Method Article

人間の免疫細胞の三次元可視化のための光シート顕微鏡

DOI:

10.3791/57651

⸱

June 13th, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Biophysics, Center for Integrative Physiology and Molecular Medicine (CIPMM), School of Medicine, Saarland University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、光シート顕微鏡を用いた三次元 (3 D) コラーゲン マトリックスに埋め込まれた免疫細胞を可視化するためのプロトコルを提案する.このプロトコルはまた、3 D の細胞の移動を追跡する方法を詳しく説明します。3 D マトリックスの懸濁細胞の他のタイプのこのプロトコルを用いることができます。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

生体内で、活性化、増殖、およびすべての免疫細胞の機能は、例えばリンパ節の組織の三次元 (3 D) 環境で発生します。最新では、ほとんどの生体外でシステムは細胞培養プレートか coverslips などの 2 次元 (2 D) 表面に依存します。生理学的な条件を最適な模倣の in vitro、単純な 3 D コラーゲン マトリックスを駆使します。コラーゲンは細胞外マトリックス (ECM) の主要なコンポーネントの 1 つと広く 3 D マトリックスを構成するために使用されています。3 D イメージングの (単一の平面照明顕微鏡とも呼ばれる) 最近開発された光シート顕微鏡技術は高い集録速度、大きな浸透深さ、低漂白、photocytotoxicity と紹介されています。さらに、光シート顕微鏡は長期計測のため特に有利です。ここで最適化されたプロトコルは、セットアップ、人間の免疫細胞、例えば主なひと細胞傷害性 T リンパ球 (CTL) を処理する方法を記述してナチュラル キラー (NK) 細胞の生細胞イメージングのための光シート顕微鏡用 3 D コラーゲン マトリックス ・固定サンプル。細胞遊走の画像取得と解析の手順が掲載されています。特定焦点は、重要なステップと試料調製及びデータ解析のための要因を強調表示に与えられます。このプロトコルは、3 D コラーゲン マトリックスの懸濁細胞の他のタイプのために用いることができるし、免疫細胞に制限されていません。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

移行についてほとんど知識細胞に由来する 2 D 実験1,2,3、通常ガラスまたは文化/イメージングのプラスチック表面で実施された料理。しかし、生理学的なシナリオを必要とするほとんどのケースで 3 D 微小環境、細胞外マトリックス (ECM) が決定的な役割を果たしています。ECM は、適切な細胞の形態を維持するために 3 D 構造エッセンシャルを提供するだけでなく、生存信号または多く細胞4、5の最適な機能の方向性の手がかりを提供しています。したがって、3 D 環境が良い細胞機能および生理学的なコンテキストを反映してより良い環境での動作を識別するために必要です。

人間の体内では、ほとんど細胞免疫細胞特には 3 D シナリオの下でその機能を発揮します。たとえば、活性化 T 細胞は標的細胞を探して組織をパトロール、ナイーブ T 細胞はリンパ節の検索中に移行モードと機械に対応する細胞外適応している同種の抗原提示の細胞に移行環境3,6,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ひと由来の材料 (ヒトの血液ドナーからの白血球減少システム室) と本研究の遂行の研究が倫理委員会 (16.4.2015 (84/15; から宣言によって承認されて教授博士レッティグ Stürmer))、対応するガイドラインに従います。

1. 中和コラーゲン溶液の調製 (500 μ L)

  1. 細胞文化のフードの下で滅菌 1.5 mL チューブに冷やしたコラーゲン原液 (10.4 mg/mL) の 400 μ L を転送します。徐々 に 50 μ L の冷蔵チルド コラーゲン原液の 400 μ L に 10 x PBS (pH 7.0 7.3) を追加します。チューブにそっと並べてソリューションをミックスします。
    注: セル文化フードの下でパート 1 のすべてのステップを行ってください。
  2. 1.1 から 500 μ L のコラーゲン溶液に 0.1 M NaOH の 8 μ L を追加します。7.2 7.6 に pH を調整します。PH テスト ストリップを使用 (pH 範囲: 6-10) 混合物の pH 値を確認します。
    注: ボリュームは、コラーゲンの異なるバッチの異なる場合があります。NaOH 溶液が空気の泡を避けるためにゆっくりと混合します。混合物は、コラーゲンのゲル化を避けるために氷の上に保管すべき。
  3. 追加 2 μ L 滅菌 ddH2O 500 μ L に最終巻をするはよく混合し、さら....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T 細胞の移行中に突出部形成は、アクチン依存である非常にダイナミックなプロセスです。主なヒト CTL の突起形成を視覚化するには、一過性11の前に、の前述の CTL におけるアクチン細胞骨格のラベルに mEGFP 融合タンパク質を transfected しました。トランスフェクション後、1 日、細胞は、コラーゲン マトリックスに埋め込まれていた。画像のスタックを取得したすべての 40 光シート顕微鏡を用いた 37 ° C で 1 μ m のステップ サイズの s です。レモンの形をした主要な突起、CTL の人間の形に、移行中に図 2 aおよび附則ムービー 1に示すようは、紡錘状の微細構造による縁。ここに示すだけでなく、1 つの単一のセルをイメージしました実験が大量 (538 μ m3x 450 x 450) (図 2 b)。したがって、光学的品質とこ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ほとんどの in vitroアッセイは 2 D 画面で、たとえば細胞培養プレート、シャーレや coverslips、生体内で細胞、免疫細胞特に経験ほとんど 3次元微小環境に対し行われます。出現の証拠は、2 D と 3 D のシナリオ17で免疫細胞の移行パターンが異なることを示しています。さらに、腫瘍細胞の発現も 2 D と 3 D 培養組織18,19,20で異なっています。したがって、最高の in vitro生理的条件をシミュレートする 3 D コラーゲン マトリックス中のインスタンスの 3D コンテキストで実験を実行する大きな利点です。新開発のアプローチ、特に、光シート蛍光顕微鏡 3 D マトリックス システムで管理された環境条件の下で信頼性が高く、再現性のある実験ができます。

従来レーザー走査.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は金融または商業上の利害を宣言しません。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

研究所臨床 Hemostaseology と輸血ドナー血液を提供するために感謝します。カルメン Hässig と優秀な技術的なヘルプのコーラ Hoxha。LifeAct mEGFP 構造を生成するありがとう修正 pMAX ベクトルのイェンス レッティグ (ザールラント州大学)、ローランド Wedlich-日ソールドナー (ミュンスター大学) 元 LifeAct ルビー構築のため、キリスト教のユンカー (ザールラント州大学)。このプロジェクトは、Sonderforschungsbereich 1027 (プロジェクト A2 ベクレル) と 894 (プロジェクト A1 か) によって賄われていた。DFG によって資金が供給された光シート顕微鏡 (GZ: INST 256/4 19 1 FUGG)。

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
フィブリコール、ウシコラーゲン溶液Advanced Biomatrix #5133-20MLコラーゲンマトリックス
0.5 M NaOH溶液メルク1091381000ブリコール溶液
超低融解アガロースAffymetrix32821-10GM低c[Col]
Dynabeads 未処理のヒトCD8 T細胞キットThermo Fisher11348DPBMCからの初代ヒトCD8+T細胞の単離
ヒトT活性化剤CD3/CD28 T細胞の増殖と活性化サーモフィッシャー11132DCTL集団の活性化
ヒト組換えインターロイキン-2サーモフィッシャーPHC0023培養CTL
の刺激 P3一次溶液キットロンザV4XP-30XXトランスフェクション
&α;-PFN1抗体、ウサギ、IgGAbcamab124904IF
Alexa Fluor 633 PhalloidinThermo FisherA22284IF
CellMask Orange Plasma membrane StainThermo FisherC10045蛍光細胞ラベル
Tween 20SigmaP1379-250mLIF
Triton X-100Eurobio018774IF
DPBS ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水サーモフィッシャー14190250IF
ウシ血清アルブミンΣA9418-100GIF
ヤギ & アルファ;ウサギ 568, IgG, ウサギサーモフィッシャーA-11011IF
ライトシート Z.1 (ライトシート顕微鏡)ZeissN.A.
細胞培養フードThermo FisherHeraSafe KS
細胞培養インキュベーター HERACell 150i サーモフィッシャーN.A.
遠心分離機 5418 and 5452EppendorfN.A.
ピペットエッペンドルフ3123000039、3123000020、3123000063
ピペットチップVWR89079-444、89079-436、89079-452 
15 mLチューブSarstedt 62.554.002
キャピラリー50&マイクロ;LVWR (ブランド)613-3373Zeiss LSFM サンプル調製
毛細血管用プランジャーVWR (ブランド)BRND701934「テフロンチップ付きスタンプ」 LSFM サンプル調製
MColorPhast pH stipsメルク1095430001和フィブリコール
BD Plastipak 1mL シリンジBDZ230723 ALDRICHAlternative sample preparation
Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7)Play-DohN.A.
ImarisファイルコンバータBitplaneは、http://www.bitplane.com イメージングファイルをImarisファイル形式に変換する
Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage)Bitplaneは http://www.bitplane.com 3Dおよび4Dイメージングデータの解析
フィ 中

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Med Res Rev. 27 (2), 149-176 (2007).
  2. Doyle, A. D., Petrie, R. J., Kutys, M. L., Yamada, K. M.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Light sheet Microscopy3D Collagen MatrixHuman Immune CellsCell Migration TrackingSample PreparationImage AcquisitionLive Cell ImagingFixed Sample AnalysisCytotoxic T LymphocytesNatural Killer Cells

Related Articles