収集した両方の比率。今孵化の 2 〜 3 日後 100 ng/mL 卵白アルブミン (OVA) ペプチド 323-329 あたりとフローサイトメトリーによる T 細胞の CFSE 強度測定を追加します。
       注: セル番号と比による Dc の T 細胞に私たちの以前の仕事³⁷から最適化されています。
2. パッシブを誘発する黒谷を注入することにより EAE パルス ミエリン オリゴデンドロ サイト糖タンパク質 (モグ) (35-55)
   1. 板 1 × 10⁶黒谷/ml 6 ウェル プレートのウェルあたり 2 ml 培養液 100-400 nM の CDDO DFPA の有無で 1 時間インキュベート。
   2. 追加 10 ng/ml LPS のインキュベーターの 24 時間。
   3. 100 μ g/ml 追加 MOG (35-55) のインキュベーターの 4 時間。
   4. 細胞懸濁液を収穫、300 x g で 5 分間遠心します。
   5. PBS の細胞ペレットを再懸濁し、セルをカウントします。
   6. 8-10 週古い女性 c57bl/6 マウス (各後ろ足に 100 μ l) に 2 x 10 の⁶セルの 200 μ l を皮下注入します。
   7. 腎不全注入と 48 日に時間。200 を注入後、百日咳毒素 (PTX) それぞれのマウスの ng。
   8. 4 週連続で毎週 1 回の手順 3.2.6-3.2.7 を繰り返します。
   9. 標準的な基準³⁷ (0.5 ぐったり最後尾、1 ぐったり尾、2 適当な後肢虚弱、3 重度後肢虚弱、4-完全な後肢麻痺、5 四肢または瀕死状態、6 死) を使用して毎日 EAE の臨床症状を評価します。

Results

分化と黒谷の選択:

骨髄前駆細胞は、GM-CSF と il-4 による (図 1 a) の 7 日間の Idc に分化するの存在下で完全 RPMI 培地で培養しました。1 日目、セル サイズが小さかったと球状の形態を示した。3 日目の新鮮な媒体の交換クラスターを形成する細胞を助け、また CD11c の人口を増加する前に PBS で洗浄⁺細胞。4 日目、黒谷はサイズに拡大された、クラスターの形成を開始しました。付着マクロファージも変換され下部に細長い形状を有する板の観察。5 日に黒谷の大規模なサイズのクラスターが形成されます。6 日半付着性と浮動黒谷の多数も観察されました。黒谷は 7 日で収穫され、マウス Dc の特異的マーカーとして CD11c 表現のためのフローサイトメトリーで分析しました。図 ...

Discussion

Idc を生成し、その後 TolDCs にそれらを区別するために再現性をもって使用できる効率的なプロトコルについて述べるし、この可能性があります、TolDC を誘導する新規分子標的薬の能力の評価に適用することを提案します。表現型。このレポートに記載されている、我々 は、我々 まず表面配位子の TolDC 式フローサイトメトリーで分析した、qRT PCR および elisa 法で測定された DC サイトカイン プロフィールの評価が続くシーケンスを追った。最後に、TolDCs の免疫調節機能は T 細胞増殖体外と体内は、MS の臨床マウス EAE モデルを用いた自己免疫を抑制する効力を削減するための能力を示すことによって確認されました。

プロトコル、Idc が生成され、GM-CSF と il-4 によると組み合わせてマウス骨髄前駆体から区別されます。他のプロトコルは、培養液中で Idc⁴⁴を生成するのにフォームのようなチロシン キナーゼ 3 配位子 (Flt3L) を使用しています。Flt3L の使用には、Idc の収量...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CDDO-DFPA(RTA-408)	レアタ・ファーマシューティカル	ズ・イン・ハウスシンセシス	細胞培養
マウス GM-CSF	ペプロテック(株)	315-03	BMDC 分化
マウス IL-4	ペプロテック	214-14	BMDC 分化
脂肪多糖類 (LPS)	Sigma Aldrich Inc.	L2880	細胞培養
&β-メルカプトエタノール	Sigma Aldrich Inc.	516732	細胞培養
百日咳毒素(PTX)	R&Dシステム	3097	EAE誘導
MOG(35–55) ペプチド	21stCentury Biochemicals	in house synthesis	EAE induction
Trypan blue	Gibco, Life Technologies	15250-061	細胞培養
RPMI-1640 plus L-glutamine	ThermoFisher Scientific	11875-093	細胞培養
非必須アミノ酸 (100X)	ThermoFisher Scientific	11140050	細胞培養
HEPES	ThermoFisher Scientific	15630080	細胞培養
ペニシリン/ストレプトマイシン	ThermoFisher Scientific	15140122	Cell culture
40 μm細胞ストレーナー	Corning	352340	細胞単離
PE標識CD80	BD Biosciences	557227	フローサイトメトリー
PE標識CD86	BD Biosciences	555665	フローサイトメトリー
PE標識PD-L1	BioLegend	124307	フローサイトメトリー
APC標識 MHCII	Biotec Inc.	130-112-388	フローサイトメトリー
APC標識CD11c	BD Biosciences	340544	フローサイトメトリー
アイソタイプマッチドPE	Miltenyi Biotec Inc.	130-091-835	フローサイトメトリー
アイソタイプはAPC	Miltenyi Biotec Inc.	130-091-836	フローサイトメトリー
CFSE	BioLegend	423801	T細胞増殖アッセイ
汎樹状細胞単離キット	Miltenyi Biotec Inc.	130-100-875	T細胞増殖アッセイ
FcRブロッキング試薬	Miltenyi Biotec Inc.	130-100-875	T細胞増殖アッセイ
Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail	Miltenyi Biotec Inc.	130-100-875	T細胞増殖アッセイ
抗ビオチンマイクロビーズ	Miltenyi Biotec Inc.	130-100-875	T細胞増殖アッセイ
CD4+ T細胞分離キット	Miltenyi Biotec Inc.	130-104-454	T細胞増殖アッセイ
CD4+ T細胞ビオチン抗体カクテル	Miltenyi Biotec Inc.	130-104-454	T細胞増殖アッセイ
抗ビオチンマイクロビーズ	Miltenyi Biotec Inc.	130-104-454	T細胞増殖アッセイ
ACK溶解バッファー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A1049201	BMDC 分化
1 mlシリンジ	BD Biosciences	309626	T細胞増殖アッセイ
3 mlシリンジ	BD Biosciences	309588	BMDC 分化
25G ニードル	BD Biosciences	309626	T細胞増殖アッセイ
23Gニードル	BDバイオサイエンス	309588	BMDC 分化
BSA	Sigma Aldrich Inc.	A2058	T細胞増殖アッセイ
EDTA	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15575020	T細胞増殖アッセイ
LSカラム	Miltenyi Biotec Inc.	130-042-401	T細胞増殖アッセイ
Pre-Separation Filter	Miltenyi Biotec Inc.	130-095-823	T細胞増殖アッセイ
コラゲナーゼ D	Sigma Aldrich Inc.	11088858001	T細胞増殖アッセイ
HBSS	ThermoFisher Scientific	14025076	T細胞増殖アッセイ
オボアルブミン(OVA)ペプチド323–329	シグマ・アルドリッチ	O1641	T細胞増殖アッセイ
マウスIFN-&γ;TaqMan プローブ	ThermoFisher Scientific	Mm01168134_m1	qRT-PCR
マウス IL-12a TaqMan プローブ	ThermoFisher Scientific	Mm00434165	qRT-PCR
マウス IL-12 p70 DuoSet ELISA	R&Dシステム	DY419-05	ELISA
マウスEDN-1 ELISA	RayBiotech	ELM-EDN1-1	ELISA
TNF-αTaqMan プローブ	ThermoFisher Scientific	Mm00443258	qRT-PCR
マウス TNF-αQuantikine ELISA キット	R&D systems	MTA00B	ELISA
IL-6 TaqMan プローブ	ThermoFisher Scientific	Mm00446190	qRT-PCR
マウス IL-6 Quantikine ELISA キット	R&D systems	M6000B	ELISA
IL-23a TaqMan プローブ	ThermoFisher Scientific	Mm01160011	qRT-PCR
マウス IL-23 DuoSet ELISA	R&D systems	DY1887-05	ELISA
IL-4 TaqMan プローブ	ThermoFisher Scientific	Mm99999154_m1	qRT-PCR
IL-10 TaqMan プローブ	ThermoFisher Scientific	Mm01288386_m1	qRT-PCR
TGF-βTaqMan プローブ	ThermoFisher Scientific	Mm01178820_m1	qRT-PCR
Anti-Heme Oxygenase 1 抗体	Abcam	ab13248	ウェスタンブロッティング
アンチベータ-アクチン抗体	Abcam	ab8226	ウェスタンブロッティング
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad Inc.		qRT-PCR
BD FACSCalibur Cell Analyzer	BD Biosciences		フローサイトメトリー