Method Article

緑の蛍光蛋白質感染時に細菌から配信されるエフェクターを視覚化するシステムを分割します。

DOI:

10.3791/57719

⸱

May 24th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Science, Plant Genomics and Breeding Institute, College of Agriculture and Life Science, Seoul National University, 2Department of Bioindustry and Bioresource Engineering, Sejong University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

挑戦している宿主細胞に細菌によって分泌されるエフェクターを監視する蛍光タンパク質ベースのアプローチ。これは蛍光タンパク質とタイプ III の分泌システムとの互換性がないのためにです。ここでは、最適化された分割 superfolder GFP システムはホスト植物の細胞に細菌によって分泌されるエフェクターの可視化に使用されます。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

菌は, 各種の植物病害の最も重要な病原は、植物の免疫システムを破壊する宿主植物細胞にエフェクターのセットを分泌します。感染時に細胞質のエフェクターはタイプ III の分泌システム (T3SS) を介してホスト細胞質に配信されます。植物細胞には、出産後、effector(s) は生存と病原体のレプリケーションのためのホスト細胞プロセスを調整する特定の区画を対象します。蛍光タンパク質を用いた病原性でその機能を理解する宿主細胞のエフェクター蛋白質の局在や細菌から直接注入されるエフェクターのダイナミクスの解明に関するいくつかの研究があったもののT3SS と蛍光タンパク質との間の非互換性のためにチャレンジしております。

ここでは、エフェクター細胞内細菌 T3SS を介して配信の局在に最適化された分割 superfolder 緑の蛍光蛋白質システム (sfGFPOPT) の最新手法について述べる。SfGFP11 (11th β 鎖の sfGFP)-サイトで蛍光発光するターゲット特定のオルガネラ sfGFP1 10OPT (1-10th β 鎖 sfGFP の) リード、T3SS から分泌されるタグのエフェクターを組み立てることができます。このプロトコルは、シロイヌナズナとベンサミアーナ タバコ植物の特定の細胞小器官の腐からエフェクター蛋白質と再構成された sfGFP 蛍光信号を視覚化するための手順を提供します。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

植物は、細菌、真菌、ウイルス、昆虫、線虫のライフ サイクル全体を含む多数の侵入病原体が発生する付着生物です。病菌属やシュードモナス属などのグラム陰性の細菌性病原体、植物の中で傷や気孔、イネなどの自然開口部を介して入力することによって宿主植物に感染する1。正常にホスト植物を植民地化、細菌性病原体は様々 な病原性因子2を開発する進化しています。細菌には、宿主の植物が侵入する、彼らは病原性タンパク質のシリーズを注入-エフェクターとして知られている-病原性を促進するために植物細胞に直接。これらのエフェクターを抑制する植物の免疫を調節するや細菌生存3が発生するホストの細胞プロセスを操作します。

病原細菌は、主にホスト セル4に直接エフェクタータンパク質を提供するのに、T3SS を使用します。T3SS ホスト細胞5の注射部位に内側と外側の細菌膜足場タンパク質の構造から接続する針のようなチャネルを持つ分子注射器に似ています。この T3SS を介したエフェクター (T3E) 分泌メカニズムが人間と同様に植物の様々 なグラム陰性細菌病原体でよく保存されています。代表的な植物病原体、 P. 腐pv の一つ。....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注: 特に明記しない限り、すべての手順が常温で実行をされます。

1. 植物材料 (4 週間) の準備

  1. (名) 形質転換植物のための準備
    1. 各ポットの土の表面に(名) ベンサミアーナの 2 種をまく、プラスチック製のドームを持つトレイを蓋をして 25 ° C、16/8 h/暗日長サイクル 60% 湿度成長室で発芽する種子を許可します。
    2. 2 週間後を選ぶと各ポットに小さな芽を破棄し、ステップ 1.1.1 の発芽の同じ成長の条件の下で植物を成長を続けます。2 日毎トレイあたりの水の 1 リットルを追加します。
      注: ラボ間植物の成長の条件が異なる場合があります。したがって、健全な状態で植物を育てる正規の水まきプロトコルに従います。
    3. 週に新しいトレイに植物を転送し、さらなる成長のための十分なスペースを配置します。4 週齢に潜入する準備ができるまで、手順 1.1.1 で説明した条件の下で植物の成長を維持します。
      注: 植物の成長は、ラボ間成長条件によって異なる場合があります。通常、我々 は 4 週齢を見つける(名) 形質転換植物負担約六つの葉。
  2. シロイヌナズナ形質転換植物のための準備
    1. 材料表を参照し、形質転換シロイヌナズナ<....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GFP の β バレル構造は 11 β ストランドの構成され、2 つのフラグメント、1 10thストランド (GFP1 10OPT) および 11th (GFP11) 繊維に分けることができます。どちらも 2 つのフラグメントを自分で蛍光の自己組織化 sfGFP は近接 (図 1 a) 2 つのフラグメントが存在するとき蛍光を生成できます。このシステムは、sfGFP1 10OPTで-植物シロイヌナズナまたは(名) ベンサミアーナを表現する緑膿菌sfGFP11 タグ付きのエフェクターを運ぶと再接種されます。宿主細胞の細胞質に緑膿菌によって配信タグ sfGFP11 エフェクター細胞質で表される sfGFP1 10OPTに再構成し一緒にターゲット コンパートメント (図 1 b) .......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここで説明したプロトコルを使用して、感染にホスト植物細胞注入の細菌 T3SS エフェクタータンパク質の正確な局在を監視するため。以前は、分割 GFP システムは哺乳類タンパク質23,36の内局、サルモネラT3E ローカリゼーション、アグロバクテリウムVirE2 配信に T4SS を通じて研究するツールとして使用された、植物は細胞37をです。植物細胞でこのシステムを適用すると、以前の研究は、遺伝子組換えトウモロコシ植物細胞質 GFP1 10 と遺伝子組換え菌を恒常表す経路、GFP11 タグ エフェクター蛋白質を表現を使用します。ただし、トウモロコシ ・米国アルテリシジンシステムは転エフェクター蛋白質の表現のレベルが弱いため高レベルのバック グラウンド蛍光妨げ再構成された GFP シグナル38の検出成功していません。この問題を解決するために sfGFP1 10.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者はある利益相反を開示します。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、基本的な科学研究開発プログラムを通じて、国立研究財団の韓国 (NRF) 科学省、ICT および DC の将来計画 (NRF 2018R1A2A1A05019892)、(植物分子育種センターからの助成金を資金によって支えられました。PMBC) の EP に農村開発局 (PJ013201) の次世代 Biogreen 21 プログラムの撮影のための共焦点顕微鏡を提供する環境管理センター計装のイメージング センターに感謝いたします。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
シロイヌナズナトランスジェニックラインPark, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. &Dinesh-Kumar, S. P. スプリット蛍光タンパク質フラグメントを使用したIII型分泌によるPseudomonas syringaeエフェクターの時空間モニタリング.植物細胞。日本赤十字・赤十字 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10ABRCCS69831
NU-sfGFP1-10ABRCCS69832
PT-sfGFP1-10ABRCCS69833
MT-sfGFP1-10ABRCCS69834
PX-sfGFP1-10ABRCCS69835
ER-sfGFP1-10ABRCのCS69836
GO-sfGFP1-10ABRCCS69837
PM-sfGFP1-10ABRCCS69838
オルガネラ標的 sfGFP1-10OPT プラスミドPark, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. &Dinesh-Kumar, S. P. スプリット蛍光タンパク質フラグメントを使用したIII型分泌によるPseudomonas syringaeエフェクターの時空間モニタリング.植物細胞。29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10Addgene97387
NU-sfGFP1-10Addgene97388
PT-sfGFP1-10Addgene97389
MT-sfGFP1-10Addgene97390
PX-sfGFP1-10Addgene97391
ER-sfGFP1-10Addgene97392
GO-sfGFP1-10Addgene97393
PM-sfGFP1-10Addgene97394
ER-sfCherry1-10Addgene97403
ER-sfYFP1-10Addgene97404
CYTO-sfCFP1-10Addgene97405
sfGFP11-tagged T3SS-based effector delivery systemPark、E.、Lee、HY、Woo、J.、Choi、D.&Dinesh-Kumar, S. P. スプリット蛍光タンパク質フラグメントを使用したIII型分泌によるPseudomonas syringaeエフェクターの時空間モニタリング.植物細胞。29 (7), 1571-1584 (2017)
pBK-GW-1-2Addgene98250pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t;カナマイシン(25 ug / ml)
pBK-GW-1-4Addgene98251pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t;カナマイシン(25 ug / ml)
pBK-GW-2-2Addgene98252pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t;カナマイシン(25 ug / ml)
pBK-GW-2-4Addgene98253pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t;カナマイシン(25 ug / ml)
pBG-GW-1-2Addgene98254pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t;ゲンタマイシン(25 ug / ml)
pBG-GW-1-4Addgene98255pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t;ゲンタマイシン(25 ug / ml)
pBG-GW-2-2Addgene98256pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t;ゲンタマイシン(25 ug / ml)
pBG-GW-2-4Addgene98257pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t;ゲンタマイシン(25 ug / ml)
Bacterial strains
Agrobacterium tumefaciens GV3101Csaba KonczおよびJeff Schell、TL-DNA遺伝子5のプロモーターは、新しいタイプのAgrobacteriumバイナリベクターによって運ばれるキメラ遺伝子の組織特異的発現を制御します。モルゲンジェネ。204,383-396 (1986);ゲンタマイシン(50 ug/ml)およびリファンピシン(50 ug/ml)
Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500Kvitko, B. H. et al. Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III分泌エフェクター遺伝子のレパートリーにおける欠失は、エフェクター間の機能的重複を明らかにしています。PLoSパトグ。5 (4) (2009).;リファンピシン(100 ug / ml)
<ストロング>培地成分
<ストロング>植物発芽培地2.165g / Lムラシゲ&を追加スクーグパウダー、ショ糖10g / Lを水に。pH 5.8に調整し、2.2 g / Lのフィタジェルを追加します。.オートカルブ。
ムラシゲ&ビタミンDuchefa BiochemieM0222、4°Cで保存します。
スクローDuchefa BiochemieS0809
PhytagelSigma-AldrichP8169
LB培地10 g / Lトリプトン、5 g / L酵母抽出物、10 g / L NaClを水に加えます。固体培地の場合は、15 g/Lのマイクロ寒天培地を加えます。オートクレーブ 溶液を55°Cに冷まします。C、必要に応じて抗生物質を追加します。
トリプトンBDバイオサイエンス211705
酵母抽出物BDバイオサイエンス212750
NaClデュチェファ生化学S0520
マイクロ寒天デュチェファ生化学M1002
<強い>キングスB培地10 g/L プロテアーゼ ペプトン #2、1.5 g/L 無水 K2HPO4、15 g/L の寒天を水に。オートクレーブ。55°Cまで冷却します。Cおよび滅菌15 ml/Lグリセロール、5 ml/L MgSO4を培地に加えます。必要に応じて抗生物質を追加します。
プロテオース・ペプトンBD バイオサイエンス212120
無水 K2HPO4Sigma-Aldrich1551128 USP
グリセロール・デュチェファ・バイオケミーG1345
MgSO4Sigma-AldrichM7506
バクト寒天BD バイオサイエンス214010
<強>マンニトール-グルタミン酸(MG)液体培地10 g/Lのマンニトール、2 g/LのL-グルタミン酸、0.5 g/LのKH2PO4、0.2 g/LのNaCl、および0.2 g/LのMgSO4を水に加えます。pH 7 に調整
マンニトールDuchefa BiochemieM0803
L-グルタミン酸Duchefa BiochemieG0707
KH2PO4Sigma-AldrichNIST200B
浸透バッファー10 mM MES (2-(N-モルフォリノ)-エタンスルホン酸)、10 mM MgCl2、150 µMアセトシリンゴン。pH 5.6;使用前に新しいバッファーを準備してください。
MESDuchefa BiochemieM1503100 mM(pH 5.6)のストックを水で調製します。フィルター滅菌します。
MgCl2Sigma-AldrichM8266水に100 mMストックを調製します。オートクレーブ。
アセトシリンゴンSigma-AldrichD134406DMSOで150 mMのストックを調製します。
共焦点顕微鏡 機器/材料
710レーザー走査型共焦点システムCarl Zeiss
Axio observer Z1 倒立顕微鏡Carl Zeiss
ヨウ化プロピジウムThermoFisherP1304MP
を含むSkoog媒体はスする

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Melotto, M., Underwood, W., He, S. Y. Role of stomata in plant innate immunity and foliar bacterial diseases. Annu Rev Phytopathol. 46, 101-122 (2008).
  2. Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invas....

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Tags

Split GFP SystemEffector Protein DeliveryType III Secretion SystemConfocal MicroscopyPseudomonas SyringaeArabidopsis ThalianaNicotiana BenthamianasfGFP11 TagOrganelle TargetingFluorescence Reconstitution

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