ここでは、グラデーションによるナノパターン板の熱ナノイン プリントの創製とナノ構造に対するひと血管内皮前駆細胞の反応のスクリーニング方法のためのプロトコルを提案する.記述されている技術を使用して、物理的な刺激によって細胞の挙動を操作できる足場を生成することが可能です。
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方法論記事
熱ナノイン プリント技術とヒトの内皮細胞コロニー形成細胞の応答のスクリーニングによるグラデーションによるナノパターンの作製
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
ナノトポグラフィ様々 な細胞外マトリックス (Ecm) ボディのまわりで見つけることができ、細胞内反応に重要な規制措置を持っている知られています。しかし、ナノ構造のサイズと適切なスクリーニング ツールの不足のため細胞の応答との関係を決定することは困難です。ここでは、細胞応答の操作の再現性とコスト効果の高いグラデーションによるナノパターン板の開発を示します。熱インプリント法により作製したマスター金型、増加の直径範囲 [120-200 nm (GP 120/200)、200-280 nm (GP 200/280) 280-360 nm (GP 280/360)] のナノピラー グラデーションによるナノパターン板とアルミニウムの陽極酸化 (AAO) を使用して.これらのグラデーションによるナノパターン プレート ECM におけるナノトポグラフィの様々 なサイズを模倣するように設計されていた、画面のひと内皮細胞コロニー形成細胞 (hECFCs) の反応に使われました。このプロトコルでセル工学, ひと末梢血から hECFCs を育成、養殖によるナノパターン プレートに hECFCs のテクニックのグラデーションによるナノパターン プレートの加工手順をについて説明します。
概要
最近では、表面形状の物理的な刺激による細胞の応答細胞工学1,2,3,4の分野で脚光を浴びています。したがって、セル添付ファイル表面5三次元ナノ構造のより多くの注意が注目されています。それはセルの表面認識装置であるインテグリンが機械伝達6を通じて ECM のナノ ・ マイクロ構造による物理的な刺激を送信することが報告されています。この機械的刺激からお問い合わせガイダンス7セルの動作を調整してストレスファイバーと細胞8の剛性に加え、形状を変更する細胞骨格の再編を誘導します。
体内のひと血管内皮前駆細胞 (hEPCs) は、密接に周囲の ECM9の微小環境と対話します。これは剪断応力に由来する血流10限り、ECM の物理的な状態が特定の細胞-マトリックス接着複合体形成のための重要なパラメーターとして機能するということを示します。それが報告されて表....
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プロトコル
本研究は、IRB 号高麗大学校安岩病院で制度の検討委員会によって承認されました。ED170495)。すべてのプロシージャは、ヘルシンキ宣言とその後の改正に基づき行われました。
1. 電解研磨によるアルミニウム (Al) 基板の作製
注意:電解研磨ソリューションは、腐食性、有毒です。ニトリル手袋、ゴーグル白衣など保護具を着用します。発煙のフードでこの手順を実行します。
- エチル アルコール (C2H5ああ、99.9%) を混合することによって電解研磨ソリューションを準備, 過塩素酸 (山積みし4 60%) 1 L ダブル ジャケット ビーカーで (C2H5OH:HClO4 = 4:1)。
- サーキュレータにダブル ジャケット ビーカーを接続し、7 ° C の温度を設定磁性攪拌器にダブル ジャケット ビーカーを置きます。7 ° c. に温度が低下するまで、少なくとも 30 分間かき混ぜてソリューションを残す
- 超高純度アルミ板に没頭 (99.999%、20 × 50 × 1 mm3) とわに口クリップと銅線を使用して電解研磨溶液にカーボン カウンター電極。アルミ板と互いに直面するカーボン....
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結果
図 1では、型および位置に従って作製したグラデーション AAO 金型の SEM 像を示しています。図 2は、グラデーションによるナノパターン板定期的に丸めナノピラーの SEM 画像と図 3は、ナノピラー直径の定量化データ。表 1は、作製したナノピラーの特性を示します。
図 4 aは、血液由来 hECFCs の耕作のスキームを示しています。図 4Bショー thecultivated hECFCs の位相コントラスト。図 4
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ディスカッション
しばしば AAO の作製は亀裂などと書き込み、毛穴の不規則な形状の欠陥に苦しみます。これらの欠陥の主な理由は、陽極酸化される金属基板の性質と電解質21の抵抗によって強く影響を受ける電解のブレーク ダウンと呼ばれます。電解質の抵抗はその温度により異なります、電極から連続的に熱を排除する高電圧陽極酸化条件で安定した電解質の位置の温度を維持するために重要なポイントです。このプロトコルでは増田の 2 段階陽極22,23を変更することにより AAO 金型を作製しました。メチルアルコールでほぼ半分の電解質を置き換えるだけでなく電解質が低温で凍結するを防ぐ、また細孔24の下の蒸発によって熱の電極を奪います。磁性攪拌器ではなくオーバーヘッド攪拌機・ インペラを使用する理由は、温度管理を実現してもです。典型的な電磁攪拌機は磁気バーの偶発的なずれにより長期的な操作中にアイドリングの確率が高い。この問題は、不適切な循環電解質の温度を上げると燃焼につ.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
この仕事は基本的な科学研究開発プログラムを通じて、国立研究財団の韓国 (NRF) 文部省、科学および技術 (MEST) [NRF 2015R1D1A1A01060397] バイオ ・医療技術開発によって資金を供給に支えられ科学省 ICT ・将来計画 [NRF 2017M3A9C6029563] によって資金を供給された NRF のプログラムです。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 過塩素酸60% | 大中化学品&金属 | 6512-4100 | |
| エチルアルコール、絶対99.9% | 大中化学&金属 | 4118-4100 | |
| リン酸 85% | 大中 化学品 &金属 | 6532-4400 | |
| メチルアルコール99.5% | 大中化学&大中化学薬品金属 | 5558-4400 | |
| 酸化クロム(VI) | Daejung Chemicals &金属 | 2558-4400 | |
| 硫酸 95% | 大中 化学品 &金属 | 7781-4100 | |
| 過酸化水素 30% | 大中 化学品 &金属 | 4104-4400 | |
| n-ヘキサン 95% | 大中 化学品 &金属 | 4081-4400 | |
| トルエン 99.5% | 大中 化学品 &金属 | 8541-4400 | |
| (ヘプタデカフルオロ-1,1,2,2,-テトラヒドロデシル)ジメチルクロロシラン | ゲレスト | SIH5840.4 | 湿度に敏感な |
| メトキシノナフルオロブタン 99% | シグマアルドリッチ | 464309 | |
| コラーゲン溶液 | ステムセル | #4902 | |
| ゼラチン | シグマアルドリッチ | G1890 | タンパク質コーティング溶液 |
| Ficoll-Paque | GE Heathcare | 17-1440-03 | 親水性多糖類溶液 |
| EGM-2MV | ロンザ | CC-3202 | 内皮細胞増殖培地 |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | Gibco | 15140-122 | |
| リン酸緩衝生理食塩水 | Gibco | 10010031 | |
| ウシ胎児血清 | Gibco | 12483-020 | |
| パラホルムアルデヒド | Σ aldrich | P6148 | |
| グルタルアルデヒド | Σ aldrich | G5882-100ML | |
| 四酸化オスミウム | Σ aldrich | 201030-1G | |
| ヘキサメチルジシラザン Σ | aldrich | 440191 | |
| Triton X-100 | Σ aldrich | X100-100ML | オクチルフェノール エトキシレート |
| ヤギ血清 | Gibco | 26050-088 | |
| 抗ヒトビンキュリン一次抗体 | Sigma aldrich | V9131 | |
| F-actin probe | Molecular Probes | A12379 | Fluorescence-conjugated phalloidin |
| Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG抗体 | Molecular Probes | A11001 | 蛍光標識二次抗体 |
| 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール | Sigma aldrich | D9542 | |
| 実装媒体 | DAKO | S3023 | |
| 抗ヒトvWF一次抗体 | DAKO | A0082 | |
| 反人間 CD144一次抗体 | BDバイオサイエンス | #555661 | |
| Eponate 12™BDMA | テッドペラ | 18012 | エポキシ樹脂 |
| ラニルアセテート、25g | テッドペラ | 19481 | |
| クエン酸鉛、三水和物、10g | テッドペラ | 19312 | |
| 超純アルミニウムプレート | |||
| ポリスチレンシート | Goodfellow | ST313120 | |
| 8.0 "シリコンウェーハ | シルトロン | 29-01024-03 | 面ポリッシュ、725µm厚 |
| 真空デシケーター、4.4 L | Kartell | KA.230 | |
| 真空ポンプ | 真空 | V3。VOP100 | |
| 電源 | ユニコーンテック | UDP-3003 | |
| マグネチックスターラー | ダイハンサイエンティフィック | SL. | |
| オーバーヘッドスターラー | ダイハン サイエンティフィック | HT120DXサイ | |
| レーター | ダイハン サイエンティフィック | WCR-P12 | |
| リニアムービングステージ | ザバー | A-LSQ300A-E01-KT07 | |
| アングルブラケット、90度 | ザバー | AB90M | リニアムービングステージ |
| PMP鉗子の付属品、145 mm | Vitlab | 67995 | 非金属ピンセット |
| PTFEビーカー 250mL | カウイ | CW007.25 | |
| 超音波洗浄機 | ブランソン | B2510MTH | |
| PCBカッター | 宝山工具 工業用 | K-110 | |
| ナノインプリント装置 | ナノネックス | NX-2000 | |
| 酸素プラズマ発生装置 | フェムトサイエンス | CUTE | |
| 低温滅菌器 | Lowtem | Crystal 50 | |
| CO2インキュベーター | パナソニック | MCO-18AC | |
| Confoal レーザー走査顕微鏡 | Carl Zeiss | LSM700 | |
| 走査型電子顕微鏡 | JEOL | JSM6701 | |
| 透過型電子顕微鏡 | Hitachi | H-7500 |
参考文献
- Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nature materials. 13 (6), 558-569 (2014).
- Qian, W., Gong, L., Cui, X., Zhang, Z., Bajpai, A., Liu, C., Castillo, A., Teo, J. C., Chen, W.
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