Ex Vivoショウジョウバエにおける内分泌シグナル伝達する脳の反応を可視化するためのカルシウム イメージング

サマリー

本稿では、ショウジョウバエの脳のカルシウム イメージング前のヴィヴォのプロトコルについて説明します。この方法で天然または合成化合物は、脳の特定の神経細胞をアクティブにする能力をテストするバッファーに適用できます。

要約

内分泌シグナルによる臓器に通信たとえば、脳に周囲からは恒常性を維持するために不可欠。内分泌研究のためのモデルとして、キイロショウジョウバエ、遺伝学的ツールとゲノム情報が洗練された、これがますます使用されています。この資料では、ショウジョウバエ脳外植体のカルシウム イメージング法について説明します。このメソッドは、脳にホルモンの直接シグナルを検出できます。多くのペプチッド ホルモン行動を通じて G タンパク質共役受容体 (Gpcr) が活性化は、細胞内 Ca^{2 +}濃度の増加を引き起こすことが知られています。神経活性化は、細胞内の Ca^{2 +}濃度 Ca^{2 +}流入の Ca^{2 +}細胞質網状質 (ER) に格納されているリリースからも高めます。カルシウム センサー、GCaMP は、これらの Ca^{2 +}変更を監視できます。この方法で GCaMP は関心のニューロンで表現され GCaMP 表現する幼虫の脳は解剖、養殖前のヴィヴォ。テストのペプチドが脳植に適用されますし CCD カメラを装備して回転ディスク共焦点顕微鏡を用いた GCaMP の蛍光変化を検出する.このメソッドを使用すると、任意の水溶性分子をテストことができますと適切な蛍光インジケーターを使用して神経の活性化に関連付けられている様々 な携帯電話イベントをイメージすることができます。また、他のショウジョウバエや他の動物の臓器を画像に、イメージングのチャンバーを変更すると、このメソッドを使用できます。

概要

臓器器官のコミュニケーションは、環境の変化に対処するための恒常性を維持するための進化上保存された戦略です。人間、内分泌腺からホルモン直火のさまざまな循環に。これらのホルモンの多くは代謝過程と^1,2を供給など基本的な動作を調節する脳の視床下部をターゲットします。多くのホルモンは、哺乳類のモデルを使用して発見されています。しかし、彼らの行動は、彼らが参加、特に interorgan ネットワークのメカニズムはほとんど不明します。

キイロショウジョウバエは、臓器器官のコミュニケーションを研究するための有用なモデルとして登場しました。昆虫では、多くの生理学的なプロセスはホルモンによって制御されます。成長と変容に着目した初期の研究では、大型の昆虫を使用しました。これらの研究で削除または特定の臓器の移植は、臓器間のシグナリング分子の存在を予言その後、幼若ホルモン (JH)、Prothoracicotropic ホルモン (PTTH) とエクダイソン生化学的精製^3,4,5をだった。細胞内情報伝達の大家族は、昆虫のライフ サイクル⁶

プロトコル

1. 幼虫の脳外植片の準備

1. イメージング室を作る。
   注: 脳外植片が係留される安定した記録が必要です。ここでは、低コスト、手作りのイメージング商工会議所は、Ca^{2 +}イメージング システムで使用されます。
   1. 鉗子を使用して、取り付け簡単 (手順 1.3,図 1) を作る幼虫の脳の腹側神経節の凹みを作成するプラスチック製培養皿 (35 mm × 10 mm) の底面の中心を傷つけます。
   2. 、つまようじでくぼみの両側に瞬間接着剤の小さなドロップを配置し、タングステン棒 (径 0.125 mm、6 〜 7 mm 長さ) を接着剤に添付します。
   3. パテのような再利用可能な接着剤の小さなピースを使用して、作る円形の壁 (10 mm 径、高さ 3 mm) 周囲の凹み (図 1)。
      注: 壁の内側の空間が後で満ちるリン酸緩衝生理食塩水 (PBS; 0.14 M NaCl、0.0027 M KCl、0.01 M PO₄^{3 -}、pH 7.4 ± 0.05 25 ° C で)。
2. 動物の準備
   注: カルシウム イメージング、カルシウム インジケーター、GCaMP6s は組織特異 GAL4 とUA GCaMP6sの組み....

結果

このプロトコルを使用すると、ペプチド ホルモン、CCHa2、インスリン産生細胞脳 (IPCs) の活性化を調べた。GCaMP6s とラベル付けされた野生型脳の IPCs dilp2 -GAL4¹² (ルイグソン博士からの贈り物) とUA GCaMP6s¹³ (キム博士からの贈り物) の組み合わせを使用します。合成 CCHa2 ペプチドと扱われた幼虫の脳外植体と GCaMP6s からの蛍光は、リアルタイムで記録されました。この実験では、1 つの焦点平面から画像を得た。各 IPC クラスターを含む約 14 セル¹⁴、および 3 から 6 セルまでの信号が検出されました。GCaMP6s 信号強度は CCHa2 管理 (図 2A、映画 1) に劇的に増加しました。野生型の脳はグレリンやノシセプチンに明らかな反応.......

ディスカッション

Ca^{2 +}イメージング法は、ここで説明した脳のホルモンの機能をテストするための便利なシステムです。生体内で、脳は様々 な内分泌腺からホルモンを受け取ります。さらに、脳は常に自発神経活性化を引き起こす感覚情報を昇順を認識します。この前のヴィヴォシステムは、このようなノイズを排除し、生体内イメージングより良い信号/ノイズ比が得られます。このシステムは、単独または組み合わせて分子をテストできます。ペプチド ホルモンに加えて天然または合成化合物を含む任意の水溶性分子は脳外植体に適用できます。

Ca^{2 +}イメージング、脳外植片が係留される必要があります。ポイントの低融点アガロースこの目的のため作られたゲルのマトリックスまたはフィブリンが従来の^16,17。これらのゲルのマトリックスがサンプルを安定保持できる、30 ° C 以上に組織を加熱するただし、この温度は、昆虫などの poik.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
タングステンロッド	AMシステム、スクイム、ワシントン州、米国	717000
Blu Tack	Bostik、パリ、フランス	3049100	パテのような再利用可能な接着剤
時計ガラス、正方形、1 5/8	in Carolina Biological Supply Company、バーリントン、ノースカロライナ州、米国	742300
PBS	TAKARA Bio Inc.、草津、滋賀、日本	T900	リン酸塩緩衝塩
CCHa2	SCRUM Inc., Tokyo, Japan		Custum-synthesized peptide
Ghrerin	Peptide institute Inc., 大阪, 日本	4372-s
Nociceptin	Peptide institute Inc., 大阪, 日本	4313-v
Axio Imager A2	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Axio Imager A2	蛍光顕微鏡
Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27	Carl Zeiss,オーバーコッヘン、ドイツ	420957-9900-000	水浸対物レンズ
P-725 PIFOC 対物レンズ	Physik Instrumente GmbH & Co. KG, カールスルーエ,	ドイツ N/A	圧電式レンズムーバー
共焦点スキャナーユニット CSU-W1	横河電機株式会社, 東京, 日本	CSU-W1	スピニングディスク共焦点ヘッド
ImagEM C9100-13	浜松ホトニクス 静岡県静岡市	C9100-13	EM-CCD カメラ
OBIS 488 nm LS 60 mW	Coherent, Santa Clara, CA, USA		1178770 488-nm レーザー
488/568/647 nm 横河電機ダイクロイックビームスプリッター	Semrock, Rochester, NY, USA	Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5	ダイクロイックビームスプリッター
528/38 nm BrightLine シングルバンドバンドパスフィルター	Semrock, Rochester, NY, USA	FF01-528/38-25	発光フィルター
&マイクロ;マネージャー	Open Imaging, Inc.	N/A	https://micro-manager.org
ImageJ	U.S. National Institutes of Health	N/A
https://imagej.nih.gov/ij/ TurboReg	Philippe Thévenaz, Biomediccal Imaging Group, スイス連邦工科大学ローザンヌ	N/A	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/

長距離 校