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方法論記事

ドキソルビシンの球後注射と徐放性アプロチニンによるボリューム保持の予防によるマウスのネフローゼ症候群の誘導

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DOI:

10.3791/57642

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2018年5月6日

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1Department of Internal Medicine, Division of Endocrinology, Diabetology, Vascular Disease, Nephrology and Clinical Chemistry, University Hospital Tübingen, 2Institute of Diabetes Research and Metabolic Diseases (IDM) of the Helmholtz Center Munich, University Tübingen, 3German Center for Diabetes Research (DZD), University Tübingen

この記事について

サマリー

ここでは、ドキソルビシンの急速な球後注射による 129S1/SvImJ マウスにおける実験的ネフローゼ症候群の誘導について述べる。また、尿中のセリン プロテアーゼ活性を阻害し、ナトリウム保持を防ぐためアプロチニンを含む徐放性ペレットとネフローゼ マウスを取り扱っています。

要約

ネフローゼ症候群は、漏出腎臓病の最も極端な現れであるし、大量の蛋白尿、低アルブミン血症、およびナトリウム保持と高脂血症による浮腫によって特徴付けられます。この症候群の病態生理を研究するには、齧歯動物モデルが開発されているは、ドキソルビシン ポドサイトのダメージなどの有害物質の注入に基づいています。マウスでこのモデルに数株のみを受けます。球後洞に急速静注によるドキソルビシンの投与は、野生型 129S1/SvImJ マウス実験的ネフローゼ症候群の機能のナトリウム保持と浮腫を含む人間の病のすべての症状を誘導します。蛋白尿発症後マウスの展示は上皮性ナトリウム チャネル (ENaC) とナトリウム保持の活性化につながる尿セリン プロテアーゼ活性を増加しました。徐放アプロチニン投与による尿のセリーンのプロテアーゼの薬理学的抑制は ENaC 活性化を放棄し、ナトリウム保持を防ぎます。このモデルは、proteasuria、すなわちの病態を検討する最適。、、分解物中の γ サブユニットの ENaC を活性化をさせるアクティブなセリンプロテアーゼの排泄。これは ENaC 活性化と漏出腎のナトリウム保持の主要なメカニズムとしてみなすことができます。

概要

ネフローゼ症候群は、大量の蛋白尿、低アルブミン血症、浮腫、高脂血症、によって特徴付けられるおよび漏出腎臓病の最も極端な症状としてみなすことができます。齧歯動物、実験的ネフローゼ症候群は、アンスラサイクリンまたはピューロマイシン ポドサイト損傷につながるし、人間の微小変化群と巣状分節性 (FSGS)1のような 1 回の注射で誘導できます。後 Frenkらにより 1955 年にその最初の説明です。2、ピューロマイシン ヌクレオシド ネフローゼ症候群 (PAN) ラット多数研究3,4,5,6のネフローゼ症候群の病態生理学を調査する標準的なモデルとなっています。マウスでは、アントラサイクリン系のドキソルビシン7対応するモデルを誘起することができます。しかし、遺伝子は、少なくとも 2 つの遺伝子座8によって決まります強いひずみ依存があります。さらに、漏出応答とネフローゼ症候群9,10のコースの違いがあります。尿蛋白反応球後洞経由 129S1/SvImJ マウスとドキソルビシンの急速な静脈内注入を使用して、ボリュームの保持によって特徴付けられる特にネフローゼ症候群の典型的な特徴を誘導するのに十分な値に達する腹水とほぼナトリウム無料尿7。実験的ネフローゼ症候群におけるナトリウム保持と推定されている遠位尿細管の上皮性ナトリウム チャネル (ENaC) の活性化の結果であるプラスミンの γ サブユニットの 4の分解を引き起こすなど異常フィルターのセリーンのプロテアーゼによって ,11,12。最近では、この概念は、ネフローゼ マウス蛋白分解 ENaC 活性化ナトリウム保持から ENaC ブロッカー アミロライド13として同様に有効であったセリン プロテアーゼ阻害剤アプロチニン投与によって保護された証明されました。遠位尿細管に継続的に提供できるように、アプロチニンは、徐放性皮下埋め込むペレット経由で投与されました。将来の研究は、人間の状況をパラレルに考えられるネフローゼ症候群における蛋白分解 ENaC 活性化を担当するセリンプロテアーゼを識別する必要があります。このため、ドキソルビシン誘発性ネフローゼ症候群は野生型マウスで使用か遺伝子改変マウスに拡大することができます貴重なモデルです。その利点には、薬物の低コスト、管理の良い再現性14低複雑さが含まれて。

この記事で球後洞にドキソルビシンの急速な静脈内注射して尿のセリンプロテアーゼを阻害するアプロチニンを含む徐放性ペレットの注入実験的ネフローゼ症候群の誘導を示すアクティビティ発色アッセイで測定しました。

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プロトコル

ケアと使用の実験動物および動物の福祉のためのドイツの法律のすべての方法を行った健康ガイドの国家機関によると、地方自治体 (Regierungspräsidium テュービンゲン) によって承認されました。

1 球後洞にドキソルビシン注入による実験的ネフローゼ症候群の誘導

  1. マウントされた 30 G カニューレを 0.5 mL シリンジを準備するには、ピストンの停止位置をマーキングします。
  2. 男性 (7.25 μ L/g 本体重量 (bw) 14.5 μ g/g bw ドキソルビシンに等しい) と雌マウス (6.9 μ L/g bw 13.8 μ g/g bw ドキソルビシンと同じ) 朝から体重によるとドキソルビシンの注入量を計算します。
    注: 指定された用量はネフローゼ症候群の誘導に適しています。投与量に若干の変更は、腎糸球体濾過率 (12.6 μ g/g bw ドキソルビシン) の小さな変更だけで軽度の慢性腎臓病から急性腎障害 (15.4 μ g/g bw ドキソルビシン)7、までの重要な別のコースにつながる 15。
  3. 37 ° C の暖かい部屋でドキソルビシン ソリューション (2 μ g/μ L) の計算量を温めます。
    注意: ドキソルビシン飲み込まれ、がんを引き起こす場合有害であります。常にドキソルビシンを使用して場合、手袋を着用し、皮膚への接触を避けます。
  4. マーキング ポイントまでドキソルビシン溶液で注射器を自動設定し、バランスをゼロに設定します。注入量で注射器を埋めるし、注射器を秤量することにより、ボリュームをチェックします。
  5. 5 vol % イソフルラン気化器と 2 L/分の酸素の流れを使用して、マウスを深く narcotize します。
    1. 注射の前に目に軟膏を使用しないでください。オペレーターには、安全と成功の球後注射を実行するための眼窩のクリアな視界が必要があります。
    2. ペダル反射による麻酔のレベルを査定し、注入を開始する前に必要に応じて麻酔配信を調整します。
  6. オペレーターの体とその頭をオペレーターの注入手に直面しているに直面する背中と右横ずれの臥床にマウスを配置します。
    メモ: 手順は、右利きの人のために説明されているため左手で注射を実行する左利きの者だが位置がより簡単に左右逆に右に注入。
  7. 背側と腹側の目に、肌に穏やかな圧力を適用することによって、目のソケットからのマウスの左眼球を突出慎重に。
  8. 内側眼角 (内側眼瞼交連) から左後洞を穿刺します。Mouse´s 眼球との接触を避けてください。
  9. 少し注射器を傾けるし、1 回で全体のボリュームを挿入します。何の抵抗もせず、exopthalmus や注射部位から漏れなどの血管外漏出の徴候もなく、ボリュームが注入されることを確認します。
  10. ドキソルビシンは、毒性の高い物質からチェック福利、少なくとも一日一回モートンとグリフィスらによるとスコア シートを使用して16と特別な注意を払う注射部位。血管外漏出の印 exopthalmus のような場合障害眼瞼閉鎖または壊死の兆候のように腫れや皮膚の病変 occure 注入後や次の日にマウスを安楽死する必要があります。

2. アプロチニンを含む徐放性ペレットの注入

  1. 日と発売期間事前にあたり必要な線量とペレットを注文します。アプロチニン、場合発売 10 日間で 1 日あたり 1 mg の投与量を選択します。
    注: この研究でアプロチニン ペレットには 10 mg の用量が含まれます。
    1. 乾燥条件下でペレットを格納し、湿度への露出を避けます。
  2. 髪はさみ、肌準備はさみ、メス、外科ピンセット、組織ピンセット 2 組、持針器、15 cm monofile 縫合糸非吸収性を含め、外科手術の必要なアイテムを準備します。
    1. 240 ° C で 5 分間熱滅菌器を使用して楽器を殺菌します。楽器を使用する前に室温に達するまで 5 分を待ちます。
      1. 滅菌器のヒント非滅菌の表面を任意の接触を避けます。
      2. 熱いメンツで皮の焼跡を避けるため。
  3. イソフルラン 5 vol %2 L/分の気化器と酸素の流れを使用して 1.5 vol % の順でマウスを narcotize します。
  4. マウスに熱損傷を避けるためにガーゼの層で覆われて地球温暖化デバイスに腹臥位にマウスを配置します。表面温度は 37 ° c. について
  5. 軟膏で目を保護します。
  6. 約 0.5 cm2はさみまたは毛トリマー使用の領域に戻って真ん中の毛を削除し、皮膚消毒に適した消毒剤で毛のない皮を消毒します。ので、できるだけそれは傷に到達するためにマウスのより困難なまま、スレッド終了後、体の温度を保つために以下の髪として削除します。
  7. 鈍製剤を用いた皮下の結合組織に約 1 cm の長さの約 5 mm. 準備左外側ポーチで頭蓋仙骨方向にメスで無毛の皮膚を切開します。
    1. ペダル反射による麻酔のレベルを評価し、手術を開始する前に必要に応じて麻酔の配信を調整します。
  8. 無菌組織ピンセットを使用して準備された左外側ポーチに 1 つのリリース 10 日ペレットを挿入します。平面位置に袋の下部にペレットを残します。
    1. 準備されたパウチは、流体や湿度までへペレットの任意の接触を避けます。
  9. 2-3 縫合糸で皮膚を閉じます。かじるして縫合糸を開くにはマウスをより難しく非常に短いスレッド終了を残すのみ。
  10. かじるで縫合糸の開口部を防ぐために、術後の苦痛を減らすために個別にマウスを配置します。それは麻酔後に十分な意識を取り戻したまでマウスを表示したまま。
    注: 必要はありません術後疼痛管理にこの介入は不快感や痛みの兆候なく忍以来です。また局所鎮痛剤は、鎮痛の 8 h までを提供する閉鎖前に切開ブピバカインのドロップなどお勧め。

3 評価モデルの誘導、ネフローゼ症候群の兆候と幸福

  1. 膀胱をマッサージすることで毎日注射日から反応カップ (1.5 mL) に早朝尿 (8:00) を収集します。
    1. ブラッドフォード蛋白質の試金を使用して、蛋白尿を測定し、クレアチニンに正規化します。
      注: 誘導ネフローゼ症候群、蛋白尿が 120 mg/mg クレアチニン ドキソルビシン投与後の 1 日 7 と 10 の間のしきい値に達する必要がありますで。
  2. 腹水の開発を探します。腹囲や張り出した側面の増加を確認します。
  3. 重量を量る飲料ボトル、食品ペレット マウス朝 (8:00) 毎日。
  4. チェックの幸福、少なくとも一日一回モートンとグリフィスらによればスコア シートを使用しています。16

4. 発色アッセイと尿プロテアーゼの測定

  1. 滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の 15 mL を凍結 chromogenic 基板 S-2251、2 mM の濃度を降伏の 25 mg のボトルに追加することによって基板作業ソリューションを準備します。2 mg/mL の濃度でアプロチニン ソリューションを取得する PBS におけるアプロチニンを溶解します。
    1. -20 ° C で準備されたソリューションを格納します。S-2251 の自動劣化が大幅に遅くなります。黄色の強い色合いを持つ古いソリューションを使用しないでください。
  2. 新鮮な準備または解凍基板作業ソリューションを使用し、37 ° C の熱室内の暖かい。
  3. 室温で尿サンプルを解凍します。
    1. 繰り返される融解と凍結を回避してプロテアーゼの劣化を防ぐため。-20 ° C で尿サンプルを格納します。
  4. 96 マイクロウェル プレート吸光度測定に適したを使用します。各 2 つの井戸の尿の 3 μ L を追加し、井戸に PBS またはアプロチニン溶液 3 μ L 基板作業ソリューションの 50 μ L を追加します。カバー プレートのシーラーとプレート。
  5. 37 ° C 蓄熱体で 60 分間覆われてマイクロウェル プレートを孵化させなさい。
  6. 450 の光学密度を測定マイクロ プレート リーダーを使用して nm。
  7. アプロチニンと尿のアプロチニン敏感なセリン プロテアーゼ活性としてアプロチニン OD 差を取る。
    メモ: 基板は、病態生理学的役割を果たしていない他のプロテアーゼによって裂かれることができるので、アプロチニンとペアになっているサンプルの測定はアッセイの特異性を増加します。

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結果

イソフルラン麻酔導入後ドキソルビシンは左球副鼻腔を介して急速に注入しました。全体のボリューム抵抗、血管外漏出を証明するカニューレの静脈の位置を修正せずに注入された bw 7.25 μ L/g の。マウスは酔いから急速に回復、その日とその後の障害はなかった。特に、左眼の損傷の徴候はありませんでした。ドキソルビシン注射、食べ物や水分摂取後ドキソルビシンの一般毒性効果のため最初の 3 日間落とし、その後に回復した (図 1 a)。注射後最初の 3 日間は、マウスは、inappetence (図 1 b) により体重の 3.4% を失った。5 日目から、マウスは著しい蛋白尿 (図 1 c) (図 1 a, b) 適切な食物摂取にもかかわらず尿中 na 排泄量の大規模な減少が続いたことを開発...

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ディスカッション

ここでは、ドキソルビシン洞の球後注射注入は、蛋白尿、ナトリウム保持、hypoalbumenia 高脂血症と 129S1/SvImJ マウスにおける実験的ネフローゼ症候群を誘導することを示す.ただし、このモデルを使用する場合を考慮する必要がある 2 つの重要な問題があります。まず、モデルの誘導は厳密には用量依存性とドキソルビシン線量 0.3 μ g/g のような小さな偏差マウス15の応答に影響を与えます。14 μ g/g などの低用量で注射されたとき bw ドキソルビシンがあからさまなナトリウムの保持、腹水、高脂血症に関連付けられていないだけ非ネフローゼ蛋白尿を引き起こす以下、または。対照的に、高用量の投与は、急性腎不全、急性死亡率が高いに します。線量とマウスの応答によるとドキソルビシンの原因が人間の急性腎障害 (AKI) に似たコースと慢性腎臓病保存糸球体濾過率 (CKD ステージ G1 3) または進行性慢性腎臓疾患の減少糸球体濾過率 (CKD G4-5) 尿毒症7,15

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

本研究は、ドイツ研究振興協会 (DFG, AR 1092/2-1) からの助成金によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
supplies
BD Micro FINE + U-40 (0.30 mm x 8 mm)BD Deutschland GmbH, Heidelberg, GermanyPZN: 07468060syring
ETHILON*II (5/0, 16 mm, 3/8c, 45 cm)Johnson&Johnson Medical GmbH, Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany)EH7823H縫合糸
名前会社カタログ番号Comments
reagents
aprotinin (6000 KIU/mg)LOXO, Heidelberg, GermanyCAS9087-70-1
Bepanthen, Augen- und NasensalbeBayer Vital GmbH, Leverkusen, GermanyPZN: 1578681膏
Chromogenix S-2251HAEMOCHROM DIAGNOSTICA GmbH, エッセン, ドイツ82 0332 39発色基質
ドキソルビシン (2.0 & micro;g/µL)Cell Pharm、Bad Vilbel、ドイツCAS 25316-40-9ドキソルビシン
イソフルラン CP (1 mL/mL)CP-Pharma、ブルクドルフ、ドイツCAS 26675-46-7イソフルラン
ペレット、マトリックス駆動持続放出 (カスタムメイド)研究アメリカ、サラソタ、FLX-999ペレット
NameCompanyカタログ番号コメント
equipment
ELx808 吸光度 Mikroplate ReaderBioTek, Bad Friedrichshall, GermanyELx808マイクロプレートリーダー
MICROSTERIL - 436B.M.S., Trescore Balneario, ItalyGAL/436sterilizer
Hybridization oven/シェーカーGEヘルスケアUKリミテッド、アマシャムライフサイエンス、リトルチャルフォント、英国RPN 2511ヒートチャンバーThermo
MAT Pro 10 W、15x25 cm、ラッキー爬虫類輸出入ピーターホッホGmbH、ヴァルトキルヒ、ドイツ61201マウス加温装置
軟 革新的な

参考文献

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