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方法論記事

早期の生後早期のマウス脳に介在ニューロン前駆体の Homochronic 移植

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⸱

DOI:

10.3791/57723

⸱

2018年6月8日

 ,  ,  , 
1Kavli Institute for Systems Neuroscience and Centre for Neural Computation, Norwegian University of Science and Technology, 2Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health

この記事について

サマリー

新しい脳領域の若いニューロンに挑戦と、神経細胞の運命と成熟の環境の sculpts に重要な洞察を明らかにできます。このプロトコルを記述する特定の脳領域からの介在ニューロン前駆体を収穫し、それらのいずれかの homotopically を移植する手順や出生後の子犬の脳にあり。

要約

神経細胞の運命決定と成熟には、遺伝的プログラムや環境の信号間の複雑な相互作用が必要です。しかし、この分化過程を規制する外因性のメカニズムと組み込みのロールを disentangling はすべて発達にかの難問です。この問題は、gaba 作動性介在ニューロン、一時的な萌芽期の構造から生まれた、終脳全体を分散させるため長引く渡り鳥先行き非常に異種細胞集団の拡大です。どのように別の脳環境影響介在ニューロン運命と成熟を探索するには、新生児マウス (P0 P2) で特定の脳領域からの蛍光に分類された未熟な介在ニューロン前駆体を収穫するためのプロトコルを開発しました。この歳で、介在ニューロンの移行がほぼ完了してこれらの細胞は比較的小さなシナプス統合の最終的な休息環境に居住しています。フローサイトメトリーによって単一のセル、ソリューションのコレクション、次のこれらの介在ニューロン前駆体は P0 P2 野生型産後子犬に移植しました。両方つながれたを実行することによって (例えば、皮質-皮質) または異所性 (例えば、野-海馬) 移植、1 つの缶が彼らの運命, 成熟, および回路の集積の影響新しい脳環境で未熟な介在に挑戦を評価。脳が成体マウスの収穫できアッセイはさまざまな移植細胞の免疫組織化学的, を含む posthoc 分析、電気生理学的および転写プロファイリングします。この一般的なアプローチは、どのように異なる脳環境を分析するための戦略を持つ研究者がニューロンの開発の多くの側面に影響を与えるし、特定の神経細胞の特性、主にハードワイ ヤード遺伝プログラムによって駆動されている場合を識別または環境の手がかり。

概要

適切な皮質機能は、興奮性の投射ニューロンと介在ニューロン gaba 作動性抑制性、明瞭な形態、電気生理学的特性、接続性と非常に異質人口のバランスを必要とする神経マーカー。異常な開発および介在ニューロン (および特定の介在サブグループ) の機能は、統合失調症、自閉症、てんかん1,2,3などの精神疾患の病態にリンクされています。さらに、これらの脳障害に関与する多くの遺伝子を若い介在4で濃縮され強く。したがって、通常の開発と多くの脳疾患の潜在的な病因を理解する介在ニューロンの運命決定と成熟を調節するメカニズムの理解が必要です。

2 一時的な萌芽期の構造、内側と仙骨神経節隆起から主に前脳のニューロンが生まれて (MGE と CGE、それぞれ)。これらの後の細胞 (介在ニューロン前駆体) さまざまな回路に組み込まれ、終脳全体で分散する長引く接線方向の移動相を受けます。MGE 派生介在ニューロンから成る 3 主重複、神経に定義されたサブグループ: 高速パルブアルブミン (PV+) 介在ニューロン、高速ソマトスタチン (SST+) 介在ニューロンのスパイクをスパイクと後期神経スパイク硝酸neurogliaform とアイビーの海馬の細胞を構成する酸化物合成酵素 (nNOS+) の介在。多数の研究所が太陽光発電+または SST + 介在ニューロン、モルフォゲン、介在ニューロン前駆体の生年月日および神経因性部モードの空間勾配を含む初期の運命の決定を調整する、MGE 内のいくつかのメカニズムを識別しました。5,6,7,8,9,10. 介在ニューロンが当初 '基本クラス' に区別して徐々 に成熟して '決定的なクラス'11彼らの環境と対話することが提案されています。最近の証拠いくつかの成熟した介在のサブタイプことを示して遺伝子ハードワイ ヤードこれらの細胞は、神経節隆起の後になると初期定義された固有の遺伝的プログラムが以前よりも大きな役割を果たすことを示す感謝12,13。ただし、固有の遺伝的プログラムは、異なる介在サブタイプにドライブ分化する環境手がかりと対話する方法の重要な問題は大部分は未踏。

数多くの研究が様々 な成熟した細胞を移植し、一般的にローカルの内因性回路14,15を抑制する GABA をリリース コンセンサス結果による脳領域に直接 MGE の萌芽期細胞を移植します。 16,17,18,19。ひと誘導多能性幹細胞 (こと) を使用して大きな関心を生成している観測を約束これらの様々 な脳の病気を治療するために介在を派生します。ただし、これらの研究のいくつかの非常には、これらの移植細胞成熟成熟したニューロンの型にかを評価するときに、1 つの重要なコンポーネントは、トランスレーショナル アプローチについて考えています。

環境がどのように介在ニューロン分化と成熟に影響を与えるに対処するため接木介在ニューロンは、ホストの機能を採用するかどうかを調べるために新しい脳環境に未熟な介在ニューロン前駆体を移植して戦略を考案環境またはドナー環境20から機能を保持します。MGE の移植は、MGE は介在および多数の脳領域21全体分散 gaba 作動性投射細胞の混合された人口を含んでいるのでこの質問に対処するため適していません。これらの MGE の細胞は移行が知らなくても、1 つない完全に評価できますこれらの移植、脳環境によってどのように影響を受けるのか。移行を完了し、自分の目標に達している未熟な細胞を取得して初期産後縦長で介在ニューロン前駆体を収穫してこの問題を回避の頭脳領域しますが、最小限の操作環境で。大脳皮質の異なる領域間発現ニューロンの特定の機能に焦点を当て、その後、ホスト環境が介在プロパティを変更する方法を決定できます。このプロトコルで説明する一般的なアプローチは、任意の捜査に適用されるべき新しい環境で挑戦したときを動作することをどのように若いニューロンを検討したいです。

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プロトコル

すべての実験手順、健康の国民の協会のガイドラインに従い行った NICHD 動物ケアおよび使用委員会 (ACUC) によって承認されました。下記プロトコル利用Nkx2.1 CreC/+;+/- Ai9 MGE 派生介在ニューロン前駆体を収穫する子犬しますが、必要な蛍光レポーター マウスの任意の行で実行できます。男性と女性の両方の初期生後マウス (P0 P2) は、ドナーとホストのティッシュを無差別に使用されました。

1. ソリューションの準備

  1. (単位 mm) の次のレシピによるとショ糖人工髄液 (sACSF) の準備: 87 NaCl、26 NaHCO3、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、0.5 CaCl2、7 MgCl2、10 グルコース、95 %o飽和 75 ショ糖2、5% CO2 ph 7.4 を =。
  2. 350 mL 純粋な ddH2O ビーカーはに基づいて最終的な音量の塗りつぶし (sACSF の 500 mL で十分でしょう 1 2 リットル)、電磁攪拌棒を追加し、攪拌プレートにビーカーを置きます。
  3. 一度にすべての塩 (NaCl、NaHCO3KCl、NaH2PO4グルコース、スクロース)、重量、次の表に従って水を追加します。最終的な音量に応じて量を調整できます。
    試薬分子の重量濃度 (mM)グラム/500 mL
    塩化ナトリウム58.44872.54
    重炭酸ナトリウム84.01261.09
    塩化カリウム74.552.50.09
    ナトリウムりん酸一119.981.250.08
    グルコース180.16100.9
    ショ糖342.37512.84
  4. バブルの 95% O25% CO2 (carboxygen) CaCl2 (500 mL sACSF の 1 M 溶液から 0.25 mL) の適切な量を追加する前に、少なくとも 20-30 分の MgCl2 (500 mL sACSF の 1 M 溶液から 3.5 mL) とソリューション.
  5. 標準的な pH 計を用いて pH を確認してください。ソリューションの pH が必要場合、正しく準備 = 7.4。
  6. 純粋な ddH2シリンダー卒業 O と 500 mL の最終巻にソリューションをもたらします。
  7. sACSF ができるまで 1-2 日後に控えを準備します。使用前に氷の場所、解剖の開始前に少なくとも 15 分の carboxygen とバブルし、sACSF の解剖を通してバブルのボトルを維持します。

2. 解剖準備

  1. 次のツールは、/オートクレーブ滅菌する必要があります: 少なくとも 1 つ小さな高級はさみ、2 微細鉗子 (スタイル #5)、曲面微細鉗子、脳 matrice カビやいくつかのかみそりの刃の断面します。頭蓋骨から脳を削除する小さなヘラはオプションです。
  2. ペトリ皿 (9 cm と 4 cm の直径) と解剖の顕微鏡に近い作業ステーションをセットアップ 50 mL 分離脳領域を収集するために円錐形のプラスチック製の管や大口径パイプ プラスチック転送ピペット、すべて氷で保たれます。氷の上の carboxygenated の sACSF のいくつかの 50 mL チューブを準備します。複数の脳領域を解剖、正しくことを確認、明確にラベル コレクション チューブと汚染を避けるため転送ピペット。
  3. 低体温症を通して子犬の氷麻酔追加の氷のバケツ、死体を処分する適切な有害廃棄物バッグがあります。
  4. 組織および trituration のパスツール ピペット火磨かれたガラスを準備します。殺菌し、ピペットの先端を形作るブンゼン バーナーを使用します。異なる穴の開口部をもついくつかのピペットを準備: 大きい (~ 600 μ m)、媒体 (~ 300 μ m) と小 (~ 100 μ m)。流れる水を使用して異なる製粉速度を確保するためのヒントをテストします。各種類の少なくとも 1 つのピペットは分離脳領域ごとに必要ですが、目詰まりやヒントを壊す場合各サイズの余分ないくつかのことをお勧めします。

3. 移植準備

  1. 電極の引き手を使用して細いガラス マイクロ ピペットを準備します。鋭い角度の点を作るべき先端の面取りが壊れたり直径 20 〜 40 を有する先端で μ m。 は確認のほこりを顕微鏡でヒント視覚検査または残留ガラス粒子絞りを妨害しています。
  2. 細い針の注射器を使用すると、完全に鉱物油とガラス マイクロ ピペットを塗りつぶします。Nanoject 装置 (または他のマイクロインジェクション装置) にマイクロ ピペットを挿入します。Nanoject III の次のプログラムを設定: ボリューム = 60 nL 率 = 30、サイクル 25、遅延を = = 1 s。
  3. 磁気ベースに接続されているマニピュレーターに Nanoject を確保し、x または y に沿って斜めに立ち上がるない、Nanoject がまっすぐに指すように、マニピュレーターを調整する軸。
  4. いくつかの接着剤パテを添付 (1 ~ 2 P0 P2 子犬の cm) 子犬の頭の上に高架のサーフェスを作成するシャーレのカバーの上部に。
  5. ラボのカット 6 ~ 8 cm 長いストライプ テープし、真ん中のひし形の穴を作る。テープも皮膚をストレッチし、建造物や対象地域の簡単な可視化をできるようにしながら、中には、子犬の頭を安定させるために使用されます。
  6. インジェクション駅横にある加熱パッドを準備し、注射を開始する前に '低' 設定をオンにします。パッドをカバーいくつかのペーパー タオルやおむつパッドとのそれ。
  7. 小さなハサミを実行する準備ができてがある複数の移植条件を実行するタグにつま先/尾クリッピング子犬受信異なる注射です。

4. P0 P2 マウス脳の除去

  1. 右の手順を開始する前に、冷やして carboxygenated sACSF といくつかのペトリ皿を入力します。〜 25 mL sACSF で採尿管を埋めます。
  2. 氷の下でいくつかのパラフィルムやグローブも覆われている場所で P0 P2 子犬をラップします。5 分間タイマーを設定し、それを起動します。その後、子犬を削除し、後足のピンチには応答しないことを確認してください。
  3. 子犬の首をはねるし、シャーレ sACSF でいっぱいの頭を収集します。頭蓋骨を公開する正中線に沿って皮膚をカットします。
  4. 頭蓋骨の脳/脊髄でのオープニングを検索し、頭蓋骨部背側に沿って鉗子の一方の端を挿入します。優しく正中線で頭蓋骨を持ち、'' 脳を傷つけないように注意しながら、脳を公開するために横方向に離れた部分に皮をむきます。
  5. 頭蓋骨の背と側面部分を除去した時に任意の領域を傷つけないようにしようとして、脳の腹側表面の下にすくって頭蓋骨から脳を取り除きます、鉗子やヘラを使用します。場所別のシャーレに脳 carboxygenated sACSF でいっぱい。
     
    注: 皮質、線条体、海馬を解剖するための 2 つの戦略を提案します。(手順 5.1 5.10) の最初の戦略は、2 番目の方法 (手順 6.1 6.7) 蛍光レポーター マウス線条体を淡蒼球と他の脳構造から明確に分離する必要があります、マウスの任意の行に便利です。線条体が必要でない場合 2 つの手法の線条体固有の部分を無視します。

figure-protocol-1
図 1: 回路図と、テクニックは #1 の脳解剖の画像
5.1 5.10 の手順で説明されている手法。線条体組織が必要な場合は、上脳行列腹側で P1 脳を置きます。かみそりの刃を前方脳線条体を通してコロナ セクションを取得するを介して matrice スロットに配置します。両半球から線条体部分を削除、海馬の前方にある線条体を含むすべてのセクションを繰り返します。線条体組織する必要がない場合単に hemisect、脳半球の内側を皿に置き、海馬を公開する腹内側脳構造 (視床、大脳基底核等) を削除します。ピンセットを使用して、海馬のピンチ、半球を裏返しし、皮質組織の固まりを解剖するピンセットを使用します。カットは線条体のセクションを削除するだろうスケマティック半球を通して黒い垂直線。スケール バー = 500 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

5. 収穫の線条体, 海馬, 皮質、テクニック 1

  1. Matrice 金型、腹側を断面に脳全体を配置します。(前方の嗅索) を介して脳の最も前方部分を介して 1 のかみそりの刃を置きます。
  2. 0.5 mm スライスを生成する最初の 1 つにちょうど後部別のかみそりの刃を挿入し、追加のかみそりの刃をこの 1 つの後方に配置します。
  3. これらのスライスを carboxygenated sACSF とシャーレに転送し、sACSF と別皿に脳の残りの部分を配置します。線条体スライスを切り裂くスコープ線条体を視覚化するために転送します。これらのスライスは前方の線条体の大部分を含み、海馬を欠いている必要があります。Nkx2.1 Cre+/-; とスコープ解剖蛍光灯を使用します。Ai9淡蒼球の強力な tdTomato 信号から信号の弱い線条体 tdTomato を区別するために+/-スライス。
  4. 蛍光の有無にかかわらず、sACSF と正しくラベル付けされた 50 mL チューブにすべてのセクションおよび転送線条体の塊の両方の半球から線条体出てピンチ、氷の上を格納します。
  5. Hemisect 鉗子またはかみそりの刃を使用して正中線に沿って脳と内側面を上向きになるように半球を倒します。
  6. この組織を鉗子でつまんで腹側脳 (視床、大脳基底核など) を削除します。完了すると、(背側皮質に沿って前後軸にまたがるソーセージ状構造) 海馬と皮質の心室側を明確に表示する必要があります。
  7. 海馬を削除するには、前の海馬の前で鉗子の先端を挿入し、鉗子を後方移動と海馬-皮質のボーダーに沿う摘心によって皮質から海馬を優しきます。SACSF に正しくラベル付けされた 50 mL チューブに孤立した海馬を転送、氷の上を格納します。
  8. 大脳皮質を解剖するには、hemisected 皮質内側を置きなさい。最も背を挟まないように鉗子を使用、内側体性感覚皮質、〜 2 mm x 2 mm. の正方形塊のまま野の腹側、前部と後部の部分皮質をフリップは、内側が起動し、すべての余分な非皮質組織 (視床のきれいなので、大脳基底核など。)内側の表面は必要に応じて。SACSF に正しくラベル付けされた 50 mL チューブに皮質チャンクを転送、氷の上を格納します。
  9. なったと皮質の両方を収集する他の半球を繰り返す地域。
  10. すべての子犬で、シャーレを保つため、sACSF 冷たくて新鮮な子犬の間に sACSF を交換することを確かめるためには、この手順を繰り返します。

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図 2: 回路図とテクニック 2、脳解剖の画像
6.1 6.7 の手順で説明されている手法。脳解剖皿の背側にピンで留めます。大脳皮質を剥離した後フォワード、海馬、線条体、表示され、以前の手法で説明されているように皮質のセクションを削除ことができますし、削除することができます。トランスジェニック マウス ラインによって線条体は淡蒼球や他の組織を削除するクリーンアップすることができます。Nkx2.1Cre; でAi9マウス ライン、淡蒼球、トマト + 細胞は線条体と比較して有意に高い密度。スケール バー = 500 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

6. 収穫線条体, 海馬, 皮質、テクニック 2

  1. SACSF を含む sylgard コーティング ペトリ皿で脳の腹側を置くし、小脳や前皮質あるいは嗅球を介してそれをピンで止めます。
  2. 1 つの半球にはじまって、基になる海馬から後部皮質や他の組織を優しくカーブタイプ鉗子を使用します。優しくフラット シャーレに皮をむいた皮質を横たわっていた。他の半球に繰り返します。なったと線条体は、露出した脳にはっきり目に見えるにする必要があります。
  3. 正中線で 1 つの海馬をピンチし、横方向を削除する海馬の皮に鉗子を使用します。コレクション バイアル氷の上に配置し、他の海馬とを繰り返します。
  4. 線条体、周囲の組織からそれを緩和する線条体の端をこすり優しく。それから下につまんで線条体を削除し、コレクション チューブ氷の上に追加します。他の線条体に繰り返します。
  5. 皮質のセクションは、5.8 の手順で説明するように収穫できます。
  6. 遺伝子改変レポーター マウスの線を使用している場合 (例えば、 Nkx2.1-Cre;Ai9、 Lhx6 GFP等)、sACSF とシャーレに線条体を転送およびスコープ解剖蛍光表示。鉗子を使用して ( ; Nkx2.1 Cre の線条体から線条体以外の任意の組織を削除するにはAi9マウス、すべての '明るい' 組織を削除は、淡蒼球ははるかに高い MGE 由来 tdTomato + セル密度線条体と比較して)。すべて線条体に繰り返します。
  7. すべての子犬で、シャーレを保つため、sACSF 冷たくて新鮮な子犬の間に sACSF を交換することを確かめるためには、この手順を繰り返します。

7. 1 つのセルの状態を生成します。

  1. 解体が完了したら後、は、1 mg/mL に、10 mg プロナーゼを計量し、10 mL の carboxygenated sACSF で溶解プロナーゼ ソリューションを準備します。
  2. 転送 5 mL を 50 mL コレクション バイアルから組織はラウンド プロナーゼ sACSF 溶液 2 mL を含む下部チューブです。組織サンプルをミックスするインキュベーション中に 3-4 回指でチューブを揺れ/フリック、室温で 20 分間、インキュベートします。

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結果

このプロトコルが初期生後脳 (図 1-2) から特定の脳領域を収穫、介在ニューロン前駆細胞の単一細胞状態を収集し、素朴な WT の様々 な脳領域にこれらの細胞を移植する方法を示します出生後の子犬 (図 3)。Posthoc 解析、細胞の形態、神経化学的マーカーおよび電気生理学的特性を特徴付ける P30 35 間介在ニューロン前駆体移植を受けた脳に収穫され。これらのタイプの試金は通常マウスで、P21 P30 の間しばしば行わが、移植細胞の成熟は郭清/分離手続により若干遅れる可能性があります、追加の 5-10 日を待ってお勧めこれを補うために遅延の成熟。実行する解析のタイプは、脳を収穫する適切な戦略を左右します。特に、我々 は、または特定のサブタイプ20に対してバイアスが特定の介在のサブグループの優遇細胞死を観察しなかった。

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ディスカッション

このプロトコルの 1 つの重要な側面は、細胞の生存を最大にします。組織や細胞が確実常に氷冷 carboxygenated sACSF では、細胞の生存を促進するために必要です。効率的な解離と解離細胞脳環境の内外で様々 なソリューションを過ごす時間の長さを最小限に抑える戦略が必要です。脳解剖され、移植の数、に応じて実験の長さを減少する郭清および/または移植の手順で支援パートナーに有益なことです。健康と子犬の生存を保証するには、また氷麻酔時間 (< 4 分) を最小限に抑え、移植手順中に光で加熱した子犬を保つ重要なとしてます。

移植された脳では有意な変動があること、他の脳が何千人も含まれている間いくつかない接木のセルを含めることができます。移植細胞密度を高めるかどちらの可能性が高まるが、接ぎ木の子犬の数を増やすことができます細胞移植、収穫数を増やすことができます解剖のためのいくつかの P0 P2 リットルを組み合わせること成功した移植。適切な脳の領域をターゲットに、子犬の頭が安定し、脳の中にマイクロ ピペットを下げるときに移動しないことが重要です。頭のシフトやマイクロ ピペット シャフ...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この研究は、健康の国民の協会 (K99MH104595) および T.J.P. に発育研究所所内研究プログラムに支えられました。 そのラボでこのアプローチは創業 Gord Fishell に感謝いたします。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
塩化ナトリウムΣS7653
重炭酸ナトリウムΣ S6297
塩化カリウムΣP9541
リン酸ナトリウム 一塩基性Σ S0751
塩化カルシウムΣC5080
塩化マグネシウムΣM2670
グルコースシグマG7528
ショ糖シグマS7903
脳マトリックスロボズSA-2165線条体を収穫する場合のみ必要
ファインポイント デュモン鉗子ロボズRS-4978
マイクロ解剖ハサミロボズRS-5940
カミソリの刃サーモフィッシャー12-640
パスツールピペットThermoFisher1367820C
Nanoject IIIDrummond3-000-207
手動マニピュレーター スタンド付きWorld Precision Instruments M3301R/M10
5 ml 丸底プラスチックチューブThermoFisher149591A
60 mm シャーThermoFisher12556001
100 mm シャーThermoFisher
PronaseSigma10165921001
Fetal Bovine Serum (FBS)ThermoFisher16140063
DNase ISigma4716728001
Celltrics 50umフィルターシスメックス04-0042327
トリパンブルーサーモフィッシャー15-250-061
血球計算盤サーモフィッシャー02-671-6
レ レ 12565100

参考文献

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