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方法論記事

プロ線維性シグナル伝達の抑制を促進する誘導心筋細胞マウス胚性線維芽細胞のリプログラミング因子を介した

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DOI：

10.3791/57687

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2018年6月3日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Population Health Sciences, Medical College of Georgia, Augusta University

この記事について

サマリー

機能的な心筋細胞発現 Tbx5、ミール 1 とミール 133 Mef2c、Hand2 GATA4 (GHMT2m) と一緒に TGF-β シグナルの阻害を介してプライマリ胚性線維芽細胞を再プログラムする手法をご紹介します。我々 のプロトコル 60% までの 7 日間後の伝達も早く拍動心筋細胞を生成する効率。

要約

別に 1 つの体細胞のタイプのトランス分化には、モデルおよび人間の病気の治療に莫大な可能性があります。以前研究示されている、マウス胚は、真皮、そして心臓線維芽細胞を誘導心筋細胞様細胞 (iCMs) に書き換えることができます GATA4、Hand2 Mef2c など心原性転写因子の過剰発現を介して、Tbx5の in vitroとin vivoの両方。ただし、これらの以前の研究は、比較的低効率を示しています。心臓機能障害を復元するために iCMs の成熟と効率を向上させる心臓のリプログラミングを支配するメカニズムを解明する必要があります。

以前、リプログラミング効率を劇的にプロ線維のシグナル伝達の阻害に増加を示した。ここでは、リプログラミング効率 60% を達成する方法を詳しく説明します。また、フローサイトメトリー、蛍光イメージングは、リプログラミング効率とプログラムし直された線維芽細胞の成熟を定量化するカルシウム イメージングなどいくつかの方法をについて説明します。ここで詳細なプロトコルを使用して、心臓のリプログラミングの正と負のレギュレータを決定する解明を引き受けることができます。これらの研究は、リプログラミング効率と人間の心臓病を治療する細胞治療法につながる可能性の成熟を促進するためにターゲットすることができますシグナリング経路を識別できます。

概要

虚血性心疾患は、アメリカ合衆国1死の主要な原因です。およそ 800,000 のアメリカ人の経験最初または再発性心筋梗塞 (MI)1年につき。MI、次は、心筋 (CMs) と活性化心臓線維芽細胞による心筋の線維化の死は心臓機能2,3を損ないます。MI の後心不全の進行は主大人 CMs4、5の悪い再生能力により元に戻すこと。現在臨床治療が病気の進行を遅らせる、将来心臓イベント6,7,8,9のリスクを減少させる治療はできないのための病気の進行を逆します。CMs 心筋硬塞後10を再生成します。マイル失意のうち、次の患者を治療するために浮上している新規細胞治療、MI をこれまで続く心臓に幹細胞を提供する臨床試験は決定的でない再生潜在的な11,12,を示されています。13,14,15,16,17,18。

最初高橋 & 山中で示した 4 つの転写因子の過剰発現による線維芽細胞からひと由来の誘導多能性幹細胞 (hiPSCs) の生成は、細胞療法19で新たなブレークスルーにドアを開けた。これらの細胞は、すべて 3 つの胚葉19に区別できる、CMs の大規模な番号を生成するためのいくつかの非常に効率的な方法は、以前20,21を示されています。派生した CMs (腰-CMs) 心筋を勉強する強力なプラットフォームを提供しています、心臓の損傷を修復するための重要な含意があるかもしれない。腰 CMs 現在奇形腫形成22, 懸念のため並進ハードルに直面し、その未熟な性質があります pro 不整脈23。直接他のセルタイプに線維芽細胞をリプログラミングの興味を引き起こした hiPSCs に線維芽細胞をプログラムし直します。家田らは、低効率24どまる Tbx5 (GMT)、Mef2c、GATA4 心臓系統に直接再プログラム化により、線維芽細胞で過剰発現を示した。リプログラミング効率 Hand2 (GHMT)25の付加と改善されました。これらの初期の研究から多くの出版物を示していることは26,27,28,29, 要因追加転写リプログラミング因子カクテルを変更34は改善につながる小さな分子やマイクロ Rna32,33, クロマチン修飾子30,31リプログラミング効率および/または誘導された心筋細胞のような細胞 (iCMs の成熟).

ここでは、高効率でマウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEFs) から iCMs を生成する詳細なプロトコルを提供します。以前示したカクテル GHMT ミール 1 とミール-133 (GHMT2m) の追加で大幅に改善され、さらに向上、プロ線維増殖因子 β (TGF-β) シグナリングを変換を含むシグナルまたは Rho 関連蛋白質キナーゼ (ロック) シグナル伝達経路が抑制35です。このプロトコルを使用して、ことを示す細胞の約 60% エクスプレス心臓トロポニン T (cTnT)、50% 約表現 α-アクチニン暴行細胞数が多いが、早ければ次の要因と治療をリプログラミングの伝達日 11 観察できます。TGF-β と I 型受容体阻害剤 A-83-01 です。さらに、これらの iCMs はギャップ結合蛋白質コネキシン 43 を含むを表し、自発収縮とカルシウム濃度を示します。このマークが以前の研究と比較して効率をリプログラミングの改善は心後梗塞に残っている内因性の細胞集団から CMs を再生成する可能性を示しています。

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プロトコル

動物を必要とするすべての実験は、動物介護制度と UC デンバー アンシュッツ医療キャンパス利用委員会によって承認されました。

1. MEFs の分離

  1. E13 の C57BL/6 妊娠マウスを購入します。一晩出荷。
  2. 承認された IACUC プロトコルによると母親を安楽死させる (ex: 頚部転位続いて ~1.3 L/min CO2動物が死んだが表示されるまで)
  3. 70% エタノールで母親をスプレーし、腹腔内を開きます。胚を含む子宮角を取り外して滅菌 PBS で 10 cm 皿に置きます。
  4. 胚を解放する胚嚢に切開を行います。10 cm の滅菌 PBS の皿をきれいにする胚を転送します。徹底的にすすいでください。
  5. 肝臓の下ボディをカットし、頭と上半身を破棄します。内臓を取り外して廃棄します。残りのティッシュを滅菌 PBS のきれいな 10 cm 皿に転送し、バイオ セーフティ レベル 1 または 2 のキャビネットにプレートを転送します。清潔で乾燥した 10 cm 皿にすべて胚からの組織を結合し、細かくみじん切り。
  6. みじん切りにした胚に 0.25% トリプシン/1 mM EDTA の 6 mL を追加します。組織を分割するピペットによって数回をカップ刻んだ。5% CO2と 37 ° C で 40 分間インキュベートします。
  7. 成長媒体 (表 1) で細胞を再懸濁します。メディアのボリュームは、胚の数に基づいて調整されます。一般に、1.2 胚あたり約 25 mL の成長媒体の比率を使用します。
  8. プレート 15 cm 皿に再懸濁細胞の 25 mL。24 h 後メディアを吸引し、新鮮な成長媒体の 25 mL を各プレートに追加します。
  9. 72 時間後 15 cm 皿ごとに 0.25% トリプシン/1 mM EDTA の 2 mL を追加します。細胞を培養皿からデタッチ、15 mL の培地でトリプシンを不活化し、50 mL スチロール円錐管の細胞を収集します。室温で 160 x gで 3 分の細胞を遠心します。70 μ m 孔携帯こし器を通って成長培地とフィルターで細胞ペレットを再懸濁します。
  10. 診断を使用してセルをカウントし、凍結中 200 万セル因数で MEFs を凍結 (10 %dmso、25 %fbs ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) で/高血糖)-80 ° C で液体窒素を使用する準備ができるまでの 24 h とストア後セルを転送します。
    注: MEFs グローバル遺伝子発現プロファイリングを実行した RNA 塩基配列解読によってこのプロトコルを使用してを分離 (RNA seq) 携帯認証を確保するため。エンコードの MEF のセルからの RNA シーケンス データ受入番号 GSE93454 と NIH 遺伝子発現オムニバス (GEO) からがダウンロードされました。MEFs 私達によって使用のための RNA シーケンス遺伝子発現データは、受入番号 GSE71405 と NIH の GEO で沈殿させた。これら 2 つのデータ セットは、一般的な遺伝子記号によると併合しました。発現データがログ変換され、MEFs エンコード MEFs、発現データの散布図が生成され、線形回帰直線 (図 1 a) と合います。このプロトコルを使用して分離された MEFs はこれらの他の実験室によって孤立した分子と似ています。

2. レトロ ウイルスと MEFs の伝達の生産

注: このセクションのすべての手順を実行する必要がありますに行なうバイオ セーフティ レベル 2 キャビネット。このプロトコルは、レトロ ウイルスの伝達を利用して、少なくとも 20 分図 1B参照プログラムし直すためのタイムラインの 10% の漂白剤でウイルスのメディアを含むすべての廃棄物を扱うなどの予防措置、安全を確認します。

  1. プラチナ E (PE) 細胞株を用いたレトロ ウイルスの生産
    1. 市販 PE PE 媒体 (表 1) 含むブラストサイジン ・ ピュロマイシン選択マーカー式ギャグ- のように細胞を維持する効率的なレトロ ウイルス粒子生産36 のポルとenv遺伝子.1:4、1:5 2 日で通過細胞。これはレトロ ウイルスの生産量を減らすことができます、セルの混雑を防ぐために注意してください。
    2. -1 日トランスフェクション前に約成長媒体 (表 1) 16-20 h で 10 cm 皿あたり 5 x 10 の6セルを種子 (メッキその他の標準的な細胞文化皿サイズの密度の表 2を参照)。慎重にロックの料理、前後数回と 37 ° C、5% CO2インキュベーターもめっき分布を確保するために慎重に (トランスフェクション前に最適なめっき密度は図 1を参照)。
      注: 生成されたレトロ ウイルス粒子を含む培地が MEFs を殺さないようにトランスフェクション前選択マーカーの無料媒体のプレート PE セルに注意してください。
    3. 0 日、DNA をトランスフェクションに備えます。10 cm 皿 transfection のためそれぞれのリプログラミング因子 2 μ g を追加-GATA4 Hand2、Mef2c、Tbx5、ミール 1 とミール-133 (GHMT2m)-1.5 mL チューブに。
      注: は transfect 他標準セル培養皿サイズに必要な DNA の量を拡張する表 2を参照してください。
    4. 別 1.5 mL チューブ 360 μ L 低下した血清中のメディアを追加します。低下した血清中メディアに直接 36 μ L のトランスフェクション試薬を加えます。軽くチューブをフリックし、5 分間室温でインキュベートします。
      注: 低トランスフェクション効率を避けるためには、低下した血清中メディアに直接トランスフェクション試薬を慎重に追加します。
    5. GHMT2m DNA カクテルに減らされた血清のメディア/トランスフェクション試薬の混合物を追加します。軽くチューブをフリックし、15 分間室温でインキュベートします。ボルテックスにかけないでください。
    6. PE のセルに反応混合物を滴下し追加、穏やかに 10-15 秒のためのメディアを旋回し、37 ° C、5% CO2インキュベーターに配置。
      注: メーカーによると PE 細胞生成 10 の平均価6 107感染ユニット/mL。このプロトコルは約 2 × 106感染症ユニット/mL 24 h と 6 x 106感染症ユニット/mL 平均 4 の MOI のため 48 h を生成します。GFP/下流のトランスフェクションは、トランスフェクション/伝達効率の場合、必要なの代理としても使用トランスフェクションの効率は、48 h (図 1) で 90% を超えると予想されます。
  2. MEFs の伝達
    1. 0 日にコラーゲンと 37 ° C、5% CO2インキュベーター、少なくとも 2 時間の場所で料理をコートします。
    2. 液体窒素と雪解けから MEFs を削除します。培地に 60 mm ディッシュ プレート 0.2 x 106セルです。ゆっくり確実にロック プレート均一にめっき分布にインキュベーター (メッキその他の標準的な細胞文化皿サイズの密度の最適なめっき密度および表 2 図 1を参照)。
      注: これらのめっき密度分離 MEFs; の複数のバッチをテストされています。MEFs 表示生存率を大幅に侵害、しない限り、細胞播種密度を調整することは必要ではありません。
    3. 1 日目、24 h 後トランスフェクション PE 細胞によって生成されたレトロ ウイルスの媒体を収集するために 30 mL の注射器を使用します。50 mL の円錐管に 0.45 μ m 孔サイズ フィルターを媒体を通過します。6 μ G/ml の最終的な集中に hexadimethrine 臭化トランスフェクション試薬を追加します。慎重にセルの変位を防ぐために培養皿の壁にピペッティング メディアによって PE セルに 10 mL の新鮮な成長媒体を追加します。
    4. MEFs から培地を吸引し、それぞれの料理に新鮮な収穫のレトロ ウイルスの培地 4 mL を追加します。MEFs をインキュベーターに戻ります。レトロ ウイルス粒子を中和するためにウイルスの媒体との接触のすべての材料を 10% の漂白剤を追加します。
    5. 2 日目、48 時間後のトランスフェクション 2.2.2 と 2.2.3 の手順を繰り返します。PE セルは、レトロ ウイルスの中の 2ndコレクションの後破棄されます。
      注: 不要なレトロ ウイルスを中和するために、少なくとも 20 分の破棄された PE セルに対する 10% の漂白剤を追加します。
    6. 3 日目、MEFs から培地を吸引し、補充する 0.5 μ M を含む 4 mL iCM 培地 (表 1) と A-83-01 TGF-β I 型受容体阻害剤。ICM 媒質 A-83-01 2 日おきを補充します。
      注: 伝達制御として GFP を使用する場合式によって期待される 90% を超えるこの時点 (図 1)。

3. 心臓マーカーのフローサイトメトリー

  1. 9 日から吸引中は、死んだ細胞や残骸を削除する 1 × PBS の MEFs、洗浄 (1 x) を再プログラム。
  2. 37 ° C で 1 mL 0.25% トリプシン EDTA/5 分を追加します。光学顕微鏡を使用してセルをチェックし、料理を振るセル接続されたまま、細胞を切り離すまで 37 ° C で 5 以上の分を孵化させなさい。
  3. 70 μ m 孔携帯こし器を通って 5 %fbs とフィルターを含む 1 × PBS のセルを洗浄します。
  4. 部屋の温度と、ペレットから液を吸引で 3 分の 160 x gで遠心分離機します。
    注: セルの収量を増加するには、細胞ペレットの上約 50 μ L 液体をまま。
  5. セルを 1 %bsa を含む 500 μ L 1 × PBS で洗浄します。
  6. 氷の上の 0.2 mL/1, 000 セル セル固定溶液 20 分間を修正します。
  7. 1 x 冷たいパーマ/洗浄バッファーの 1 つの mL を追加します。
    注: 製造元のソリューションは 10 倍です。
  8. 4 ° C で 5 分間 160 x gで細胞を遠心し、上清を吸引します。
  9. 追加時間 3.7 ・ 3.8 の手順を繰り返します。2nd洗浄後そのまま次のステップに進むまたは一晩 4 ° C で細胞を保ちます。
  10. 5% ヤギ血清とロバ血清室温で 30 分間パーマ/洗浄バッファー x 1 の 100 μ L でブロックします。
  11. 希釈した一次抗体 100 μ L を追加します。
    注: このプロトコルのマウス トロポニン T (レバレッジ) で標識した細胞とマウス α-アクチニン (レバレッジ) の割合を定量化する細胞心筋筋節の主要なコンポーネントのために積極的。一次抗体室温で 1 時間インキュベートします。
  12. 4 ° C で 5 m 160 x gで細胞を遠心、上清を吸引し、冷たいパーマ/洗浄バッファーで 2 倍を洗ってください。
  13. 希釈した二次抗体の 100 μ L を追加します。
    注: このプロトコルの細胞は抗マウス 647 nm 二次抗体 (レバレッジ) で標識しました。エンド オーバー エンド チューブ回転子に室温の 45 分の二次抗体を孵化させなさい。ホイル チューブをラップすることによって光から細胞を保護します。
  14. 4 ° C で 5 分間 160 x gで細胞を遠心、上清を吸引し、冷たいパーマ/洗浄バッファーで 2 倍を洗ってください。
  15. PBS で 1 %bsa の 1 つの mL を追加し、FACS をすぐに実行します。
    注: は、FACS を実行するときに実行可能なセルを最初ゲート前方散乱対側散布を生成します。また、ライブを識別し、死んだ細胞のセルを修正する前に市販のライブ/死細胞染色を使用します。

4. プログラムし直された MEFs の免疫染色

  1. 14 日目から吸引中は書き換え MEFs、1 mL の 1 x の氷冷 PBS で洗浄 (1 x)。
    注: 免疫染色用抗体ソリューション ボリュームを最小限に抑えるため 12 ウェル プレートで実行されたリプログラミングします。24 ウェル プレートも使用できます。単に半分すべて次のボリューム。
  2. 吸引、室温で 10 分間 500 μ L 2% パラホルムアルデヒドとセルを修正します。
  3. 吸引し、1 mL の 1x PBS (常温洗浄あたり 5 分) で 3 回細胞を洗ってください。
  4. 500 μ L 0.2% 透過性試薬による PBS で室温で 15 分間セルを permeabilize します。
  5. 吸引し、500 μ L 10% 馬血清 PBS で室温で 30 分間でブロックします。
  6. 吸引し、1 時間室温で希釈した一次抗体の 500 μ L で孵化させなさい。
    注: このプロトコル細胞がマウス トロポニン T または α-アクチニン (各 1: 400) が付いたし、共同コネキシン 43 (1: 400) またはトロポニンに私 (1: 400) ラベル付け。
  7. 一次抗体を吸引し、1 mL の 1x PBS (常温洗浄あたり 5 分) にて 3 回洗浄します。
  8. 吸引し、500 μ L の希釈した二次抗体と室温で 1 時間インキュベートします。
    注: このプロトコルの抗マウス 555 nm 二次抗体 (1:800) トロポニン T または α-アクチニンを認識すると反うさぎ 488 nm 二次抗体 (1:800) コネキシン 43 またはトロポニン i. また認識するラベルされた細胞、核染色ヘキスト (1:10, 000)。暗闇の中でインキュベートし、光から細胞を保護します。
  9. 二次抗体を吸引し、1 mL の 1x PBS (常温洗浄あたり 5 分) にて 3 回洗浄します。光から細胞を守るし、4 ° C で保存に箔でプレートをラップします。
  10. 3 ch 落射蛍光顕微鏡を使用してイメージ。

5. カルシウム イメージング

注: 場合は 10 倍の倍率でイメージング、標準的な細胞培養皿とプレートに適していますカルシウム イメージング。高倍率でイメージング ガラス ガラス底培養皿の細胞をめっきすることが必要です。

  1. 培地を吸引し、2 mL (、6 ウェル プレート) が変更されたタイロード液 (140 mM NaCl、KCl、1.8 mM CaCl2, 5 mM 1 mM MgCl2、10 mM グルコース、10 mM HEPES、0.1 %bsa および 1% のピルビン酸、pH 7.4) を追加 5 μ M を含む Fura 2 だと 0.1% プルロニック F-127 (D14 t を打つことにo D20) iCMs。37 ° C で 30 分間インキュベートします。
    注: は、蛍光指示薬の焼入を防ぐために光から細胞を守る。
  2. フラ 2 の解消のエステル化を許可する部屋の温度で 30 分間 2 mL タイロード液で細胞を洗う時。
  3. 340 ディスク共焦点顕微鏡を回転画像 nm と 380 nm Slidebook 5.5 Ca2 +イメージング ソフトウェアを使用して。室温でイメージングを実行します。
  4. カルシウム濃度は 340 で蛍光強度の比を使用して計算されます 380 で蛍光強度上 nm nm。
  5. 必要な場合治療 1 または 2 μ M イソプロテレノールや 10 μ M iCMs ニフェジピン カルシウム基準カルシウム トランジェントをイメージングした後の処理を操作します。ローカル セルとイメージする化合物を追加します。

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結果

約 70% と心筋トロポニン T を発現する細胞の心筋 α-アクチニン、日 9 にフローサイトメトリーによる定量化を発現する細胞の約 55% の iCMs 上記及び図 1Bリプログラミングの戦略を使用して、生成しました。次の GHMT2m の伝達 (図 2 aとB)。さらに、細胞の大部分はエクスプレス心臓トロポニン T、トロポニンは心筋 α-アクチニンと次の伝達 (図 2およびD) 日 14 にギャップ接合マーカー コネキシン 43。高倍率画像では、明確に定義された筋節構造形成とギャップ結合隣接細胞 (白い矢印、図 2 D) 形成を明らかにします。さらに、自発的な収縮とカルシウム濃度は、iCMs (図 3 a<...

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ディスカッション

本研究では、直接初期化因子プロ線維性シグナル伝達経路の抑制と組み合わせる GHMT2m の配信を介して機能 iCMs に線維芽細胞を再プログラムする高効率戦略について説明します。フローサイトメトリー、蛍光イメージング、カルシウム イメージング、およびこのプロトコルでセルの大半を示す細胞数を打つことを使用して成功の書き換えを受けるし、CM リネージュ運命を採用します。我々 は以前に、抗線維化添加化合物の TGF-β 型を含む私受容体阻害剤 A-83-01 利回り GHMT2m 単独でことを示すと伝達に比べて打撃 iCMs 数のおよそ 6 増加プロ線維信号は心臓リプログラミングに強力な内因性バリアです。このシステムは、したがって、心筋; を支配するメカニズムを調査するため薬物をスクリーニングするため活かされるA-83-01 と一緒に小分子添加心筋の負の制御因子が明らかに。逆に、GHMT2m だけに小分子添加心筋正電圧レギュレータを解明できます。これらの正と負のレギュレータは CM の分化を支配するメカニズムの解明と、心筋のより良い理解は、さらに効率的なリプログラミングと成熟プロトコルに 。

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この研究は、ベッチャー財団のウェッブ ワーミング生物医学研究プログラム、アメリカ心臓協会の科学者開発補助 (13SDG17400031) コロラド大学部門医学優れた初期のキャリアからの資金によって支えられました。学者プログラムは、コロラド州部の循環器バーロー Nyle 基金、大学と NIH (カンザス) に R01HL133230。A.S.R は、線維症研究 & 翻訳 (CFReT) の NIH/NCATS コロラド CTSA 許可番号 TL1TR001081 とコロラド大学コンソーシアムから博士フェローシップによって支持されました。本研究は、がんセンター助成金 (P30CA046934)、皮膚疾患研究コア助成金 (P30AR057212)、コロラド大学アンシュッツ メディカル キャンパスで流れ Cytometry コアによっても支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
C57BL/6 マウスCharles River's Laboratory027MEF 分離用
プラチナ E (PE) 細胞Cell Biolabs, INCRV-101レトロウイルス生産用
DMEM 高グルコースGibcoSH30022.iCM、PE、および成長培地
ミディアム 199Life Technologies11150-059iCM培地の成分
ウシ胎児血清ジェミニ100106iCM、PE、および成長培地の成分
ドナーホース血清ジェミニ100508 500iCM培地の成分
MEM必須アミノ酸、50XLife Technologies11130051iCMの成分media
ピルビン酸ナトリウム溶液, 100XLife Technologies11360070iCM培地およびカルシウムイメージング用成分
MEM非必須アミノ酸, 100XLife Technologies11140050iCM培地の成分
MEMビタミン液, 100XLife Technologies11120-052iCM培地の成分
インスリン-トランスフェリン-セレンギブコ41400045iCM メディアのコンポーネント
B27Gibco17504-044iCM メディアのコンポーネント
ペニシリン-ストレプトマイシンGibco15140-122iCM、PE、および成長メディアのコンポーネント
GlutaMAX (L-グルタミンサプリメント)Gibco35050-061iCM、PE、および成長メディアのコンポーネント
Blasticidin-HClLife TechnologiesA11139-03PE メディアのコンポーネント
ピューロマイシン二塩酸塩ライフテクノロジーA11138-03PE培地の成分
0.25% トリプシン/EDTAGibco25200-056培養皿から細胞を剥離するため
A-83-01R&Dシステム - Tocris2939/10TGF-&βを阻害する細胞を治療し、シグナル伝達 - 高効率のリプログラミングを促進します。0.5µで使用してください。M
DMSOThermo Scientific85190A-83-01および凍結培地
SureCoatCellutronSC-9035プレートMEFsへのディッシュコーティング用
FuGENE 6 トランスフェクション試薬PromegaE2692トランスフェクション試薬
Opti-MEM 還元血清培Gibco11058-021トランスフェクション試薬
pBabe-X Myc-GATA4リプログラミング因子を含むプラスミド
pBabe-X Myc-Hand2リプログラミング因子を含む プラスミド
pBabe-X Myc-Mef2cリプログラミング因子を含む プラスミド
pBabe-X Myc-Tbx5リプログラミング因子を含む
プラスミド pBabe-X miR-1を含む プラスミドリプログラミング因子
pBabe-X miR-133リプログラミング因子
pBabe-X GFPリプログラミング因子
ポリブレン (臭化ヘキサジメトリン)SigmaH9268-5Gウイルス誘導用。6 µの濃度で使用します。g/mL
真空フィルター + ボトル (0.22 µm pores)Nalgene 〒569-0020 メディアのフィルタリング用
シリンジBD真空洗浄器実験器具 309654ウイルスろ過用
0.45 & micro;m フィルターセルトリート229749ウイルスろ過用
70 & マイクロ;mセルストレーナーファルコン 352350MEF単離およびフローサイトメトリー
Cytofix/Cytoperm SolutionBD554722フローサイトメトリー用細胞の固定および透過化用
パーマ/ウォッシュバッファー BD554723フローサイトメトリー用細胞洗浄用
DPBS 1XGibco14190-250細胞洗浄用
ウシ血清アルブミンVWR0332-100gフローサイトメトリーおよびカルシウムイメージング用
ヤギ血清シグマ G9023フローサイトメトリー用ブロッキング細胞用
Donkey SerumSigmaD9663-10mgフローサイトメトリー用ブロッキング細胞用
マウストロポニン TThermo Scientificms-295-p1:400 IF, 1:200 フローサイトメトリー
マウス &α;-アクチニンSigmaA7811L1:400 IF, 1:200 フローサイトメトリー
ウサギ コネキシン 43Sigma C62191:400
IF ウサギ トロポニン IPhosphoSolutions2010-TNI1:400 IF
HoechstLife Technologies622491:10000 IF
Alexa 488、ウサギLife TechnologiesA-110341:800 IF
Alexa 555、マウスLife TechnologiesA-214221:800 IF
Alexa 647、マウスLife TechnologiesA-315711:200 フローサイトメトリー
27色ZE5 フローサイトメーター FACSパラBio-RAD
のための細胞を固定するため Triton X-100PromegaH5142IFのEVOS&tradeのための細胞の透過化のため
;FLカラーイメージングシステムThermo Scientific System Thermo ScientificAMEFC4300 For IF
NaClRPIS23020-5000カルシウムイメージング用
KClVWR395カルシウムイメージング用
CaCl2FisherC614-500カルシウムイメージング用
MgCl2VWR97061-352イメージング用
グルコースシグマG7528-250gカルシウムイメージング用
HEPESシグマH4034-500gカルシウムイメージング用
Fura-2 AMライフテクノロジーズ F1221カルシウムイメージング
用 フルロニック F-127シグマP2443-250gカルシウムイメージング用
ニフェジピンシグマN7634-1GiCMの破壊カルシウム過渡現象用 - 10 &マイクロ;M
イソプロテレノールシグマI6504-1giCM のカルシウム過渡現象の数を増やす場合 - 1-2 µ で使用します。M
マリアナ諸島 スピニングディスク 共焦点顕微鏡3iカルシウムイメージング用
エタノールデコンラボラトリーズ2801
漂白剤クロロックス
50 mL コニカルチューブGREINER BIO-ONE
15 mL コニカルチューブGREINER BIO-ONE
15 cm 細胞培養皿ファルコン
10 cm細胞培養皿Falcon353003
60 mm細胞培養皿GREINER BIO-ONE628160
6ウェル細胞培養プレートGREINER BIO-ONE657160 
12ウェル細胞培養プレートGREINER BIO-ONE665180 
24ウェル細胞培養プレートGREINER BIO-ONE662160 
のFSコンポーネントズ の成分の希釈および保存用 地 を含むプラスミド用 ホルムアルデヒドシグマP6148-500mgのための IF カルシウム 227261 188271 353025

参考文献

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