周辺嗅覚組織の開発を準備する分子とショウジョウバエの免疫組織化学的解析

Summary

ここでは、ステージし、解剖ショウジョウバエ種から嗅覚の組織を開発するためのプロトコルを提案する.解剖組織は、免疫組織化学または上皮内などの生体内解析だけでなく、定量的 RT-PCR (逆転写ポリメラーゼ連鎖反応) や RNA 配列 (RNAseq) などの分子生物学的解析の後で使用できます。交配。

Abstract

ショウジョウバエの嗅覚は発達神経生物学、システム神経科学、神経生理学、行動、行動の進化で広く使われているシステムです。ショウジョウバエ嗅覚組織の水力発電と熱感覚ニューロンに加え揮発性化学手掛かりを検出嗅覚受容神経細胞 (ORNs) 家します。このプロトコルでは大人のショウジョウバエ種の嗅覚の末梢組織の開発の解剖について述べる。最初にステージングして、半ば蛹と大人からアンテナの解剖によって続いて蛹初期から続く、触角の解剖によってショウジョウバエ幼虫の年齢方法について述べる。我々 も準備を qRT PCR、RNAseq、または免疫組織化学の RNA の抽出など、分子生物学の手法で活用できるメソッドに示します。これらのメソッドは、種特異的な蛹の発育度の決定、および適切な高齢化の各段階の計算後、他のショウジョウバエの種に適用もできます。

Introduction

発達神経生物学、システム神経科学、神経生理学、行動学、行動の進化^{1,2,3、ショウジョウバエの嗅覚システムは広く使用されているシステム 4}。ショウジョウバエ嗅覚組織の水力発電と熱感覚ニューロン^1,5,6に加えて揮発性化学手掛かりを検出嗅覚受容神経細胞 (ORNs) 家します。この原稿の全体的な目標は、ステージおよびショウジョウバエ種の蛹と大人の嗅覚組織の開発を分析する方法を示すことです。この技術のための理論的根拠は体内組織ラベリング技術にさらに RNAseq、定量的 RT-PCR など、周辺の嗅覚システムの分子・発達的分析に蛹の段階からサンプルを生成するには.この手法は、特定型のセルのすべての遺伝子導入試薬を持っていない非キイロショウジョウバエ ショウジョウバエの種から開発大人嗅覚システムの転写プロファイルのダイナミクスを識別する特に役立ちますラベリングと分析。本稿では、触角のディスクと蛹と大人の....

Protocol

次のプロトコルは、デューク大学研究倫理委員会の倫理規範と一致。

1. 組織ショウジョウバエ蛹の発育の準備及び

1. まず、どのように多くのハエが郭清の必要があります。RT-PCR および RNAseq は、前、8 h APF、40 h APF、および大人の段階で必要である個人から 100-200 触角ディスクと触角を収集します。免疫組織の個々 の 10-20 を解剖します。
2. 郭清パッドおよび鉗子、70% のワイプを使用してを含むすべての材料をきれい江藤。切り裂かれた材料は RNA の抽出に使用する RNase 中和剤できれい、ヌクレアーゼ フリーのいずれかを使用してすべてのソリューションまたはピロ炭酸ジエチルエステル (DEPC) 処理水。
   注: このプロトコルは、ガラスではなく、解離の解離のシリコン パッドを使用します。シリコン パッドは超微細鉗子にやさしい、高速かつ高品質の解離を促進します。
3. 0 h APF/前ステージで蛹を収集します。
   1. 最も正確なステージングを確認するには、30 分を 1 時間間隔で幼虫を監視します。
      注: やや混雑したボトルで放浪 3 齢幼虫は数時間以内は蛹可能性が高い。
   2. 幼虫は不動なり非常に軽い (ほぼ白) 色蛹ケースに囲まれている、一度、小 2 で湿ったろ紙を敷いたシャーレに転送します。
   3. 1-2 時間、時折....

Results

切り裂かれた発展途上の嗅覚組織遺伝子発現を評価する RT-PCR による RNA 抽出の使用ことができますまたはその表現パターンとの遺伝子の細胞内の局在を決定する免疫プロトコルによって取ることができます。関心します。このセクションのいずれかのプロトコルからの代表的な結果を提案する.図 1は、代表定量的 RT-PCR 野生型アダルト アンテナの細胞表面受容体と嗅覚受容体遺伝子の転写を示します。図 2は、6-8 h と Rn EGFP トランスジェニックに 12 h APF の触角染色ハエを使用して抗 GFP (1: 1000) と反ラミン抗体 (1: 100) (図 2Aおよび2 b)。Rn EGFP 蛹初期触角ディスク内の特定領域にラベルを付けます。40 h APF 蛹触角抗 GFP 抗体染色Or67d GAL4 UA .......

Discussion

この議定書は遺伝子と転写プログラム開発ショウジョウバエ嗅覚組織だけでなく、これらのプログラムの比較分析ショウジョウバエで動作を識別するのに興味を持って実験室のための有用なリソース種。それは、将来の研究のためのプライマーとしてさまざまな発達段階からシステム レベルの転写プロファイルが必要な場合に便利です。ここで説明されているプロトコルはステージし、分化される前のパターンから嗅覚システムの開発の 4 つの主要段階からサンプルを取得するショウジョウバエの嗅覚組織の開発を分離する方法を示します分子および免疫組織学的研究.ショウジョウバエの解剖触角ディスクとさまざまな蛹段階でアンテナは定量的 RT-PCR による RNA シーケンスによるシステム レベルまたは個々 の遺伝子レベルでの嗅覚系開発時の遺伝子発現プロファイルを識別する使用できます。サンプルは、体内の組織特異的遺伝子発現のパターンを識別する免疫組織および上皮内交配のため使用できます。このプロトコルの追加の利点は、解離の標準的な方法を使用して、FAC 並べ替えなど、セル型固有の分子分.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X リン酸緩衝生理食塩水	Gibco	70011-044	RNase 遊離水
CO2 タンク	エアガス	CD R200
2 つの鋭い鉗子 (Dumont #55)	Fine Science Tools	11255-20
Trizol	Invitrogen	15596-026	RNA Isolation solutions
解剖顕微鏡
			が入った小さなバケツ
P20およびP200マイクロピペットとチップ
1.7mLマイクロフュージチューブ			最良の結果を得るためにヌクレアーゼフリーを購入
0.2mL PCRチューブ
パラホルムアルデヒド粉末	ポリサイエンス	380
10% トリトンX-100	テクノバ	T1105	1X PBS
2インチペトリ皿
	Whatman	1001-055	水で濡らし、ペトリ皿に入れて蛹を湿らせます
25 Cインキュベーター
イオンH2O			ヌクレアーゼフリーを購入するか、DEPC
シルガード184シリコーンエラストマーキット	ダウコーニング		で処理しますテリザキのプレートカバーから解剖パッドを作るのに使用します。
蓋付きMicroWellミニトレイ	Nunc	438733	蓋は、シリコーン解剖パッドを作るために使用することができます
ウサギ抗GFP抗体	MBL国際企業	PM005	一次抗体
マウス 抗RAT CD2	AbD seroTec	MCA154RHDL	一次抗体
ADL195(抗ラミン、マウス)	Dev研究 hydoma ban	ADL195-s	一次抗体
アレクサフロー®488 ヤギ抗ウサギ IgG (H+L)	invitrogen	A11008	二次抗体
Cy3 ヤギ抗マウス IgG	Jackson ImmunoResearch	115-166-003	二次抗体
Triton X-100、タンパク質グレード界面活性剤、10% 溶液、滅菌ろ過	CALBIOCHEM	648463	界面活性剤
ラボ ローテーター	サーモサイエンティフィック		ローテーター
ヌクレアーゼフリーウォーター	Growcells.com	NUPW-0125	水
用軽量ティッシュワイパー	VWR	82003-822	洗浄解剖用品
上付き文字II	invitrogen	18064014	逆転写酵素
QIAshredder (50)	RNA抽出	QIAGEN	79654
Oligo(dT)12-18 Primer	RT	life technologies	18418012
RNeasy MinElute Cleanup Kit (50)RNA	extraction	QIAGEN	74204
FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN)	qPCR	Roche	04913850001
FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER	qPCR	Roche
06402712001 LIGHTCYCLER 480 - MULTIWELL PLATE 96	qPCR	Roche	04729692001
NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix	qPCR	NEB	M0541S