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方法論記事

大きな腱欠損を修復する組織設計されたコラーゲン移植片を用いた新規テノルラフィー縫合技術

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DOI：

10.3791/57696

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2021年12月10日

 ,  , 
1Division of Surgery and Interventional Science, University College London, 2Blond McIndoe Laboratories, Division of Cell Matrix and Regenerative Medicine, MAHSC, University of Manchester, 3Department of Surgical Research, Northwick Park Institute for Medical Research, Northwick Park Hospital

この記事について

サマリー

本論文では、工学的コラーゲン移植片で満たすことにより、最大1.5cmの腱ギャップを修復するための in vitro および in in in これは、移植片が宿主組織に成熟するまで機械的負荷を取る改変縫合技術を開発することによって行われた。

要約

ドナーを容易に同定して使用できる部位は有限数であるため、腱移植片を有する大きな腱欠損の外科的管理は困難である。現在、このギャップは腱自動、アロ、ゼノ、または人工移植片で満たされていますが、それらを確保するための臨床的方法は、スケールのために動物に翻訳可能であるとは限りません。新しい生体材料を評価したり、コラーゲン1で構成される腱移植片を研究するために、腱端に合わせて操作された腱を維持するのに役立つ改変縫合技術を開発しました。これらの移植片の機械的特性は、天然腱より劣る。操作された腱を装填された修復の臨床的に関連するモデルに組み込むために、組織で設計された腱移植片をオフロードし、機械的に健全なネオ腱が形成されるまで 、生体内で の操作された腱の成熟と統合を可能にする戦略が採用されました。この手法は、コラーゲン1型組織を組み込んで腱構築物を作製した方法を用いて説明する。

概要

腱断裂は、外傷性裂傷や腱の過度の負荷などの外因性要因のために起こることがある。腱修復に置かれた外部引張力のために、ほとんどの腱修復技術で必然的にギャップが形成されます。現在、腱欠損/ギャップは、オート、アロ、ゼノ、または人工移植片で満たされていますが、その可用性は有限であり、ドナー部位は罹患率の源です。

コラーゲンなどの天然ポリマーから腱移植片を作製する組織工学的アプローチは、生体適合性であるという独特の利点を有し、細胞統合を容易にする重要な細胞外マトリックス(ECM)成分を提供することができる。しかし、フィブリラアライメントの欠如のために、工学的腱(ET)の機械的特性は、ネイティブ腱に劣っています。弱いコラーゲンの機械的特性を高めるために、真空下での物理的架橋、紫外線照射、および脱熱熱処理1などの多くの方法が用いられている。また、リボフラビンとの化学的架橋を通じて、酵素的および非酵素的な方法は、インビトロ2,3におけるコラーゲン密度およびヤング率を増加させた。しかしながら、架橋剤を添加することにより、コラーゲンの生体適合性が損なわれ、研究により、細胞生存率3、4、5の33%の変化および40%の細胞生存率の損失が示されている。線形と機械的強度の漸進的な発生は、環状負荷6を介して得ることができる。しかし、これは効率的に取得することができます in vivo7.

ETが 生体内で 統合し、化学改変を必要とせずに強度を獲得するためには、安定化縫合技術を使用して弱い構造を所定の位置に保持する方法があります。ほとんどの腱の修復は、腱の端を一緒に保持するために縫合線の設計に依存しています。したがって、これらの既存の手法を変更すると、論理的なソリューション8,9を提供できます。

1980年代までは、2本鎖の修復が広く使用されていましたが、最近の外科文献では、修復10、11で4本のストランド、6本のストランド、あるいは8本のストランドの使用について記述されています。1985年、サベージは6つのアンカーポイントを持つ6本鎖縫合糸技術を説明し、4本のストランド12を使用するバネル縫合技術よりも有意に強かった。また、8本鎖の修理は、死体や車体の他のストランドよりも43%強いが、修理を正確に13、14、15、16に再現することが技術的に困難になるため、これらの修理は広く行われていない。したがって、より多くのコア縫合糸鎖は、修復された腱の生体力学的特性の比例的増加に関連する。しかし、縫合点の周囲に細胞生存率の喪失があり、過度の縫合による外傷は腱の障害にすることができ、腱治癒17を損なう可能性がある。縫合技術は、修復後の腱のパッピングを最小限に抑えるために、バランスがとれて比較的非弾性な強力な幾何学的修復を提供する必要があります。また、縫合糸の位置及び結び目の位置は、十分な強度の発生が得られるまで、滑空、血液供給および治癒を妨げないように戦略的に配置されなければならない。

破裂した腱の間に弱いET移植片または他の移植材料を確保するための実現可能性を確立するために、我々はそれが成熟し、徐々に生体内の宿主組織に統合できるように移植片をオフロードすることができる新しい縫合技術を開発した。

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プロトコル

注:実験設計と倫理的承認は、UCL機関審査委員会(IRB)から得られました。すべての実験は、欧州指令2010/63/EU(2013)の改正法を用いて、1986年の内務省の規制と動物のガイドライン(科学的手続き)法に従って行われました。ウサギは、名前の付いた獣医(NVS)によって定期的に、そして名前付き動物福祉官(NACWO)によって1日に2回検査されました(内務省のガイドラインと規制に従って)。彼らは安楽死するまで痛みの兆候を示さなかった。

1. 組織設計腱(ET)移植片の調製

  1. コラーゲンヒドロゲルを作製するには、ラットテールコラーゲンタイプ1モノマーコラーゲン溶液(0.6%の酢酸2.15mg/mL、総タンパク質0.2%w/v)と10倍のミニマルエッセンシャル培地500μLを加えます。5 Mおよび1 M水酸化ナトリウムに対して、500 μLを加えて中和し、500 μLのダルベッコの修正イーグル培地(DMEM)を加えます。
  2. この溶液の5mLをカスタム構築された長方形の金型(33mm×22mm×10mm、120g重量)に注ぎます(図1)。マトリックスアセンブリ19を可能にするために、37 °CでCO2インキュベーターに金型を保管し、5%CO2を15分間保持します。

2. 移植片の作製

  1. 重合後、コラーゲンヒドロゲルを金型から取り出し、標準のプラスチック圧縮アセンブリに入れる(図2A)19。
  2. コラーゲンヒドロゲルを2枚の50μmナイロンメッシュシートの間に入れ、120g(全表面積7.4cm2、これは1.6kPaに相当する圧力)の静的負荷を5分間塗布し、ヒドロゲルから間質流体を除去する(図2A)。ヒドロゲルから排出された流体を吸収するために、4層の濾紙を使用します。
  3. 4層の圧縮ゲルを互いに重ねて巻き、15 mmセグメント(図2C)に切り分け、ETを製造します。
    注:16〜25週の新しいゼランドの白人男性ウサギが実験に使用されました。
  4. ヒプノルム(0.3 mg/mL)の筋肉内(i.m)用量で動物を鎮静し、ペントバルビトンの過剰摂取を投与することによって安楽死させる。
  5. 安楽死の直後に、両後足の毛を整えます。次いで、サイズ20の外科用ブレードで、脛骨後部(TP)腱を露出させるために、下脛骨領域の周りに9cmの切開を行う。
  6. 同じ大きさの外科用ブレードを使用して、平均長さ70mmのラピンTP腱を物品化し、乾燥を避けるために実験プロセス中にPBSで湿潤を保ちます。

3. 新しいテノルラフィー技術の開発

注:縫合線( 材料表を参照)は非吸収性であり、合成線形ポリオレフィンであるポリプロピレンの等方晶晶性立体から作られています。コア連動縫合糸は主に3-0で構成され、末梢縫合糸は6-0であった。これらは、すべての実験で使用される2つの主な縫合糸でした。

  1. 外科用ブレードで、中点でTP腱を切断します。腱の中央から腱の15mmセグメントを物品切り、ETコラーゲン移植片に置き換える(図2D)。3-0縫合糸をネイティブ腱端から近位に近くへ連動する(図3A)。
  2. 3-0コア縫合糸を移植片の全長以上に渡し、切り取り端から遠ざかってインターロックします。
  3. ETの両端をネイティブ腱に固定し、2本の腱端をカップリングすることで、周囲に6-0と連続して走る縫合糸を持つ(図3B)。これは、移植片がネイティブ腱20に張力を置くことによって縫合糸上で容易に移動できるように行われる。
  4. 上述のように縫合糸を確保した後、縫合糸の張力が適切であり、縫合糸全体にフラクシディ性がないことを手動で確認してください。

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結果

これは腱に見られる主要なタンパク質であるため、I型コラーゲンから作られたコラーゲン移植片を使用しました。これは、腱の総コラーゲンのほぼ95%を構成します;したがって、コラーゲンは、生体内腱を模倣するための理想的な特性をすべて示した21,22.

本研究では、使用したI型コラーゲンをラット尾腱から抽出し、酢酸(2.15mg/mL)に溶解した。このコラーゲンを重合させるために、インビトロで水酸化ナトリウムで中和し、非架橋性異方性コラーゲン線維を形成した。このヒドロゲルは98%の流体を含み、製造中20分以内に生体内の生体組織を模倣することができます23.しかし、このヒドロゲルは機械的に弱い。したがって、機械的特性を高めるために、我々は、圧縮度が...

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ディスカッション

本研究では、コラーゲンが天然ポリマーであるため、組織工学的I型コラーゲン移植片が腱移植片として選ばれ、様々な組織工学用途27,28の生体材料として使用された。また、コラーゲンは、腱の乾燥質量の60%を構成し、そのうち95%が1型コラーゲン21、29、30、31、32である。 生着が成功するためには、移植片の機械的特性は、天然腱33と理想的に一致する必要があります。しかし、現在の工学的手法では、ET(4.41 N)の機械的特性は、ネイティブ腱(NT)(261.08N)33に対して著しく...

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開示事項

著者らは、利益相反はないと宣言している。

謝辞

著者たちは、このプロジェクトに資金を提供したUCLを認めたいと考えています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ラットテールタイプ1コラーゲン First Link, Birmingham, UK60-30-810
prolene sutures 6-0Ethicon Ltd, エジンバラ, 英国
EP8726H prolene sutures 3-0Ethicon Ltd, エジンバラ, 英国D8911
Whatman濾紙SIGMA-ALDRICH 
WHA10010155 Gibco DMEM、高グルコースサーモフィッシャーサイエンティフィック 
ナイロンメッシュ プラストーク(メッシュとろ過)株式会社NAの
11574486

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