Method Article

新鮮単離ラット脳微小循環から膜のサンプルを準備するシンプルで再現性のある方法

DOI:

10.3791/57698

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May 7th, 2018

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1Department of Pharmacology, College of Medicine, University of Arizona, Tucson

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、ラット脳微小血管の分離膜試料の調製の方法を説明します。このプロトコルには、個々 の動物から得られる許容可能なタンパク質試料濃縮微小血管を生産の明確な利点があります。サンプルは、脳微小血管内皮細胞で堅牢なタンパク質解析に使用できます。

Abstract

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血液脳関門 (BBB) は、様々 な病態生理学的および薬理学的刺激に応答する動的なバリア組織です。これらの刺激の結果としてそのような変更大幅脳への薬物送達を調節でき、延長によって、病気の原因のかなりの挑戦中枢神経系の治療に (CNS)。薬物治療学に影響を与える多くの BBB 変更は、ローカライズは、内皮細胞のレベルで表現するタンパク質を含みます。確かに、健康および病気の BBB の生理学的な知識は、これらの膜タンパク質の研究に大きな関心を呼んでいます。基本的な科学研究の観点から、これは単純なが堅牢で再現性のある実験動物から採取した脳組織から血管の分離法のための要件を意味します。新鮮単離血管から膜サンプルを準備するためにサンプル準備が血管内皮細胞に富むが、単位 (すなわち、アストロ サイト、ミクログリア、ニューロンの他の細胞型の存在下で限定が肝要です。ペリサイト)。付加的な利点は、個々 の動物から実験群におけるタンパク質発現の真の変動を捕捉するためにサンプルを準備する機能です。本稿では、ラット脳微小血管の分離と膜試料の調製に利用されるメソッドに関する詳細情報が提供されます。派生した、サンプルの微小血管濃縮サンプル バッファーのデキストランをふくむ 4 遠心分離手順を使用して実現されます。このプロトコルは、特定のアプリケーションの他の所で簡単に対応できます。生理学的、病態生理学的、および薬理学的刺激への BBB 対応の理解を助けることができる大きくタンパク質解析実験から堅牢な実験データを生成するため、このプロトコルから生成されるサンプルを示されています。

Introduction

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血液脳関門 (BBB) は、中枢神経系 (CNS) と全身循環間のインターフェイスに存在して、脳のホメオスタシスの維持に重要な役割を果たしています。具体的には、正確にコントロール溶質濃度1中枢神経系のかなり代謝要求を満たすために脳組織に必要なこれらの栄養素を効率よく供給して脳細胞外液中に BBB の機能。これらの役割は、微小血管内皮細胞のレベルに主に存在する、BBB は脳実質に潜在的に有害物質ができませんを確保しながらアクセスするいくつかの物質を有効に離散のメカニズムを持つ必要がありますを意味します。蓄積されます。確かに、脳微小血管内皮細胞は穴あきではなく、非選択的透過性2の欠如を保証する限られた pinocytosis を展示します。脳微小血管内皮細胞が物理的な隣接する血管内皮細胞間の「封印」と大きく脳に血液媒介物質の傍細胞拡散を制限するフォームに動作するタイトのジャンクションと adherens ジャンクション蛋白質を表現するさらに、実質。確かに、内因性および外因性物質の選択的な透磁率は、吸収と排出トランスポーター3の機能発現を必要とします。全体的に、タイトな接合、アドヘレンスジャンクション、トランスポーターは、BBB のユニークなバリア性を維持するためにコンサートで動作します。

BBB は生理学的、病態生理学的、および薬理学的刺....

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Protocol

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下記すべての手続機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) によって承認されているし、国立衛生研究所 (NIH) と動物研究に準拠: In Vivo実験 (到着) ガイドラインを報告します。プロトコルの手順のフローは、図 1に描かれています。

1. セットアップ手順について

  1. 脳微小血管バッファー (BMB) を準備します。54.66 g D-マンニトール、1.90 g グリコールエーテルジアミン四酢酸、および 1.46 g 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (すなわち、トリス) ベースをきれいなビーカーに計量して起動します。1.0 L の脱イオン水を追加します。磁性攪拌器を使用して BMB バッファーのコンポーネントをミックスします。ソリューションが完全に混合されて、一度 7.4 1.0 M HCl を使用してに pH を調整します。
  2. 動物の麻酔前に 26% デキストラン (75,000 MW) ソリューション (w/v) を準備します。次の手順で説明するように、デキストラン ソリューションを準備します。
    注: それがデキストランは緩衝水溶液で分解する約 1.5-2 時間を取ることができるので、早めにこのソリューションを準備する重要です。
    1. きれいなビーカーに粉末デキストラン (100 m....

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Results

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ラット脳微小血管の分離と微小血管膜試料の準備のための実験の流れは図 1に示します。ここに示す手順を使用して、ラットの脳からそのまま微小血管の正常な分離を示す (図 2 a)。これらの血管は、デキストランと膜サンプル (すなわち、完了ステップ 4.10) を準備する遠心を開始する前にすぐに遠心分離が完了できた。この画像、微小血管は脳微小血管内皮細胞2,11,13、細胞膜に表現されるよく示されているトランスポーター Oatp1a4 の抗体による染色します。 18。西部のしみの分析 (図 2 b)、雌性ラットから採取した血管からの準備が示された膜を.......

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Discussion

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この記事では新鮮なラット脳組織から分離された微小血管からの膜蛋白質のサンプルの準備のシンプルで効果的な方法を説明します。文献13,20,21,22で孤立した血管からラット脳微小血管の分離および/または膜の準備世代のためのいくつかの方法が報告されています。,24. 上記微小血管の隔離のプロトコルは、原則的に似ていますが、このアプローチが単一の実験動物から優秀な蛋白質収量膜試料の準備を有効にする最適化されています。この事前を不要とプールの微小血管に少なくとも 3 つの Sprague-dawley ラットから満足のいくタンパク質濃縮タンパク質解析のための様々 なアプローチで使用するためのサンプルを得るために。このようなアプローチなどが西部のしみの分析、ドット ・ ブロット、co 免疫沈降に限定されません。大きく 1 つ.......

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Disclosures

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著者が明らかに何もありません。

Acknowledgements

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この作品は、PTR に健康の国民の協会 (R01 NS084941)、(ADHS16-162406) アリゾナ州医学研究委員会からの補助金によって支えられました。ワシントン州は、過去の国家機関の健康研修助成金 (T32 HL007249) 博士前期予定からサポート受けています。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
プロテアーゼ阻害剤カクテルSigma-Aldrich#P8340脳微小血管緩衝液成分
D-マンニトールSigma-Aldrich#M4125脳微小血管緩衝液
EGTASigma-Aldrich#E3889脳微小血管緩衝液成分
Trizma BaseSigma-Aldrich#T1503脳微小血管緩衝液成分
デキストラン (MW 75,000)Spectrum Chemical Mftg Corp#DE125脳実質から微小血管を分離するための遠心分離ステップで使用されるデキストラン
ゼタミンMWI アニマルヘルス#501072全身麻酔薬
キシラジンウエスタンメディカルサプライ#5530全身麻酔薬
0.9% 生理食塩水ウエスタンメディカルサプライN/A一般麻酔薬希釈剤
濾紙(直径12.5cm)VWR#28320-100脳組織からの髄膜の除去に使用されます
遠心分離管Sarstedt#60.540.386デキストラン遠心分離ステップに使用される使い捨てチューブ
Pierce™Coomassie Plus (Bradford) AssayThermoFisher Scientific23236膜調製物中のタンパク質濃度の測定
Wheaton Overhead Power HomogenizerDWK Life Sciences#903475サンプルの均質化に必要
10.0ml ガラス乳鉢と乳棒ティッシュグラインダーDWK Life Sciences#358039サンプルの均質化に必要
塩酸Sigma-Aldrich#H1758緩衝液のpH調整に必要
ウシ血清アルブミンThermoFisher Scientific#23210ブラッドフォードアッセイ用タンパク質標準
標準鉗子Fine Science Tools#91100-12脳組織の解剖に使用
Friedman-Pearson RongeursFine Science Tools#16020-14脳を分離するために頭蓋骨を開くために使用
50 ml 円錐形遠心分離管ThermoFisher Scientific#352070分離後の脳組織の収集に使用
ガラス パスツール ピペットThermoFisher Scientific#13-678-20Cデキストランスピン後の細胞破片の吸引に使用
エタノール、無水Sigma-Aldrich#459836ティッシュグラインダーの洗浄に使用; 蒸留水
で70%に希釈超遠心チューブBeckman-Coulter#41121703サンプルの超遠心分離に使用
成分 #

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).
  2. Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T.

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