緑の蛍光蛋白質感染時に細菌から配信されるエフェクターを視覚化するシステムを分割します。

植物は、細菌、真菌、ウイルス、昆虫、線虫のライフ サイクル全体を含む多数の侵入病原体が発生する付着生物です。病菌属やシュードモナス属などのグラム陰性の細菌性病原体、植物の中で傷や気孔、イネなどの自然開口部を介して入力することによって宿主植物に感染する¹。正常にホスト植物を植民地化、細菌性病原体は様々 な病原性因子²を開発する進化しています。細菌には、宿主の植物が侵入する、彼らは病原性タンパク質のシリーズを注入-エフェクターとして知られている-病原性を促進するために植物細胞に直接。これらのエフェクターを抑制する植物の免疫を調節するや細菌生存³が発生するホストの細胞プロセスを操作します。

病原細菌は、主にホスト セル⁴に直接エフェクタータンパク質を提供するのに、T3SS を使用します。T3SS ホスト細胞⁵の注射部位に内側と外側の細菌膜足場タンパク質の構造から接続する針のようなチャネルを持つ分子注射器に似ています。この T3SS を介したエフェクター (T3E) 分泌メカニズムが人間と同様に植物の様々 なグラム陰性細菌病原体でよく保存されています。代表的な植物病原体、 P. 腐pv の一つ。トマト欠陥 T3SS の通常ある DC3000 hrcC変異は、この突然変異体植物 (エフェクター蛋白質を注入する) による免疫⁶を完全に抑制するのことができない可能性があります植物の成長を制限しています。宿主細胞への移行、時にエフェクター対象植物防御反応、遺伝子の転写、細胞死、プロテアソーム、小胞の売買、およびホルモン経路⁷を含め、ホスト細胞システムにとって重要な様々 なホスト蛋白質^,8,9,10します。 したがって、宿主細胞のエフェクター蛋白質の局在の追跡は植物の免疫系の変調に関してその機能を理解するための魅力的なターゲットです。

T3Es の局在論のほとんどは、アグロバクテリウム-仲介されたホスト植物⁹に大きな蛍光タンパク質の過剰発現を採用しています。ただし、他の種で導入された遺伝子の異種表現方法は誤ってローカライズ済みまたは時折機能的な^11,12,13に示されています。さらに、いくつかの研究は、細菌のエフェクターがホスト細胞報^14,15,16,17の適切なターゲットのための変更を受けることを明らかにしました。したがって、一過性細胞は機能的または定量的病原体感染¹⁸時 T3SS によって配信されるエフェクターと同じかもしれない植物の細胞質内のエフェクタを表明しました。また、適切なエフェクターの配信と可視化^18,19を破壊するエフェクタータンパク質に大きな蛍光タグ融合かもしれない。したがって、完全に T3E 関数を試金するこれらのアプローチは T3SS 分泌エフェクタのネイティブのローカライズを反映可能性があります。

緑色蛍光タンパク質 (GFP) 発色団²⁰含まれています中央の鎖を囲む 11 鎖 β バレルで構成されます。ワルドら小さな部品で構成される新規分割 GFP システムを報告 (GFP β ストランドの 11;GFP11) と大規模な相補的なフラグメント (GFP β ストランド 1-10;GFP1-10)²¹。フラグメント自ら発するかないが、両方のフラグメントは、互いに近接するとき自己集合時に蛍光を発する。蛋白質折りたたみ効率の最適化のため、GFP、すなわちsfGFP と sfGFP^OPT、堅牢な折りたたみ変形後分割 GFP システム^{20,21,22 の}ため開発されました。最近では、単一のアミノ酸変異亜種 sfGFP1 10 の^OPT- sfYFP1 10^OPTと sfCFP1 10^OPT- をそれぞれ sfGFP11 フラグメントとを黄色とシアン蛍光再構成することができます, 生成された²³.さらに、sfCherry、mCherry の派生物を裂くことができる sfGFP²³と同じ方法で sfCherry1 10 と sfCherry11 の断片に。

このシステムは、ラベルおよびサルモネラ²⁴.からエフェクタを使用して感染中に HeLa 細胞における T3SS エフェクタを追跡に適応されています。ただし、それは以前最適化されていないホスト植物細菌病原体システムのため。最近では、我々 は植物細胞²⁵にP. 腐から配信される T3Es の細胞内分布を監視する改良された sfGFP1 10^OPTに基づく分割 GFP システムを最適化しました。^{様々 な細胞内コンパートメントに sfGFP1 10OPTを表現する生成された植物形質転換シロイヌナズナの植物細胞で異なる細胞内コンパートメントに T3Es の局在論を容易にするには、25}です。 また、さまざまなを運ぶプラスミッド オルガネラ sfGFP1 10^{オプトイン}ターゲットを絞ったアグロバクテリウム-仲介された一時的な過剰発現と T3SS ベース エフェクター配信用タグ付きの sfGFP11 ベクトルが生成されたも。様々 な形質転換シロイヌナズナラインと関心の T3Es を表現するプラスミッドの種子は、材料表^26,27に記載されているソースから取得できます。

次のプロトコルの分割 sfGFP システムを用いたホスト細胞内の細菌によって配信エフェクタの原動力を監視する最適化されたシステムについて述べる.組換え sfGFP11 プラスミドを運ぶ遺伝子組換え菌と sfGFP1 10^OPTを発現する植物の感染結果 sfGFP11 タグ エフェクタの宿主細胞に緑膿菌からの配信。したがって、これらの蛋白質は再構成された、特定対象区画に若し。腐の pv。トマトCUCPB5500 ひずみ 18 エフェクタが削除されますは、この株はシロイヌナズナと(名) ベンサミアーナs²⁸低またはない細胞死を示したので使用されました。ただし、すべての材料とここで説明する手順、交換または他の生物学的質問や与えられた実験室の条件の最適化の調査の分割 sfGFP システムに適応するように変更できます。

注: 特に明記しない限り、すべての手順が常温で実行をされます。

1. 植物材料 (4 週間) の準備

1. (名) 形質転換植物のための準備
   1. 各ポットの土の表面に(名) ベンサミアーナの 2 種をまく、プラスチック製のドームを持つトレイを蓋をして 25 ° C、16/8 h/暗日長サイクル 60% 湿度成長室で発芽する種子を許可します。
   2. 2 週間後を選ぶと各ポットに小さな芽を破棄し、ステップ 1.1.1 の発芽の同じ成長の条件の下で植物を成長を続けます。2 日毎トレイあたりの水の 1 リットルを追加します。
      注: ラボ間植物の成長の条件が異なる場合があります。したがって、健全な状態で植物を育てる正規の水まきプロトコルに従います。
   3. 週に新しいトレイに植物を転送し、さらなる成長のための十分なスペースを配置します。4 週齢に潜入する準備ができるまで、手順 1.1.1 で説明した条件の下で植物の成長を維持します。
      注: 植物の成長は、ラボ間成長条件によって異なる場合があります。通常、我々 は 4 週齢を見つける(名) 形質転換植物負担約六つの葉。
2. シロイヌナズナ形質転換植物のための準備
   1. 材料表を参照し、形質転換シロイヌナズナ種子の注文します。
   2. 1 mL の蒸留水に 50 ~ 100 形質転換シロイヌナズナ種子を浸漬し、発芽の発症を同期する暗闇の中で 3 日間の 4 ° C で保存します。
   3. プラグ工場トレイの土壌表面に 2 ~ 3 種をまくし、プラスチック製のドームとトレイをカバーします。23 ° C、10/14 h/暗日長サイクル 60% 湿度で発芽する種子を許可します。
      注: 種子についてをする必要があります。ただし、バッチ内の遺伝子の存在を再確認をお勧めします。この場合、70% エタノール、50% の漂白剤の 2 分間洗浄することにより種子を殺菌する (約 2% 次亜塩素酸) 0.05% を含む 5 分トリトン X-100 に従う二重滅菌蒸留水 (ddH₂O) で 5-6 回を洗浄します。滅菌後、3 日間の 4 ° C で分類や形質転換植物を選択する hygromycin B の 25 μ g/L を含む植物発芽メディアにそれらを板します。
   4. 週後に、プラグあたり 1 つだけの工場を残して、ステップ 1.2.3 の使用同じ成長の条件の下で植物の成長を続けます。
      注: 4 週古い植物は、 P. 腐感染に使用されました。水植物は植物を健康に保つために毎日。

2.緑膿菌文化 (〜 1 週) の準備

1. 緑膿菌の変換のプラスミドの建設
   1. 材料表を参照し、T3SS ベース エフェクター配信システム ベクター²⁵の目的の vector(s) を注文します。
   2. ²⁵をクローニング部位特異的組換えを使ってエフェクタ配信ベクトルに興味のエフェクター遺伝子を挿入します。
      メモ: フルレングス エフェクター蛋白質の細胞内局在を監視する場合は、pBK-GW-1-2 または pBG-GW-1-2 にフルレングスの遺伝子を置きます。PBK-GW-1-4 を選択するもまたは pBG GW 1 4 2 を含む x sfGFP11 の蛍光信号を増加しました。シグナルペプチドを欠けている部分的なエフェクター、場合 pBK-GW-2-2 または pBK-GW-2-4 を使用します。公園らエフェクター配信ベクトル²⁵の詳細についてを参照してください。
2. P. 腐pv sfGFP11 タグに融合したエフェクターを運ぶプラスミッドを変換します。トマト(Pst)CUCPB5500 標準エレクトロポレーション²⁹を使用します。
   注: 必要な場合は、他の緑膿菌種を使用できます。広範囲なベクトル³⁰ sfGFP11 タグのシステムを構築し、エフェクターの遺伝子発現は、緑膿菌などのfluorescens (イーサン)³¹に匹敵する AvrRpm1 のプロモーターによって規制されています。
3. 変形菌を 25 μ G/ml ゲンタマイシンや 25 μ G/ml カナマイシン 100 μ g/mL リファンピシンを含む王の B 寒天の表面に優しく します。2 日間の 28 ° C の孵化させなさい。
4. 使用すると、ベクトルの適切な抗生物質で王の B 液体メディアに 1 つのコロニーを接種して 200 rpm で振とうしながら一晩で 28 ° C 細胞の成長します。
5. グリセロール ストックを作る。オートクレーブのグリセロールを最終濃度 50%、-80 ° C でストアに追加します。

3. (名) ベンサミアーナ(4 日間) で細胞小器官をターゲットとした sfGFP1 10^OPTの一過性発現

1. アグロバクテリウム文化の準備
   1. (材料の表を参照してください) の細胞小器官をターゲットとした sfGFP1 10^OPT plasmid(s) の目的の vector(s) を注文します。
   2. アグロバクテリウムひずみ GV3101 細胞³²plasmid(s) に変換します。2 日間の 50 μ g/mL カナマイシンと 28 ° C で 50 μ g/mL リファンピシン ルリア ベルターニカミラ (LB) 寒天培に細胞を成長します。
   3. LB 寒天培地の単一コロニーから 5 mL の液体 LB 培地 50 μ G/ml カナマイシンおよび 50 μ G/ml のリファンピシンに細胞を接種します。200 rpm で振とうしながら一晩で 28 ° C 細胞を成長します。
   4. 3,000 x g で 10 分間の遠心分離によって細胞培養上清中のメディアを注ぐし、たての 1 mL にペレットを再懸濁します収穫した浸潤バッファーです。
   5. 600 の吸光度で光学濃度 (OD) の値を取得することによってアグロバクテリウムの量を測定 (Abs 600 nm) の nm。浸潤バッファーと 0.5 に細菌の OD₆₀₀を調整します。
      注: 懸濁液の 1 mL は、2 つのスポットに潜入するのに十分です。
   6. 常温浸透前に 1-5 h の穏やかなロッカーに文化を残します。
   7. 10 μ L チップと潜入する葉の中心に穴を突きます。アグロバクテリウムの懸濁液に潜入するのに 1 mL の無針注射器を使用します。慎重に、ゆっくりと注入する注射器を介して葉の向軸側にステップ 3.1.5 から調製した懸濁液の約 500 μ L。実験的複製に対して、少なくとも 3 つの異なる植物に浸透を繰り返します。
      注: 保健及び安全性の理由から、眼の保護は浸透中に着用する必要があります。
   8. 葉の残りの細菌懸濁液を拭き取るし、浸透した領域の境界をマークします。
   9. 2 日間ステップ 1.1.1 の使用同じ成長の条件の下で浸透した植物を保ちます。

4.膿(4 日間) の接種

1. 2 日間の 28 ° C で適切な抗生物質で王の B 寒天にステップ 2.5 のグリセロール ストックから変換された緑膿菌のひずみを連勝します。
   注:緑膿菌の健康は非常に重要です。植民地にもなっていない場合、セルを再び連勝または進む前に王の液体培地における細胞に伝達します。
2. マンニトール グルタミン酸 (MG) 一晩 200 rpm で振とうしながら 28 ° C で液体培地における緑膿菌細胞の loopful を接種します。
3. 3,000 x g で 10 分間の遠心分離によって細胞を培養上清中のメディアを注ぐ収穫 10 mM MgCl₂でペレットを再懸濁し、0.02 (1 x 10⁷ cfu/mL) に外径₆₀₀を調整(名) ベンサミアーナ葉と 0.002 (1 x 10⁶cfu/mL)シロイヌナズナの葉.の
4. (名) ベンサミアーナ、sfGFP1 10^OPTコンストラクトを運ぶアグロバクテリウムが以前 (ようにステップ 3.1.7) 2 日浸透していた葉の領域に緑膿菌懸濁液を浸透します。SfGFP1 10^OPT形質転換シロイヌナズナ、2 つ 4 週齢短い日成長して葉に緑膿菌懸濁液を浸透します。
   注: 少なくとも 3 つの植物実験複製が必要です。

5. sfGFP 共焦点顕微鏡 (1 日) を介して信号の観測

1. 緑膿菌からリーフ ディスクをカット-の葉を接種しました。緑膿菌を浸潤した特定の時間ポイントで画像 40 X を用いた共焦点走査型レーザーによる単一の植物からの 2 つの 2 cm²リーフ ディスク/1.2 NA C アポクロマート水浸対物レンズまたは 63 X/0.8 NA C アポクロマート油浸漬目的。負傷によって殺される死んだ細胞を避けるためには、浸透孔から細胞を観察します。
2. 488 nm アルゴン レーザーの低消費電力設定で観察を開始します。SfGFP を検出するレーザー力を高めます。
   注:、蛍光シグナルを検出するのにレーザー強度の 2-15% を通常使用します。ただし、レーザーの出力と検出設定調整してくださいユーザーの顕微鏡システムに基づいて。ここでは、放出フィルターは 520-550 nm に設定されました。死んだ細胞はしばしば 488 nm レーザー励起下における自動蛍光を発する。したがって、ネガティブ コントロールとして sfGFP11 タグなし同じエフェクターを浸透し、同じ観測条件下で観察する必要があります。さらに、高いレーザー励起はクロロフィルの自家蛍光を引き起こすことができます。したがって、クロロフィルの自家蛍光を誘発しないようにコントロール植物細胞を用いたレーザー光源の強度を調整します。
   1. 細胞壁の counterstaining の 20 mM propidium ヨウ化 (PI) を観測する前に 5-10 分でリーフ ディスクに潜入させます。
   2. 核染色、水で洗浄後 5 分 0.1% パラホルムアルデヒドにリーフ ディスクが水没します。その後、顕微鏡観察の前に 5-10 分でリーフ ディスクに 10 mM PI に潜入します。少なくとも 3 回実験を繰り返します。
      注: この手順は重要な膜や核でエフェクターのローカリゼーションを定義する役に立つです。関心のエフェクターは、特定の細胞小器官の局在を示した場合は、エフェクターの局在を確認する特定の細胞小器官のマーカーを使用します。

GFP の β バレル構造は 11 β ストランドの構成され、2 つのフラグメント、1 10thストランド (GFP1 10OPT) および 11th (GFP11) 繊維に分けることができます。どちらも 2 つのフラグメントを自分で蛍光の自己組織化 sfGFP は近接 (図 1 a) 2 つのフラグメントが存在するとき蛍光を生成できます。このシステムは、sfGFP1 10OPTで-植物シロイヌナズナまたは(名) ベンサミアーナを表現する緑膿菌sfGFP11 タグ付きのエフェクターを運ぶと再接種されます。宿主細胞の細胞質に緑膿菌によって配信タグ sfGFP11 エフェクター細胞質で表される sfGFP1 10OPTに再構成し一緒にターゲット コンパートメント (図 1 b) に若し.図 2は、植物細胞における蛍光信号検出する植物材料とPstの準備から全体的な手順を表します。

本手法の例としてp. 腐エフェクタータンパク質、感染時に徹底したホスト植物の細胞に、T3SS を配信された AvrB を使用しました。シロイヌナズナAvrB は対応する耐性蛋白質、RPM1、過敏感細胞死33を含むトリガー免疫反応によって認識されます。以前の研究では、GFP レポーターの試金および生化学的な試金は、植物細胞33,34,35の血しょう膜の AvrB と RPM1 がローカライズされている明らかにしました。提案手法を用いて AvrB の局在を調べるアグロバクテリウム細胞 sfGFP1 10OPT遺伝子をかくまっては(名) ベンサミアーナで浸透していた。2 日間で AvrB sfGFP11 変換緑膿菌細胞はアグロバクテリウムに接種した-地域に潜入します。補完 sfGFP 蛍光信号のPst CUCPB5500 で観察された (図 3 b) 膜で AvrB sfGFP11 を含んでいます。対照的に、信号が見つかりませんでした感染した細胞のPstでネイティブ AvrB (図 3 a) を運ぶします。

図 1。最適化された分割 GFP システム。(A) GFP の β バレル構造 11 の β ストランドが作られており 1 10回β-鎖 (GFP1-10) と 11 の回β-鎖 (GFP11) に分割することができます。(B) このメソッドで sfGFP11 ストランドだった AvrB に融合し、緑膿菌に変身中は、植物細胞で sfGFP1 10OPTフラグメントの表現されました。(エフェクターのローカライズ) sfGFP 蛍光 sfGFP11 を含む緑膿菌に感染した植物細胞のみが表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2。手順の概要です。形質転換シロイヌナズナや sfGFP1 10OPT- (名) ベンサミアーナを浸透植物Pst CUCPB5500 に感染している注射器浸潤をタグ付きの sfGFP11 のエフェクターを運ぶします。エフェクターのローカリゼーションのサイトで共焦点顕微鏡システム経由で組み立てられた sfGFP の蛍光を検出できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3。(名) ベンサミアーナAvrB sfGFP 検出感染後 3 h の葉します。タグ付きの sfGFP11 AvrB 遺伝子は 5番目または 6番目のリーフ(名) の栽培、2 日前 sfGFP1 10OPTを運ぶアグロバクテリウムによって浸透していたに濾過するpst ファイルの CUCPB5500 抱いてください。細胞壁は propidium ヨウ化によって汚されました。AvrB 専用 sfGFP1 10 OPTを発現している細胞中の蛍光信号 (A) は表示されません。GFP シグナル (黄色の矢印) が 3 h 後への浸透 (B) の AvrB sfGFP11 遺伝子を含むpst ファイルで感染細胞で観察されました。この結果は、細胞質で sfGFP1 10OPTのみ AvrB-sfGFP11、ない AvrB が再構成した、組み立てられた sfGFP は細胞膜に転流しを表します。細胞壁とクロロフィルの自家蛍光マゼンタ疑似カラーを表します。グリーンは、組み立てられた sfGFP 蛍光を表します。スケール バー = 40 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

著者はある利益相反を開示します。