方法論記事

Dibromomaleimide 二硫化化学蛍光ペグインターフェロン ウイルス様粒子を抱合誘導を作る

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DOI：

10.3791/57712

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2018年5月27日

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1Department of Chemistry & Biochemistry, University of Texas at Dallas, 2Undergraduate Biology, University of Texas at Dallas, 3Undergraduate Healthcare Studies, University of Texas at Dallas, 4Departments of Chemistry & Biochemistry and Biomedical Engineering, University of Texas at Dallas

この記事について

サマリー

蛍光 dibromomaleimide と Qβ VLP のジスルフィドを匹敵する手順を紹介します。Dibromomaleimide と Qβ との共役反応 dibromomaleimide 機能分子の合成と精製 Qβ 式について述べる。結果として得られる黄色蛍光共役粒子は細胞内蛍光プローブとして使用できます。

要約

近年医療ウイルス様粒子 (群集) の生合成、個々 のサイズ、遺伝的プログラミング、生分解性の容易さの材料研究を帰することができると。彼らは化反応反応表面で合成配位子を追加するために、これらの水溶液生まれカプシドに化反応方法論の範囲は比較的限られています。機能性材料研究の方向性を容易にする、非伝統的な化反応の反応を考慮されなければなりません。このプロトコルで記述されている反応は、バクテリオファージ Qβ に基づいて、VLP の露出のジスルフィド結合の溶媒に新しい機能を導入する dibromomaleimides を使用します。さらに、最終製品が蛍光、市販のフィルターのセットを使用して追跡可能な体外プローブの生成の付加的な利点を持っています。

概要

ナノサイズのウイルスのカプシドを使用してエキサイティングな分野、生物医学研究1,2,3のアプリケーションの範囲を拡大することを目的として浮上しています。Recombinantly 発現ウイルス様粒子 (群集) は構造的に、ウイルスから派生したが、彼らはそれらに非感染性のタンパク質粒子を作る元のウイルスの遺伝物質を欠いています。表面の特徴は、遺伝的プログラムし、各キャプシドはそれ前後のものに同じように表現の場所および原子レベルの精度でアミノ酸の反応性側鎖の数を知ることは不可能です。多くの場合、外装と内装の両方の表面には各種溶媒露出しているアミノ酸残基を動けなかった化反応反応合成、生体分子間に共有結合を形成する反応を官能基化することができますが所有しています。分子4,5。

化反応の反応は、比較的簡単な方法でより多様な機能を持って興味の分子を助けます。治療薬6、蛍光タグ7およびポリマー8,9など、興味の分子は事前合成でき、それらが群集の表面に接続された前に特徴付けられます。生体に特に一般的な VLP と生体材料研究 recombinantly 表現としては 28 nm の正二十面体のカプシド10バクテリオファージ Qβ に基づいて VLP をされています。Qβ に最も一般的な反応のサイトは、最近 dibromomaleimide ライン ハデルトン ベイカー反応による Qβ の毛穴縮小ジスルフィド化合物の成功活用11をお伝えしてきました、大差でリシンです。反応が良いと進む収量および、同様に重要なは、粒子の熱安定性を失うことなくが。同時にこの反応は、細胞にこれらの粒子の摂取量を追跡する使用ことができます活用誘起蛍光法を生成します。この作品は、明るい黄色の蛍光体にハデルトン ベイカー反応による Qβ の表面上にポリエチレング リコール (PEG) の活用を紹介します。彼らが細胞によってとられる、これらの粒子を追跡、ことができます。本プロトコルはその原則溶媒露出ジスルフィドを含む他の多くの群集の 1 つに適用されますが、タンパク質ナノ粒子 Qβ、に基づいて新しい蛍光ペグインターフェロンを生成の研究者を助けます。

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プロトコル

1. 準備

  1. ホストゲノム スープ (LB) 寒天培地を作るし、プレート12を注ぐ。
  2. WtQβ コート蛋白質シーケンスを含む pET28 プラスミドを持つ BL21(DE3) を変換します。
    1. 雪解けの氷浴で大腸菌BL21(DE3) 有能なセル。微量遠心チューブ内のセルの場所 50 μ L。
    2. 1 つの管にプラスミッドの 2 μ L を追加し、軽くはじきます。氷上で 30 分間インキュベートします。
    3. 熱衝撃を与える 45 セル正確 42 ° C では水浴の s熱衝撃の直後に氷風呂に戻って、チューブを置き、5 分間インキュベートします。
    4. どんな抗生物質を含まない LB 媒体の 950 μ L を追加します。
    5. 37 ° C で 60 分 200 rpm で文化を振る
    6. (カナマイシン) と LB 寒天培地プレート上のカルチャの 100 μ L をプレートし、プレート 37 ° C で一晩インキュベート必要なとき白人が植民地を選択します。
  3. スーパー最適スープ (すすり泣き) メディアを作る。
    1. オートクレーブ 2 2 L superdry サイクルのエルレンマイヤー フラスコに困惑します。
    2. 無菌環境で重量を量り、トリプトン 20.0 g を追加、5.0 グラム酵母抽出物、無水硫酸マグネシウム、2.469 g 0.584 g 塩化ナトリウムの各フラスコに塩化カリウムの 0.186 g。
    3. もたらす、ボリューム 1 L を純水と各フラスコとオートクレーブで液体のサイクル。
    4. すすり泣きメディアはオートクレーブ後部屋の温度に達すると、メディアの各リットルにカナマイシン (100 mg/mL) の 1 つの mL を追加し、4 ° C で保存
  4. 0.1 M カリウム リン酸緩衝液 (7.00) を確認します。
    1. 500 mL の純水に塩基性のカリウム 68.045 g を溶解することにより 1 M カリウム塩基性溶液を作る。
    2. 87.09 g カリウム 500 mL の純水に塩基の溶解によって 1 M カリウム二塩基溶液を作る。
    3. 38.5 mL カリウム塩基性溶液と塩基性のカリウムの 61.5 mL を 1 L ボトルに追加します。
    4. 7.00 必要な場合、pH を調整し、1 L のボリュームをもたらす
  5. 0.1 M カリウム リン酸緩衝液 (7.00) で 5-40% のサッカロースの勾配を作る。
    1. 50 mL 遠沈管に 0.1 M カリウム リン酸緩衝液 (7.00) に溶解 (5% ずつ増えていく) 5-40% スクロース ソリューションを準備します。
    2. 3.3 mL の長い針の注射器を使用して 38 mL 丸底ポリカーボネート管の下部に 5% ショ糖溶液を沈殿物し、他の 5 つのチューブのこの手順を繰り返します。
    3. 慎重にチューブの下部に 10% ショ糖溶液の 3.3 mL を入金し、グラデーションを妨げないよう針を慎重に取り外します。その他の 5 つのチューブに繰り返します。
       
  6. スクロース溶液、グラデーションを邪魔しないように注意しながら各管で 40% に 15% から増加の 3.3 mL 層を預金を続けます。
  7. 完了したら、箔グラデーションのトップをカバーし、-80 ° C で保存

2. Qβ の式

  1. 1:1 漂白剤/エタノール ベンチ領域を拭いてください。
  2. 無菌環境で無菌環境ですすり泣きメディアの 3 mL にエシェリヒア属大腸菌BL21(DE3) のシングル コロニーを追加することによって 2 つの 3 mL スターター文化を作る。
  3. 37 ° C と 0% の相対湿度 (rH) ルームで 250 rpm でシェーカーで一晩成長します。
  4. すすり泣きメディア スターター文化を接種します。
    1. シェーカーを両方 3 mL スターター文化を取るし、無菌環境で 2 つのスターターの各カルチャを注ぐ 2 L 困惑新鮮なすすり泣きメディアそれぞれの 1 リットルのエルレンマイヤー フラスコ。
    2. 37 ° C と 0 %rh ルームで 250 rpm でシェーカーに接種のメディアを配置します。
  5. 外径600 0.9 ~ 1.0 に達するまで 37 ° C と 0 %rh ルームで 250 rpm でシェーカーで細菌を成長します。
  6. 1 M イソプロピル β D 1 thiogalactopyranoside (IPTG) タンパク質の発現を誘導するために P1000 ピペットを使用しての 1 つの mL を追加します。
  7. 37 ° C と 0 %rh ルームで 250 rpm でシェーカー一晩メディアを残します。
  8. メディア シェーカーから次の朝、遠心分離機を使用して削除 1000 mL ボトル 20,621 × g で 4 ° C で 1 時間のセルを収穫します。
  9. 上澄みを廃棄し、細胞ペレットを収集します。
    1. 上清を細菌を殺すために漂白剤約 5 mL をフラスコに注ぐ。これは無駄です。
    2. 遠心ボトルの底から細胞ペレットをこすり、50 mL の遠心管にペレットを入れるには、ヘラを使用します。

3. Qβ の精製

  1. 〜 20-30 細胞ペレットを再懸濁します mL の 0.1 M カリウム リン酸バッファー (pH 7.00)。
  2. 再懸濁は、チャンクを持たないかどうかを確認し、製造元のプロトコルに従って microfluidizer プロセッサを使用して細胞を溶解 (材料の表を参照してください)。粒子の収率を高めるために、少なくとも 2 回の細胞を溶解させます。
  3. 遠心分離機のライセート 20,621 x g で 250 mL 遠心ボトルで 4 ° C で 1 時間
  4. ペレットを破棄し、mL の上澄みの体積を測定します。0.265 によってその値を乗算し、上清に硫酸アンモニウムの量を追加します。
  5. タンパク質を沈殿させるのに 200 rpm で攪拌プレート上で、少なくとも 1 時間のための 4 ° C でかき混ぜます。
  6. 4 ° C で 1 時間 20,621 x g で 250 ml の遠心します。
  7. 上澄みを廃棄し、0.1 M カリウム リン酸緩衝液 (7.00) の約 10 mL にペレットを再懸濁します。
  8. 数秒間原油サンプルとミックスにボルテックスの 1:1 クロロホルム/n-ブタノールの平等なボリュームを追加します。
  9. 4 ° C で 30 分間 38 mL 管 20,621 × g で遠心します。
  10. パスツール ピペットを使用してトップの水層を回復します。水溶液と有機層の間を形成している層のようなゲルのいずれかを取らないように注意します。
  11. 6 5-40% 既製サッカロースの勾配を解凍し、それぞれの上に抽出液の約 2 mL をロードします。
  12. 無料減速 4 ° C で 16 時間 99,582 × g で遠心。
  13. 各チューブの下の発光ダイオード (LED) の光を当てるし、青色のバンドが表示されます。長い針の注射器を持つこれらの粒子を回復します。
  14. Ultrapellet 4 ° C で 2.5 h 370,541 x g で粒子
  15. 上澄みを廃棄し、0.1 M カリウム リン酸緩衝液 (7.00) で精製した粒子の透明ペレットを再懸濁します。

4. 数量、製品の確認

  1. ブラッドフォードの試金を使用して、製品13を定量化します。
  2. 実行の削減と非還元ナトリウム dodecyl 硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE)14製品を確認します。
    注: SDS ページを減らす; 外被蛋白質の分子量を確認するため非還元 SDS-PAGE 高次構造を確認することです。

5. DB 化合物 Qβ の活用

  1. Qβ のジスルフィドを減らします。
    1. 0.0020 g を溶かす tris(2-carboxyethyl) 1 mL の 100 倍原液を純水にホスフィン (TCEP)。
      注: は、削減前に新鮮な TCEP を準備します。
    2. 微量遠心チューブに Qβ (5 mg/mL) の 200 μ L を追加します。
    3. 100 x TCEP 原液の 20 μ L を追加することによって従ってください。
    4. 1 時間室温で孵化させなさい。
  2. 再ブリッジ削減二硫化 dibromomaleimide ポリエチレング リコール (PEG-DB) を使用します。
    1. DMF の 100 μ L で (DB PEG) dibromomaleimide - ポリエチレング リコールの 0.0017 g を溶解します。
    2. 10 mM リン酸ナトリウム溶液 (pH 5.00) 680 μ L を追加します。
    3. DB ペグのソリューションに Qβ を削減を追加し、365 nm の紫外線ランプの下で混合過程を観察します。明るい黄色蛍光は、混合時の 365 nm ハンドヘルド UV ランプを即座に視覚化できます。
    4. 一晩、ロティサリー室温 (RT) で進む反応をしましょう。
  3. 遠心フィルターによって反応混合物を浄化 (COMW = 10 kDa) 3 回 4 ° C で 20 分 3,283 × g で 1 x PBS を使用して
  4. 非還元 SDS-PAGE とネイティブの agarose のゲルの電気泳動によって活用を監視します。
    注: 群集はそのままネイティブ agarose のゲル粒子として実行、彼らは、電荷、サイズや形状に基づいて区切られます。

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結果

Dibromomaleimide 誘導体は、dibromomaleimide 無水物とアミン15間の縮合反応によって合成できます。また、N-メトキシカルボニル活性化 3, 4-dibromomaleimide を使用して穏やかな合成法16が収量 DB ・ ペッグ (図 1) に methoxypolyethylene リコール (PEG) と反応してここで悪用されました。NMR は、化合物の構造 (図 2) を識別するために使用されました。Qβ VLP は、28 nm 正二十面体タンパク質ナノ粒子、180 と同じ外被蛋白質で構成されています。外被蛋白質は隣接コート蛋白質17β シートと α ヘリックス ドメインを介して非連動の二量体を形成する傾向があります。群集は、様々 な溶媒組成

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ディスカッション

ショ糖勾配遠心法に比べて小さい蛋白質の浄化、浄化バクテリオファージ Qβ でユニークなステップです。Qβ はクロロホルム/n-ブタノール抽出手順の後、5 ~ 40% のサッカロースの勾配を使用してをさらに純化されます。遠心分離中に粒子がそのサイズに基づいて分かれています。大きな粒子は小さな粒子のまま低密度地域における高密度領域に旅行します。Qβ はグラデーションのより低い三番目に移動し、小さい蛋白質の不純物は、遠心分離機管の上部に閉じ込められている間そこに残る。Qβ のコロイド懸濁液を示します強いチンダル散乱ショ糖密度勾配、見ることができる青色のバンドとしてから LED の光を当てるときの下に。このバンドは長い注射針を使用して抽出しやすいし。ショ糖の Qβ には、超遠心、ペレット明確なペレットを降伏します。ペレットは、必要なバッファーに再停止またはタンパク質の高速液体クロマトグラフィー (FPLC) によって更に精製できます。結果として得られる粒子の純度は、SDS ページで確認できます。

100 x TCEP 原液をたて水で減少の前に準備されるべきので、TCEP はリン酸バッファー...

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開示事項

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

謝辞

J.J.G. は、彼らのサポートのための国立科学財団 (DMR-1654405) および癌防止研究所のテキサス (CPRIT) (RP170752s) を認めています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
LBブロス(ミラー) EMDミリポア1.10285.0500
トリプトン、Poweder研究製品国際T60060-1000.0
酵母抽出物、Poweder研究製品国際Y20020-1000.0
無水硫酸マグネシウムP212121CI-06808-1KG
塩化ナトリウム(結晶性/認定ACS)フィッシャーサイエンティフィックS271-10
塩化カリウムッシャーサイエンティフィBP366-500
ガPURELABフレックス3浄水システムフィッシャーサイエンティフィック4474524
リン酸カリウム一塩基フィッシャーサイエンティフィックBP362-1
カリウム二塩基性無水フィッシャーサイエンティフィックP288-500
ショ糖フィッシャーサイエンティフィック
エタノールフィッシャー サイエンティフィックBP2818500イ
ソプロピル &β;-D-1-チオガラクトピラノシド (IPTG)シグマ アルドリッチI6758-1G
ファイバーライト F10-4x1000 LEX ローター フィッシャーサイエンティフィック096-041053
アンモニウムP212121KW-0066-5KG
クロロホルムアルファエーザー32614-M6
1-ブタノールフィッシャーサイエンティフィックA399-4
SW 28 Tiローター、スイングバケット、アルミニウムベックマンコールター342204:SW 28 Tiローター/ 342217:バケットセット
タイプ70 Tiローター、固定角度、チタン、8 x 39 mL、ベックマン・コールター337922
Coomassie (Bradford) Protein AssayFisher ScientificPI23200
TRIS HydrochlorideResearch Products InternationalT60050-1000.0
TetramethylethylenediamineAlfa AesarJ63734-AC
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochlorideSigma AldrichC4706-2G
2 3-ジブロモマレイミド 97%Sigma Aldrich553603-5G
ポリチレングリコールAlfa Aesar41561-22
リン酸ナトリウムフィッシャー サイエンティフィックAC424375000
アクリルアミド/ビスアクリルアミドP212121RP-A11310-500.0
ドデシル硫酸ナトリウムSigmaAldrich L3771-100G
過硫酸アンモニウムフィッシャーサイエンティフィックBP179-100
FV3000共焦点レーザー走査型顕微鏡オリンパス FV3000 
Labnetリボルバーアジャスタブルローテーター トーマス・サイエンティフィック 1190P25 
1000 mL Sorvallハイパフォーマンスボトル、PC、アルミキャップ付き Thermo Scientific010-1459
Nalgene 遠心分離ボトル(キャップ付き)、ポリプロピレン共重合体Thermo Scientific3141-0250
Nunc 丸底チューブ、38 mL;PCThermo Scientific3117-0380
2 L 狭口三角フラスコ、ヘビーデューティリムPyrex4980-2L
Amicon Ultra-4 遠心フィルターユニットミリポアシグマUFC801024
M-110P マイクロフルイダイザー 材料プロセッサーマイクロフルイディクスM-110P
Nalgene 高速ポリカーボネート丸底遠心分離管サーモScientific3117-0380PK
ボトル、キャップ アセンブリ付き、ポリカーボネート製ベックマン コールター41121703
シリンダー、目盛り付き - ポリプロピレン 250 mLPolyLab80005
533LS-E シリーズ 蒸気滅菌器Getinge533LS-E
TrueLine、細胞培養プレート、処理済み、PS、96 ウェル、蓋付きLabSourceD36-313-CS
ファルコン 15 mL コニカル遠心分離管フィッシャー・サイエンティフィック14-959-53A
マイクロセンティフュージ チューブ: 1.5mLフィッシャー・サイエンティフィック05-408-129
VWR Os-500 オービタルシェーカーVWR サイエンティフ プロダクツ14005-830
テトラ・ハンドキャスト・システムバイオ・ラッド1658000FC
ポリプロピレン、250 mLベックマン・コールター41121703
分光蛍光光度計 NanoDropThermo Fisher Scientific3300
Long Needle ハミルトン 7693
エクセルインターナショナル5〜6 ccシリンジルアーロックフィッシャーサイエンティフィック14-841-46
P1000ピペットマンギルソンF123602
P200ピペットマンギルソンF123601
P100ピペットマンギルソンF123615
P20ピペットマンギルソンF123600
P10ピペットマンギルソン
インテル 計量 PM-100 ラボ クラシック 高精度 ラボ バランスインテリジェント ウェイト テクノロジーIWT_PM100
ファルコン 50 mL 円錐形遠心分離機 チューブフィッシャー サイエンティフィック14-432-22
4–15% ミニプロティアン TGX ゲル、10 ウェル、50 µlバイオ・ラッド456-1084
フィックエル性リン酸S25590B硫酸付き F144802

参考文献

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