方法論記事

サイクリン依存性キナーゼ 1 の同定の in Vitroキナーゼによって特定のリン酸化のサイトの試金します。

DOI：

10.3791/57674

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2018年5月3日

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, State University of New York at Binghamton

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

サイクリン依存性キナーゼ 1 (Cdk1) 細胞周期 G2 段階で活性化し、多くの細胞経路を調節します。この重要なキナーゼの細胞内標的を確立するため Cdk1 固有のリン酸化部位の同定を可能にする Cdk1 と体外キナーゼ試金のためのプロトコルを紹介します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

サイクリン依存性キナーゼ 1 (Cdk1) は、すべての真核生物の細胞周期のマスター コント ローラー; プロテオームの推定 8 ~ 13% を廃止ただし、ひと細胞で特に Cdk1 の特定のターゲットの数はまだ低いです。Cdk1 固有のリン酸化部位の同定は、機械論的洞察 Cdk1 が細胞周期を制御する方法を提供するように重要です。細胞周期制御は忠実な染色体分配に重要なこの複雑なプロセスの欠陥染色体異常やがんに 。

ここでは、Cdk1 のリン酸化サイトを識別するために使用される生体外でキナーゼ分析について述べる。このアッセイで浄化された蛋白質リン酸化培養では, SDS-PAGE による市販人間 Cdk1/サイクリン b. 成功によってリン酸化を確認し、質量分析法によるリン酸化のサイトの識別後。プローブ間の相互作用特定のリン酸化のサイトの機能の検証のキナーゼ試金および結合の試金の適切な高純度、均一なタンパク質製剤をもたらす浄化のプロトコルについても述べる古典的な核局在化信号 (cNLS) とその核輸送受容体 karyopherin α。実験計画を支援するためには、タンパク質から Cdk1 固有のリン酸化部位の予測のためのアプローチを確認します。一緒にこれらのプロトコルは Cdk1 のリン酸化サイトを生成でき、Cdk1 が細胞周期を制御する方法を解明する非常に強力なアプローチを提示します。このメソッドは浄化された蛋白質、細胞機能の研究と組み合わせる場合は特に任意モデル有機体そして利回り信頼性の高い結果に適用できます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

キナーゼは、ATP からのリン酸基を基板に転送し、多くの細胞プロセスを調整する酵素です。このリン酸化は可逆的で、高速、2 つの負電荷を追加しますと自由エネルギーを格納、セルで使用される最も一般的な修飾の一つです。Cdk1 はまたとして知られている細胞分裂周期蛋白質 2 相同物 (cdc2) マスター コント ローラーではすべて真核生物1,2,3,4、5、細胞周期では、廃止、プロテオーム6、7の推定 8 ~ 13%。

一方、最近のプロテオミクス研究は、タンパク質においてはほとんどの場合、多くのリン酸化サイトを識別したキナーゼのこれらの変更のための責任は不明です。ヒトの細胞、特に、知られている Cdk1 ターゲット数は低7です。Cdk1 が細胞周期を制御する方法を確立する解明が可能、Cdk1 固有のリン酸化部位の同定が重要です。細胞周期制御は忠実な染色体分配と細胞分裂のために重要、無数の細胞プロセスのこの重要な生理機能をサポートするために行う必要があります。これは転写や細胞構造と核膜、染色体凝縮と紡錘アセンブリの分解など、組織における劇的な再編と同様に有糸分裂、発症する前に翻訳を停止含まれています。規制緩和とこれらのプロセスでのエラーは、がん、先天異常、または有糸分裂細胞死を引き起こします。RO 3306 など Cdk1 の特異的阻害剤が開発8、機能研究の強力なツールを提供してこれらの阻害物質は、現在がん治療の臨床試験 (レビューの9を参照してください)。

ここでは、Cdk1 固有のリン酸化部位の同定を可能にする生体外でキナーゼ分析について述べる。このアッセイ市販人間 Cdk1/サイクリン B を使用して体外に精製されたターゲットのタンパク質をリン酸化します。基質のリン酸化その質量を増加され、2 つの負電荷;したがって、成功したリン酸化を SDS-PAGE の蛋白質ゲルのバンドの上方シフトを確認しました。Cdk1 固有のリン酸化サイトその後試験管内でリン酸化蛋白質の質量分析によって識別されます。実験計画を支援するためには、また計算のツールおよび蛋白質シーケンスから Cdk1 固有のリン酸化部位の予測を参照を確認します。さらに、高純度、均一なタンパク質製剤キナーゼのアッセイに最適をもたらすの浄化のプロトコルについても述べる。最後に、特定のリン酸化のサイトの機能の研究によって検証が必要、単純な結合の試金はその目的のためここに記載されています。組み合わせることで、これは Cdk1 のリン酸化サイトを生成して Cdk1 が細胞周期7,10,11を制御する方法に解明をしたりできるように非常に強力なアプローチです。このメソッドは、浄化された蛋白質に依存しているので、モデル有機体および利回り信頼性の高い結果に適用できます。得られるリン酸化サイト、体外の機能検証を推奨するただし、細胞局在や相互作用パートナー翻訳後修飾など、場所に追加的な規制メカニズムを持っていることアクセス可能または Cdk1 による認識のリン酸化サイトをレンダリング可能性があります。

Cdk1 は成っている (Ser/スレオニン-プロ-X-Lys/アルゼンチン)、X は任意の残基、セリンまたはトレオニンのリン酸化のサイトは、コンセンサスのリン酸化部位を認識しています。+1 の位置にプロリンの存在は認識のために特に重要です。また、塩基性残基、+2 や +3 位置に適して、+3 で Lys または Arg を含むほとんどの Cdk1 のリン酸化サイトを6,12の位置します。

Cdk1 活性化が堅く調整され、有糸分裂1,2,3,4、5の発症に 。サイクリン依存性キナーゼの活動は一般に振動する細胞周期13全体レベルで個別のサイクリン (サイクリン A、B、C、D、および E の人間) との関連付けに依存します。Cdk1 式細胞周期で一定であるし、サイクリン A ととして B5,13,14,15をサイクリン調節サブユニットとの関連付けに依存してその活動の規制同様のポスト翻訳の修正。Cdk1/サイクリン B の複合体の形成は、キナーゼ活性化5,14,15,16,17,18に必要です。G2 段階でサイクリン B は細胞質で翻訳され Cdk15,14,15,16,17,18; に結合核にインポートただし、Cdk1/サイクリン B は Myt1 人間 Cdk1 抑制キナーゼによって残基 Thr14 と Tyr15 のリン酸化 (膜準チロシン、スレオニン-固有抑制 cdc2 キナーゼ) と Wee1、それぞれ19、によって不活化保持されます。 20,21。遅い G2 段階で細胞分裂サイクル 25 ホスファターゼ (cdc25) による Thr14 と Tyr15 の脱燐酸化が Cdk1/サイクリン B の複合体のキナーゼ活動をアクティブにし、有糸分裂12,14,の開始をトリガー18,20,22,23. Thr161 リン酸化 Cdk1/サイクリン B の活性化にも必要ですし、Cdk 活性化キナーゼ (CAK)18Cdk7 によって媒介されます。後期ではサイクリン B の分解は、有糸分裂24,25からの出口を許可する Cdk1 を不活性化します。Cdk1/サイクリン B の活性化は、複雑なプロセスである従って。ここで提示されたプロトコルが市販 Cdk1/サイクリン B で実行されます。昆虫細胞で、この複合体の組み換え式の中にそれは活性生体内で内因性キナーゼ14,20清められた状態でアクティブなままになります。結果、組換え人間 Cdk1/サイクリン B キナーゼ試金体外に適しています。

ここでは、ひと動原体タンパク質 F (CENP F)10の Cdk1 固有のリン酸化部位の同定のためのプロトコルについて述べる。CENP F (G1、S 期) 中間期のほとんどの間、核に存在すると Cdk1 依存方法10, G2 の相26,27,28に細胞質にエクスポートは、動原体タンパク質である11. 核局在化二部 cNLS26によって授与されます。cNLSs は、karyopherin β と RanGDP、cNLS 貨物の核29へのインポートを容易にする核輸送因子 karyopherin α によって認識されます。G2 段階で核の輸出は、不明な輸出経路10を介して促進されます。CENP F は、細胞質に存在する、それが核封筒に募集、順番モーター蛋白質ダイニンの複雑な30,31を募集します。この経路は、有糸分裂開始のタイミングが正しいと脳で根本的なプロセスのために重要であるダイニン依存方法で紡錘アセンブリの最初の段階の間に中心体にそれぞれの核を配置することが重要開発30,31,32。G2 段階で開始、CENP F も完成、動原体に忠実な染色体分離27,28,33,34,35 に重要な役割をしています。.これらの経路の重要な規制ステップは Cdk110,11に依存している G2 段階で CENP F の核輸出です。CENP F の cNLS で Cdk1 固有のリン酸化部位の同定のためのプロトコルをご紹介します。これらのサイトの Phosphomimetic 突然変異は Cdk1/サイクリン B は、直接、cNLS10のリン酸化による CENP F の局在を調節することを示唆している CENP-F の核輸入に遅くなります。

全体的にみて、キナーゼ Cdk1。 精製された標的タンパク質リン酸化は体外市販 Cdk1/サイクリン B 複合体とリン酸化のサイトでこの体外のキナーゼ試金の特定の基板の識別を可能します。その後、質量分析によって識別されます。Cdk1 固有のリン酸化部位の同定は、Cdk1 が細胞周期を制御する方法を明らかにする機構の研究をサポートしています。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. タンパク質シーケンスから Cdk1 固有のリン酸化部位の予測

  1. キナーゼ試金を開始、する前に予測 Cdk1 特定のリン酸化のサイトのために蛋白質順序を分析し、未知のキナーゼの特異性と確立された実験的リン酸化のサイトの文献を検索します。次のツール、データベース、および要約されている参照を使用します。
    1. Igp 3.0 ソフトウェア36,37 (http://gps.biocuckoo.org/online_full.php) を使用して、ターゲット蛋白質シーケンスの Cdk1 のリン酸化サイトを予測します。二次構造と表面のアクセシビリティの注釈を含む包括的な予測のためのここのリンクを使用します。
    2. ソフトウェアで FASTA 形式で蛋白質シーケンスを入力します。キナーゼの特異性は、セリン/スレオニンキナーゼ、 CMGC、 CDK、 CDC2 CDK1を確認し、他のすべての特異性をオフに。しきい値として媒体を選択し、 [送信] ボタンをクリックします。
    3. Cdk1 コンセンサス リン酸化サイト (Ser/スレオニン-プロ-X-Lys/Arg) と結果の予測サイトを比較します。
    4. 重要なは、(いくつかの Cdk1 基板は最小のサイト (Ser/スレオニン-Pro)6,12にリン酸化) リン酸残基の横にあるプロリンの予測サイトを確認します。また、塩基性残基、+3 位置6,12に Lys または Arg を含むほとんどの Cdk1 のリン酸化サイトを持つ、+2 や +3 位置で優先設定されているを確認します。
  2. またサイトが完全な合意サイトの存在として認識、アクセス可能なことを確認は Cdk1 リン酸化のために十分ではありません。
    1. 検査表面のアクセシビリティと、アクセスするサイトが予想されるかどうかの状態は Igp の出力で二次構造予測注釈蛋白質の N と C テルミニは、多くの場合柔軟性とリン酸化のためアクセス。
    2. 標的タンパク質の x 線構造が利用可能な場合、構造内での位置を調べることによって推定されるリン酸化のサイトのアクセシビリティをチェックします。
  3. UniProtKB/スイス人 Prot データベース38 (http://www.uniprot.org) を使用して未知のキナーゼの特異性と確立された実験的リン酸化のサイトの文献を検索します。
    1. 検索ボックスにタンパク質の名前を入力し、検索ボタンをクリックします。正しい順序のエントリを選択します。リン酸化サイトは注釈、アミノ酸の変更セクションで参照されます。
    2. Cdk1 は細胞周期 G2 期にアクティブになりますので特に有用である細胞ライン7,39,40, 分裂のエキスのプロテオミクス研究を検索します。
  4. NLSmapper (オプション) による二部 cNLS を識別します。
    注: 細胞質と核の間シャトル タンパク質、細胞局在の規則のための共通のメカニズム Cdk1 による主要なモチーフの-1 の位置に二部 cNLS のリン酸化です。リン酸化は、G2 段階10,41,42,43の核局在化を廃止します。
    1. このような往復の蛋白質 NLSmapper43 (http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi) 蛋白質シーケンスの cNLS を特定します。シーケンス ボックスでテキストとして蛋白質シーケンスを貼り付ける、カットオフ スコアは 5.0 を選択し、地域全体で NLS を検索するを選択します。NLS の予測] ボタンをクリックします。
    2. マイナーなモチーフ (Lys Arg)、少なくとも 10 残基のリンカーと主要なモチーフ (Lys-Lys/Arg-X-Lys/アルゼンチン)、X は負荷電されていない任意の残基で構成される二部 cNLS のコンセンサス シーケンスに対して結果予測 cNLS を比較します。.
    3. 予測 Cdk1 リン酸化サイト (*)、リンカーの-1 の位置の主要なモチーフに隣接に位置するかどうかを確認してください: Ser/Thr*-Pro/X-X-Lys-Lys/Arg-X-Lys/Arg。
      注: Cdk1 による-1 位で二部 cNLS のリン酸化は、いくつか往復タンパク質10,41,42,の局在制御機構として設立されました43。

2.大腸菌の組換え蛋白質の表現

  1. エシェリヒア属大腸菌の組換え蛋白質の表現の手順 2.1.1-2.1.2 から発現プラスミドを使用します。
    1. 人間 CENP F (2,987 3,065 残基) の式を作成を作成する挿入にポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) による DNA のフラグメントを増幅することでフルレングスの CENP F 構造から生成 (GenBank 加盟: U19769.1)。次のプライマーを使用して、: AGTCGGGGATCCCAGCAATCTAAACAAGATTCCCG と AGTCGGCTCGAGTCATTATTCTGCAGGGTGAATACCACTCATG。
      メモ: フルレングスの人間 CENP F プラスミドは、X. 朱先生、研究所生物科学、中国、上海、中国科学院によって提供された寛大。
      1. 病原と XhoI 制限のサイトと pGEX6p1 ベクトルに挿入を複製します。CENP F (2,987 3,065 残基) の N 末端グルタチオン s-トランスフェラーゼ (GST) 融合蛋白質を表現するのにには、このプラスミドを使用します。
        注: GST タグはオフ (今後 PS プロテアーゼと呼ばれる) PreScission プロテアーゼによって切断することができます。
    2. Karyopherin α 式構築人間のフルレングスの karyopherin α 2 cDNA テンプレートから PCR によって DNA のフラグメントを増幅することによって挿入を生成 (シーケンス加盟 NM_002264.3; プライマー: GCACTACATATGTCCACCAACGAGAATGCTAATA とTCACGCCTCGAGTTATCAAAAGTTAAAGGTCCCAGGAGCC)。
      注: アイソ フォームの類似性のため α 2 に位置するこの karyopherin の構築以降の本文と呼びます karyopherin α。
      1. NdeI と XhoI 制限のサイトと pET28a プレ ベクトルに挿入を複製します。
        注: これは、PS のプロテアーゼ切断部位をコードするシーケンスに置き換えられましたトロンビン胸の谷間サイトの系列符号化修正 pET28a ベクトルです。彼の6N ターミナルと karyopherin α の融合蛋白質を表現するこのプラスミドを使用-タグ、場所、彼の6-タグは PS プロテアーゼを切断することができます。
  2. ターゲット蛋白質の点突然変異を作成するには、キットのサイト指示された突然変異誘発を実行します。
  3. それに続く浄化のエシェリヒア属大腸菌の組換え蛋白質を表現します。
    1. 以下の在庫を作る: 50 mg/mL カナマイシン (1:1, 000 の原液)、70% エタノール (1:1, 000) 100 mg/mL アンピシリン (1:1, 000) で 1 M イソプロピル β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG; 1:5, 000) 35 mg/mL クロラムフェニ コール。
    2. 無菌株式をフィルター処理し、-20 ° C で保存IPTG の凍結融解の繰り返しは避けてください。
    3. 製造元の指示に従ってロゼッタ 2 (DE3) pLysS 株エシェリヒア属大腸菌の有能なセルの 50 μ L に 1 μ L の発現プラスミドを変換します。
    4. ルリア ベルターニカミラ (LB) 寒天培地クロラムフェニ コール (35 μ g/mL の LB)、CENP F 構造やクロラムフェニ コール karyopherin α コンストラクトのカナマイシン (50 μ G/ml 文化) アンピシリン (100 μ g/mL の LB) 上のカルチャをプレートします。37 ° C で 12-20 h の版を孵化させなさい
    5. 単一コロニーをピックアップし、(手順 2.3.4 参照) 抗生物質を添加した LB の 50 mL を接種します。37 ° C で 12-20 h 160 180 rpm で揺れながら清酒を孵化させなさい
    6. 準備 1 L LB の 2,800 mL 中困惑 Fernbach フラスコ。清酒とオートクレーブごとに 2 つのフラスコを作ること。通気できるように、2/3 以上フラスコ ボリュームにフラスコを記入しないでください。エルレンマイヤー フラスコは同様に使用することができます。
    7. 抗生物質 (手順 2.3.4) と冷却ポンド追加 20 mL の LB 培地 1 L あたり清酒の 1 L あたり無菌ろ過の 40% (w/v) グルコース溶液の 10 mL を追加します。
      注: 吸光度 600 nm の 1:10、清酒の希釈が 0.15 0.2 の間にする必要があります。
    8. 37 ° C で 160 180 rpm で揺れながら、フラスコを孵化させなさい600 で吸光度を測定定期的に細菌文化の nm。吸光度 0.5 0.6 に達すると、0.2 mM IPTG を追加することでタンパク質の発現を誘導する (LB 培地 1 L あたり 1 M 在庫の 200 μ L)。
      注: 正しい吸光度で細胞が誘導されることが重要です。通常この段階に到達するための 3-4 時間かかります。
    9. 37 ° C で 3 時間を振りながら、フラスコを孵化させなさい(15 分、g、4 ° C、スイング アウト ローター × 4,100) 遠心分離によって細胞を収穫します。上清を捨てます。20 mL GST 結合バッファー (CENP F) または彼の6細胞ペレットを再懸濁します-文化の 1 L あたりの結合バッファー (karyopherin α)。-80 ° C で細胞を保存します。
      1. GST 結合バッファー (25 ° C、150 mM 1 mM ジチオトレイトール (DTT) 塩化ナトリウム 0.5 ミリメートルの EDTA 10 mM Tris 8.0 pH) を準備し、彼の6-バッファー (25 ° C、250 mM の NaCl、5 mM のイミダゾール pH 8.0、5 mM β-メルカプトエタノール (BME) 10 mM Tris 8.0 pH) を事前にバインドします。

3. グルタチオン アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー、ゲルろ過による組換えタンパク質の精製

  1. 以下の在庫を作る: 1 M DTT (1:1, 000 在庫、滅菌 0.2 μ M の孔径、フィルター、脱気);250 mM 特異フッ化物 (PMSF; ジメチルスルホキシドの縮尺株式)。-20 ° C にてストア凍結融解の繰り返しは避けてください。
  2. 次のバッファーを作るし、4 ° C にそれらを冷却
    1. 0.5 mM EDTA 150 mM の NaCl、1 mM DTT、25 ° C で 10 mM Tris pH 8.0 を使用してGST 結合バッファーを準備します。
    2. 10 mM 減少グルタチオン (0.15 g/50 mL) 150 mM の NaCl、1 mM DTT 25 ° C で 50 mM Tris pH 8.0 のバッファーに溶解を使用してGST 溶出バッファーを準備します。最後のバッファーの pH が 8.0 であることを確認、それが作られた同じ日に使用します。
    3. 25 ° c、60 mM の NaCl、2 mM DTT 20 mM Tris pH 7.5 を使用してゲル濾過バッファーを準備します。無菌フィルター バッファー ボトル上部フィルター (0.2 μ M 孔サイズ)。15 分 (-6 psi) 真空下で攪拌しながらバッファーをドガします。
    4. 使用の日にすべての上記のバッファーに DTT を追加します。
  3. CENP F 構成要素を含むセクション 2 からセルを解凍します。GST 結合バッファーと 40 mL にボリュームを調整します。1 mM DTT、0.25 mM PMSF、0.5 mM EDTA (0.5 M ストック溶液、pH 8.0) を追加 7 mg benzamidine 塩酸 (1 mM)、および 40 mg D/L メチオニン。
    注: 分解を減らすためには、すべて手順を実行 4 ° c、寒い部屋で好ましくない限り。すべての回で氷上精製蛋白、溶解液、細胞を維持し、プロテアーゼ阻害剤を追加します。システインとメチオニン残基の酸化を防ぐためには、実験の日に DTT やメチオニンなどの還元剤を追加します。分解を減らすためには、手順をすぐに働きます。
  4. Lyseとして超音波発生装置で細胞に従います。ライセートのガラス ビーカーを記入し、氷の水のお風呂に浸します。文化 (100 W (50%) 出力/振幅、10 s パルスと 10 s の残りのサイクルでの 1 分 40 秒) の超音波照射します。超音波処理後 250 μ M PMSF を追加します。細胞ライセートを検査、外観より透明性と粘性できなく必要があります。
  5. クリア4 ° C、25 分 40,000 12,000 × g で遠心分離によってライセート丸底遠心チューブと固定角ロータを使用します。
  6. 平衡を実行するには、使い捨て可能なクロマトグラフィー コラムにグルタチオン agarose 1:1 液 2 mL を追加します。結果の列の 1 つの mL の音量をに。25 ml の純水と 25 mL の GST 結合バッファーの列を洗います。
  7. バインドを次のように実行します。ライセート ペレットからデカント、冷蔵室またはコールド ボックスで作業します。溶解液 (0.2 μ m 孔サイズ) をフィルターし、接続の列にそれを注ぐ。列をキャップし、優しくならびに 4 ° C で 30 分間インキュベート
  8. 洗って列、ラックの上に置いた樹脂、解決し、流れを収集ができます。25 mL の GST 結合バッファーで 2 回コラムを洗浄します。
  9. 蛋白質分解開裂によって溶出します。
    1. 列に接続します。GST 結合バッファーの 400 μ L と PS プロテアーゼ (2 mg/mL 在庫 1,000 U/mg の活動かラボで精製または購入;材料の表を参照してください) の 250 μ L を追加します。
    2. バッファーで樹脂を再懸濁しますゆっくり旋回し、列をキャップします。4 ° C で 16-20 時間の列を孵化させなさい列から生劈開 CENP F フラグメントを溶出する GST 結合バッファーの 4 mL を加えます。
  10. グルタチオンの溶出
    1. 列を接続 4 mL の GST 溶出バッファー (4 列ボリューム) を追加して、バインドされた GST タグを溶出する 10 分間インキュベートします。溶出液を収集します。メーカーの使用説明、再利用の前に列を再生成します。
  11. PS プロテアーゼ溶出分数と 16% アクリルアミドゲルでSDS ページでグルタチオンの溶出割合を分析します。45 分染色ブルーによるゲルの 25 V/cm で電気泳動を実行します。PS プロテアーゼ グルタチオン分数が裂かれた GST タグを含むに対し精製 CENP F フラグメントが含まれます。蛋白質分解開裂の効率を評価するためにゲルを検査します。
  12. 遠心ろ過ユニットを用いた 3 kDa の分子量カットオフ 0.5 mL にプロテアーゼの溶出液を集中PS (材料の表を参照してください)。フィルターの上部コンパートメントで溶出液を追加し、4 ° C (スイング アウト回転子) サンプルを集中する 4,100 x g で 10 〜 15 分刻みで遠心分離します。各インクリメント後ピペッティングで混ぜます。
  13. 適切なゲルろ過カラムを接続 (購入情報材料の表を参照) タンパク質の高速液体クロマトグラフィー (FPLC) システムに 1 列ゲルろ過バッファー量と平衡と。
  14. 遠心機 (20 分、21,700 × g、4 ° C) で集中 CENP F フラグメントを遠心します。挿入サンプル列に 1 列ゲルろ過バッファー量と溶出し、。0.6 mL の一部分を収集します。
    注: ゲル濾過のバッファーは、後続のキナーゼ試金との互換性に最適です。標的タンパク質がこのバッファーで安定している場合をテストします。それが安定していない場合より多くの塩化ナトリウムを追加してください。
  15. SDS ページ (手順 3.11) によってピーク画分を分析します。純粋な CENP F 断片を含むピーク画分をプールします。3.3 mg/ml (ステップ 3.12)精製 CENP F フラグメントに集中をします。SDS ページ (手順 3.11) によって精製された CENP F 断片を分析します。
  16. 蛋白質の集中の決定
    1. 純水サンプル 1: 100 を希釈し、石英マイクロ キュベットに配置。分光光度計で 220-300 nm の波長範囲でスペクトルを記録。
      注: タンパク質の濃度 c (mg/mL) は次の式から派生しました。
      figure-protocol-1
  17. 浄化された蛋白質の 50 μ 因数は、0.5 mL マイクロ チューブとフラッシュ凍結液体窒素でそれら。因数-80 ° C で保存します。

4. Ni NTA アフィニ ティー ・ クロマトグラフィーによる組換えタンパク質の精製

  1. 次のバッファーを作るし、4 ° C に冷却
    1. 準備、彼の6-結合バッファー 250 mM NaCl、5 mM のイミダゾール pH 8.0、5 mM BME 25 ° C で 10 mM Tris pH 8.0 を使用します。BME を使用の日にすべてのバッファーに追加します。
    2. 準備、彼の6-洗浄バッファー 、彼と同じように6-バッファーのバインドが、20 mM のイミダゾールを使用して。
    3. 準備、彼の6-溶出バッファー 150 mM のイミダゾールを使用して、結合バッファーと同じ方法で。
  2. Karyopherin α を含むセクション 2 から雪解けのセルを構築し、彼の 40 mL に音量を調整する6はバッファーをバインドします。5 mM BME、0.250 mM PMSF、7 mg benzamidine 塩酸塩 (1 mM)、および 40 mg D/L メチオニンを追加します。
    1. 手順 3.4 3.8 以下のバリエーションの説明に従います: 彼の6を使用して-すべてのステップの GST 結合バッファーではなく結合バッファー。グルタチオン agarose の代わりにニッケル親和性の 4 つの mL を使用 (材料の表を参照) をゲル 2 mL 量列が列を作る。
      注: ニッケル親和性列は DTT と EDTA と互換性がありません。溶出バッファーのイミダゾールの集中が 250 mM に増加した場合は、Ni2 +-ニトリロ三酸 (NTA) agarose ニッケル親和性のゲルの代わりに使用できます (材料の表を参照してください)。
  3. 洗浄、彼の6ml の 8 列-洗浄バッファー。
  4. 彼の6の 12 mL と想定し, 浸出液 karyopherin α -溶出バッファーし、SDS ページ (手順 3.11) で溶出液を分析します。
  5. PS プロテアーゼの追加 250 μ l(ステップ 3.9) 溶出液に、4 ° C で 16-20 時間インキュベート一方で、彼の6の 1 L に対して 2 回溶出液を dialyze-2-20 h、カットオフ 6 8 kDa 分子の重量による透析膜の結合バッファー。
  6. メーカーの使用説明、ニッケル親和性のゲル列を再生成します。彼の6の 25 mL でコラムを平衡させ-結合バッファー。透析タンパク質を列に追加し、手順 3.7のバインド手順を実行します。
  7. 流れを収集、浄化された karyopherin α が含まれている (彼の6-タグ切断オフ)、彼の6の追加 4 mL と残りのタンパク質を溶出と -結合バッファー。これらの画分をプールします。彼の6の 12 の mL で列を溶出し-溶出バッファー。この画分には、不純物が含まれています。
  8. 4.4 4.5 の手順から分解されていないと劈開 karyopherin α とSDS ページ(手順 3.11) 彼の6の効率を評価するこの一歩から 2 つの溶出画分の分析-胸の谷間および純度のタグ付け。
  9. Karyopherin α を集中を 8 mg/mL とフラッシュ凍結液体窒素 (ステップ 3.15 3.17)。

5. Cdk1/サイクリン B のキナーゼ試金の体外

  1. 体外のキナーゼ試金
    注: キナーゼの到着時に、小さい因数を作るフラッシュを液体窒素で凍結して、-80 ° C で保存6 ヶ月以内に使用します。分子量は Cdk1 の 34 kDa とサイクリン b 48 kDa、SDS-PAGE のサイクリン B の見かけの分子量は約 60 kDa。
    1. PK (キナーゼに付属) バッファーを使用して x 10 の準備 0.5 M トリス-HCl、0.1 M MgCl2、1 mM EDTA、20 mM DTT、0.1% ブリッジ ・ 35、25 ° C で pH 7.5
    2. ATP 株式 x 10 の準備: 1 PK バッファー x 4 mM ATP のソリューションを行い、株式の最終 pH を確認してください。小さい因数-20 ° c で保存し、凍結融解サイクルを避けてください。
    3. ミックス 40 μ L CENP F のフラグメント (3.3 mg/mL または 400 μ M の濃度で) で 6 μ 10 PK バッファー、3 μ L の純水、6 μ L ATP 10 x の在庫、および 5 μ L 人間 x Cdk1/サイクリン B (1 μ、100 U) 0.5 mL マイクロ チューブに。
      メモ: CENP F フラグメント 8.6 kDa と Cdk1 固有の 4 つのリン酸化サイトのモル質量があります。新しい基板のキナーゼ試金蛋白質のモル濃度、およびリン酸化のサイトの数に従って濃度を調整します。人間の組換え Cdk1/サイクリン B 株式の活動は 20,000 U/mL と特定のアクティビティは 1,000,000 U/mg. 1 U Cdk1/サイクリン B Cdk1 ペプチド基質 PKTPKKAKKL NH2 にリン酸の 1 pmol の移動を触媒するために必要な量としては定義 (50 μ M)30 ° C で 1 分で (材料の表を参照してください)。
    4. 30 ° C で 1-16 h の Cdk1/サイクリン b. 加温せずコントロール反応水お風呂で反応を準備します。
  2. 2.5 μ L のキナーゼ試金反応を分析、 SDS ページ(手順 3.11) による制御の 2.5 μ L 16% アクリルアミドとゲルを使用して。解像度を上げるには、実行時間を拡張します。
  3. 残りのキナーゼ試金反応 (およびコントロール) 6 M グアニジン塩酸塩溶液の等しい量を追加します。3 m ・質量分析法 (セクション 6) リン酸化サイトを識別または分析のための質量分析施設にサンプルを送信し、機能検証 (を実行してこれらのサンプルを分析最終グアニジン塩酸濃度になりますセクション 7)。
    注: 以降の質量分析のため非常に重要だ、個々 のサイトのリン酸化効率が、できるだけ高くできれば 100%、それ以外の場合としてのリン酸化サイトをマップできません。リン酸化効率の向上、Cdk1/サイクリン B の大きな金額を追加し、16 h にインキュベーション時間を増やします。ATP の濃度を 2 倍にすることができます。
  4. トラブルシューティングについては、肯定的な制御として CENP F (2,987 3,065 残基) のキナーゼの in vitroアッセイを実行します。高い活動と Cdk1/サイクリン B の新鮮なバッチを使用します。

6. 質量分析法による Cdk1 固有のリン酸化部位の同定

  1. 変性、蛋白質のサンプルの脱塩メガボアカラム逆相液体クロマトグラフィー PLRP300 列を実行します。
  2. CENP F フラグメント内リン酸化サイトの数を得るためには、エレクトロ スプレー イオン化イオン トラップ質量分析法(ESI ITMS)44,45でそのまま試験管内でリン酸化 CENP F 84-mer を分析します。
  3. CENP F の phosphoamino 酸のサイトの場所を評価するため体外のトリプシン ダイジェストの準備を CENP F 蛋白質のサンプルをリン酸化します。トリプシン ダイジェストをピペットで移しなさいヒントを脱塩脱塩します。
  4. エレクトロ スプレー イオン化フーリエ変換イオン サイクロトロン共鳴質量分析法 (ESI FTICR MS)で CENP F のトリプシンのダイジェストを分析します。169 μ s の蓄積時間のESI FTICR質量分析計で分析を実行します。
    注: 大衆 ESI FTICR 質量分析法による決定の精度は 0.005 amu 内です。総蛋白量にそれぞれリン酸種の比率を定量化するには、質量スペクトルのピークの高さを決定します。

7. 機能検証: テスト分析サイズ排除クロマトグラフィーによるタンパク質間相互作用の Phosphomimetic の突然変異の効果

注: のアスパラギンに特定のリン酸化サイトを置き換えることでCENP F の断片の phosphomimetic 変異体が作成された識別された Cdk1 固有のリン酸化サイトの機能検証。アスパラギン酸の負の電荷は、リン酸化の効果を模倣します。CENP F フラグメント (2,987 3,065 残基) の S3048D の突然変異体が作成されました。

  1. 機能検証の野生型のバインディングを比較し、phosphomimetic CENP F karyopherin α にフラグメント分析ゲルろ過を使用して、結合の試金として。分析ゲル濾過のグルタチオン アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー (手順 3.1 3.12)、 CENP F の断片を浄化し、ゲル濾過手順をスキップします。
  2. 5 〜 6 mg/mL に蛋白質を集中します。フラッシュ-凍結タンパク質因数液体窒素 (ステップ 3.15 3.17)。
  3. ミックス精製 CENP-f フラグメント (0.1 mg、野生タイプまたは S3048D バリアント) し 1:1 のモル比で karyopherin α (0.7 mg) を精製しました。ゲルろ過バッファー 200 μ L のサンプル ボリュームを調整します。氷の上で 30 分間サンプルをインキュベート、サンプル (0.2 μ m 孔サイズ) をフィルターし、遠心分離 (25 分、21,700 × g、4 ° C) でサンプルをクリア
  4. それぞれ、サンプルサイズ排除クロマトグラフィーによる(3.13 3.14 のステップ)。20 mM HEPES、pH 7.5、150 mM の NaCl、および 2 mM DTT で構成されるゲルろ過バッファーを使用します。すべてのサンプルの同一条件の下で分析ゲル濾過実験を行います。
  5. メーカーの使用説明、分子量既知のモル質量の基準と分析ゲル濾過のコラムを調整します。
  6. 16% 溶出画分の分析 SDS ページ (手順 3.11)。

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結果

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最近 cNLS10に含まれている CENP F フラグメントの Cdk1 のリン酸化サイトを識別するために、体外のキナーゼ試金 (図 1) を使いました。この信号は、中間期のほとんどの間に CENP F の核局在化を与えます。G2 段階で CENP F が Cdk1 依存的に細胞質、核からエクスポートされます。Cdk1 が CENP F の局在を制御する方法の力学的洞察を得るためには、Igp サーバー36,37を使用して CENP-F Cdk1 のリン酸化サイトを予測するためのシーケンスを分析しました。残留 3,042, 3045、CENP F の cNLS、内予測された 3 Cdk1 固有のリン酸化サイトと 3,048 (表 1)。別 Cdk1 固有のリン酸化サイトも、残渣 3,007 (

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ディスカッション

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私たちの in vitroのキナーゼ試金は、細胞周期のマスター コント ローラーであり多くの重要な細胞プロセスを調整するキナーゼ Cdk1 のための分子ターゲットを識別するために非常に強力な方法です。浄化された蛋白質が Cdk1 の基板は、でき特定のリン酸化部位の同定であるかどうか、方法が決まります。Cdk1 による燐酸化によってこれを容易に解明の細胞プロセスの規則のため。

質量分析法によるリン酸化のサイトの成功の識別のための最も重要な要因は、キナーゼ試金のリン酸化効率です。個々 のサイトのリン酸化効率化する必要があります、できるだけ高くできれば 100%。これは Cdk1/サイクリン B の量を増やすと 16 時間インキュベーション時間を増やすことによって達成することができます。Cdk1/サイクリン B の量を計算する必要なとき、蛋白質のリン酸化サイトを考慮すべき数モル濃度。これは複数のリン酸化サイトにターゲット蛋白質に存在する場合に特に重要です。商業 Cdk1/サイクリン B の活動が、バッチを変わることができるし、キナーゼは活動を急速に失うことができますは、...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者が明らかに何もありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

博士デビッド王、ハワード ヒューズ医学研究所、カリフォルニア大学バークレーは、質量分析および有用なコメントを感謝いたします。Xuelian 朱先生、上海、研究所生物科学、中国科学院、フルレングス CENP F 構造を提供するため、中国上海に感謝いたします。最後に、博士スーザンの命とり、博士ブライアン キャラハン博士クリストフ Grewer アット ビンガムトン ユニバーシティは、機器へのアクセスを感謝いたします。この研究は、ニューヨーク州立大学、ニューヨーク州立大学ビンガムトン校化学科研究財団によって賄われていた。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2800 mLの困惑したFernbachのフラスコのコーニング44232XL
のアンピシリンの金のバイオテクノロジーA-301-25
ATPのフィッシャーの科学者BP413-25
ベンザミジンの塩酸塩ミリポアのシグマB6506-25
のボトルトップフィルターCorningの431161
Cdk1/cyclin Bの組換え体、ヒト 20,000 U/mLNew England BiolabsP6020
Cdk1/cyclin B (代替供給源)EMD Millipore14-450
Cdk1/cyclin B (代替供給源)InvitrogenPV3292
Cdk1/cyclin B + 10x PK bufferNew England BiolabsP6020
CENP-F (残基 2987 – 3065) pGEX6P1 プラスミドご要望に応じてご利用いただけます。
遠心分離機:ヘレウスマルチフュージX3R、冷却、TX-1000スイングアウトローター付きThermo Scientific10033-778
遠心フィルターユニット:Amicon Ultra-15遠心フィルターユニット、3 kDaカットオフ、Ultracel-PLメンブレンEMD MilliporeUFC900324
chlorampenicolGold BiotechnologyC-105-100
D/L メチオニンAgros Organics / Fisher
125650010脱塩ピペットチップ: ジップチップMillipore SigmaZTC18S008
ディスポーザブルクロマトグラフィーカラム、Econo-Pac 1.5 x 12 cmBiorad7321010
dithiothreitolGold BiotechnologyDTT50
E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strainEMD Millipore71403
エレクトロスプレーイオン化フーリエ変換イオンブルカー AmazonApex III
サイクロトロン共鳴質量分析計
エレクトロスプレーイオン化イオントラップ質量分析計ブルカー アマゾンカスタム
固定角ローター:Fiberlite F15-8x-50cyThermo Scientific97040-276
FPLCシステム:Äkta Pure FPLCGE Healthcare29032697
Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GLGE Healthcare28990944
glutathione agarosePierce16101
glutathione, reducedMillipore SigmaG4251-50g
incubation shaker: multitron shakerInfors I10102
イソプロピル β-D-1-チオガラクトピラノシドゴールドバイオテクノロジーI2481C50
カナマイシンゴールドバイオテクノロジーK-120-25
カリオフェリン & α; pet-28a pres プラスミドご要望に応じてご利用いただけます。
Luria Bertani mediumFisher ScientfiicBP1426-2
微量遠心分離機 5418R、冷蔵Eppendorf5401000013
マイクロチューブ (0.5 mL)Eppendorf30121023
マイクロチューブ (1.5 mL)Eppendorf30120086
ニッケルアフィニティーゲル: His-Select ニッケルアフィニティーゲルMillipore SigmaP6611-100ml
pGEX-6P-1 プラスミドミリポアシグマGE28-9546-48
フェニルメチルスルホニルフッ化物ゴールドバイオテクノロジーP470-10
PS プロテアーゼ PreScission プロテアーゼGE ヘルスケア27084301
ホスタグアクリルアミド和光ピュアケム Ind.304-93521
還元型グルタチオンミリポア シグマG4251-50g
丸底遠心分離管 (オークリッジ管)Fisher Scientfiic055291D
サイト指向型突然変異誘発キット: QuikChange ライトニングアジレント210518
サイト指向型変異誘発キット
ソニファイア: ブランソン S-250D ソニファイアBranson15 338 125
Spectra/Por 1RC 透析メンブレン (6-8 kDa カットオフ)Spectrum Labs08 670B
スイングアウトローター TX-1000Thermo Scientific10033-778

参考文献

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