真核生物の転写エラーのゲノム全体の監視

サマリー

このプロトコルは、複数のモデル生物における転写の忠実度を監視する新しいツールと研究者を提供します。

要約

正確な表記は、遺伝情報の忠実な表現に必要です。しかし意外にも、少しは転写の忠実度を制御するメカニズムについて知られています。科学の知識で、このギャップを埋めるためには、我々 は最近線虫、ショウジョウバエ、酵母のトランスクリプトームを通して転写エラーを検出するサークル シーケンス分析を最適化線虫。このプロトコルは、前例のない詳細の転写の忠実度を制御するメカニズムを解明することができますので、真核細胞での転写エラーの風景にマップする強力な新しいツールを使って研究を提供します。

概要

ゲノムは生命の正確な生物の設計図を提供します。この青写真を正しく実装するには、素晴らしい精度で転写されるゲノムのために重要です。ただし、転写は、エラーが発生する可能性がありますはありません。たとえば、RNA ポリメラーゼがエラーを起こしやすい体外^1、2、長い知られている、最近エラー体内だけでなく、^3、5,6、犯すことが示されました。特に、DNA 損傷^7,8,9,10に直面しています。一緒に取られて、これらの観察は、転写エラー発生する継続的にすべての生きた細胞でタンパク質構造変異の強力なソース可能性があることを示唆していることを示します。

転写変異と呼ばれるこのプロセスは、2 つの方法で古典的な変異によって異なります。最初に、彼らは DNA の複製に依存しない、遺伝子の突然変異とは対照的転写エラーは分裂期と分裂後の細胞を影響します。転写の忠実度に影響を与えるメカニズムを勉強して、したがって、分裂、分裂後の細胞の突然変異荷重に対して貴重な洞察を提供します。興味深いことに、転写エラーが最近タンパク質凝集^11,12,13のプロモーションに関与しているし、¹⁰両の発癌に寄与するように仮定されたが、細菌¹⁴の抗生の抵抗の開発。

第二に、遺伝子の突然変異と対照をなして転写エラー、自然で一時的です。転写エラーを検出するため極めて困難になりますので、彼らの一時的な存在は特に挑戦的です。たとえば、いくつかのラボは、転写の突然変異誘発の研究のための貴重な記者アッセイを考案した、一方これらの試、コンテキストとモデル生物^4,15の限られた数の転写エラーを測定することができるのみ。これらの制限を克服するために多くの研究者は、理論により、任意の種のトランスクリプトームを通して記録される転写エラー RNA 塩基配列決定技術 (RNA シーケンス) になっています。ただし、これらの研究は、逆のトランスクリプション エラー、PCR 増幅エラー シーケンス自体のエラーを起こしやすい性質など、図書館建設の成果物によって簡単に混同されます。たとえば、逆転写酵素約 1 つのエラーすべて 〜 20,000 拠点間コミット RNA ポリメラーゼ (RNAPs) は、1 つだけエラーをすべて 300,000 拠点^5,6にすると予想されます。従来の RNA シーケンス データ (ライブラリ準備で起因するアーチファクトと真転写エラーを区別することは事実上不可能じゃないので単独で逆のトランスクリプションの誤り率を小さく細胞内 RNA ポリメラーゼのエラー率、図 1 a)。

この問題を解決するために試金^5,16円シーケンス (Cirseq、または今後 C seq) の最適化されたバージョンを行った。このアッセイでは、トランスクリプトーム⁵で RNA の転写エラー、その他の稀な変形を検出することができます。円形配列アッセイは、この試金の重要なステップは、環状 RNA を中心に展開するためにこの名前を運ぶ。RNA ターゲットが円形、一度彼らは同じ RNA テンプレートの数多くのコピーを含む線形 cDNA 分子を生成する、ローリング サークル ファッションを転写したリバースされます。エラーは、これらのテンプレートの 1 つには、このエラーは cDNA 分子内に含まれるすべての単一の繰り返しで現在もでしょう。対照的に、逆のトランスクリプション、PCR 増幅、またはシーケンスによって導入されたエラーはランダムに発生する傾向がある、こうして繰り返されるがのみ 1 つまたは 2 つがあります。したがって、各 cDNA 分子コンセンサス シーケンスを生成してランダム エラーを区別するすべての繰り返しで発生するエラーで、ライブラリ構築アーティファクト効果的にから分離できる真の転写エラー (図 1 b)。

任意の種のトランスクリプトームで RNA の塩基置換、挿入、および削除の速度を正確に検出 C seq 試金を使用することができます適切に使用する場合 (たとえば、トラバース ・ オフマン¹⁷を参照)。たとえば、我々 は単一の基本解像度は、^{5 と酵母、ショウジョウバエ、線虫で転写の誤り率のゲノム全体の測定値を提供するために C seq 試金を使用しています。}(未発表の観察)。最初に正確に RNA ウイルス集団をシーケンスに使用、C seq 試金のこの最適化されたバージョンがライブラリ構築アーティファクトに貢献するライブラリの準備中に過酷な条件を最小限に抑えるために合理化されています。さらに、市販のキットの数を使用して、アッセイのスループットが大幅に向上、その使いやすさだけでなく、適切に使用する場合、この試金は正確にあたり、大幅改善前の研究⁶転写エラーの何千もを検出できます。全体的にみて、このメソッドは転写変異を研究する強力なツールを提供、幅広い生物の転写の忠実度を制御するメカニズムに新しい洞察力を得るためにユーザーになります。

プロトコル

1. 準備

1. RNases are 遍在;したがって、徹底的に除染試薬を噴霧することによってワークスペースを消去 (など, RNase 離れて) および 70% のエタノール。ピペットやペン、RNase の混入の潜在的な原因を解消する管ラック ダウン スプレー。
2. RNases をさらにサンプルを汚染から防ぐためには、実験中に実験用の上着や長袖 t シャツを着用します。手袋と箱や袋からそれらを取得するときに特に使用されるチューブの内側との間の接触を避けます。
3. 逆のトランスクリプションの前に手袋を頻繁に変更します。
   注: 最適な結果を得るには、逆のトランスクリプションの前に実験を停止しません。

コレクション動物文化とセル2。

1. 出芽酵母の成長とコレクション
   1. 酵母から C seq ライブラリが必要な場合まず 3 ml 中含有酵母エキス、アデニン、ペプトン、デキスト ロース (YAPD) の単一酵母コロニーを接種してローリング ドラム 30 ° C で一晩それを孵化させなさい。
   2. 朝は、50 ml の 0.1 の光学濃度 (OD) YAPD 媒体の文化を再接種して 0.5 〜 0.7 (7 ~ 10⁶セル/mL x) の外径に到達するまでセルを育てなさい。
   3. 50 mL の円錐管に全体 50 mL 文化 (約 350 × 10⁶セル) を収集し、2,100 x gで 3 分の下セルをスピンします。慎重に YAPD 培地を取り除き、一度 1x PBS でペレットを洗浄します。
   4. その後、換散バッファーの 480 μ L、10 %sds の 48 μ L、フェノール: クロロホルム: イソアミル アルコール (25:24:1) pH 6.8 の 480 μ L でペレットを再懸濁します。渦 5 s、および転送 (キットに付属) 冷たいジルコニア ビーズ 750 μ L でチューブ 1.5 mL スクリュー キャップに最大速度でサンプル。セル換散および総 RNA の抽出のこのプロトコルの手順 3 に進みます。
      注: ステップ 2.1.4 に必要な試薬のすべては推奨される酵母 RNA 抽出キットで提供されます。これらの試薬は均等に働く酵母、ワームと飛ぶように C seq ライブラリ (手順 3 ~ 10) を生成する酵母 (ステップ 2.1)、ワーム (手順 2.2) やハエ (ステップ 2.3) のコレクションの後の統一されたアプローチを使用できます。
2. 線虫の文化およびコレクション
   1. ワームから C seq ライブラリが必要な場合は入金寒天 OP50 細菌発見の新鮮な皿の上の 30 の成虫です。
      注: 5 つのプレートは、1 の複製に対して十分です。
   2. ワームを 4 日間の文化し優しく M9 媒体の 5 mL でプレートを洗浄することによりワームを収集し、単一の 50 mL の円錐管にワームをプールします。
   3. 100 x gペレットを作成する 2 分でダウン ワームをスピンします。遠心分離機でペレットを邪魔しないように、可能な最低速度を減速します。
   4. そっとワームを 1.5 mL チューブに移動、M9 媒体の 1.5 mL で 2 回洗浄、細菌を除去し、ワームのきれいな 100 μ L ペレットを生成 1 分の 100 x gでチューブを遠心分離機します。
   5. 換散バッファーの 480 μ L、10 %sds の 48 μ L、フェノール: クロロホルム: イソアミル アルコールの 480 μ L でワームを再懸濁します。渦 5 s と冷たいジルコニア ビーズ含む 750 μ L をチューブ 1.5 mL スクリュー キャップに転送の最大速度でサンプル。ワームと総 RNA 抽出の換散のためこのプロトコルの手順 3 に進みます。
3. キイロショウジョウバエ文化とコレクション
   1. ハエから C seq ライブラリが必要な場合は、ブドウ糖または糖蜜ベース媒体を含むバイアルにハエが 20-25 を文化します。分注ハエ以上 3 バイアル、その各バイアルに約 8 ハエが含まれています。
   2. ハエを収集するために、ハエを鎮静するまで氷のバケツにバイアルを配置します。その後、1.5 mL チューブのブラシでそれらを収集します。CO₂処理によるハエを収集しません。
   3. 部屋の温度 (RT)、ハエが暖かいしすぐにチューブに換散バッファーの 500 μ L の既成の混合物、10 %sds の 50 μ L、500 μ L フェノール: クロロホルム: イソアミル アルコールを追加します。杵が管の底に達したら動きをねじる会社を伴う約 15 ストロークでハエを粉砕する、micropestle を使用します。
   4. ハエの混合物を注ぐし、1.5 mL スクリュー キャップに換散メディア チューブ冷たいジルコニア ビーズと渦の 750 μ L 含む 5 s. 続行ハエと総 RNA の抽出のこの議定書、換散のためのステップ 3 を最大速度でそれ。

3. 総 RNA 精製

注: この時点で、すべての 3 つのプロトコルの収束と seq C ライブラリを生成する単一の統一されたアプローチを使用できます。

1. スクリュー キャップの上しっかりと、アダプターまたは粘着テープに、vortexer にチューブを取り付けます。ボルテックス チューブ サンプルを溶解に 10 分間、最大速度で。その後、水相から有機溶剤を分離する 5 分間 16,100 x gでサンプルを遠心分離機します。
2. 慎重に白、曇りの界面を乱すことがなく水相の 400-500 μ L を削除、1.9 mL の結合バッファーを含む 15 mL の円錐管に追加。ボルテックスによって徹底的にそれらをミックスします。
3. 100% エタノールの 1.25 mL を加え、ボルテックスでサンプルを混ぜます。コレクション チューブで組み立てられたフィルター カートリッジに 700 μ L のサンプルを転送し、サンプルのすべてがカートリッジを通過するまで繰り返し」s. で 30 14,500 x gでサンプルをスピンします。
   注: この時点で、サンプルにわずかに不透明ななるかもしれない。場合はあまりにも多くの細胞、ワーム、またはハエを溶解し、沈殿が表示可能性があります、フィルターを詰まらせることがあります。
4. 洗浄ソリューション 1, 700 μ で 1 回と 2 回 500 μ L 洗浄ソリューション 2 または 3 のフィルターを洗います。洗浄を完了するには、任意の余分なエタノールを削除する 2 分 14,500 x gでサンプルを回転します。
5. 1.5 mL イルカ管にフィルター カートリッジを転送し、prewarmed 溶出液 (65 ° C) の 108 μ L を追加します。
   注: 転写エラーとを区別することは不可能ウラシル脱アミノ化イベントにシトシンが挑発するが、逆のトランスクリプションの前に 65 ° C 以上の高温に RNA サンプルを公開しないでください。
6. 隔離された RNA DNA 汚染が低下する (参照ステップ 2.1-3.4) バッファー私 DNase、RNase 阻害剤の 2 μ L と DNase の 4 μ L × 10 の 11 μ L を追加することによって私が (8 U) 37 ° C、30 分インキュベートして。
7. 消化力の後の DNase 不活化試薬 11 μ L を追加します。渦混合物、常温 5 分間座ってみましょう。その後、不活化試薬をペレットし、ペレットを乱すことがなく上澄みの 110 μ L を収集する 3 分間 15,000 × gのサンプルを遠心分離機します。1.5 mL チューブに上清を転送します。
   注: DNase 不活化試薬は正しくピペットことはかなり困難である、ピペッティング動作ごとに、後ピペット チップをとても視覚的に検査できます。不活化試薬もピペットに粘性になると、10 mM トリス-HCl (pH 7.4) 残りのボリュームの 1/5 に等しいを追加します。
8. (品質チェック)分光光度計を使用して総 RNA 濃度を測定します。総 RNA の 1 μ L を脇、ヌクレアーゼ フリー (NF) 水に 10 ng/μ L の濃度に希釈します。RNA が低下しないおり、少なくとも 8.5 またはより高い (図 2 b) のエリン値を確保するため高い感度 RNA テープで適切な塩基配列解析装置で RNA を実行します。

4. mRNA 濃縮

1. MRNA miniprep の mRNA 濃縮を行うキット (材料の表を参照してください)。NF の水の 140 μ L を 250 μ L の総ボリュームのサンプルに追加します。その後、結合バッファー x 2 の 250 μ L、ボルテックス、サンプルを徹底的にミックスし、オリゴ (dT) ビーズの 15 μ L を追加します。
2. 上下それをピペットでサンプルをミックスし、2 分の 65 ° C でそれを孵化させなさい。その後、10 分間 RT にサンプルを配置します。最後に、ビーズ: mRNA 複合体をペレットに 2 分間 16,100 x gでサンプルを遠心分離機します。
3. 上澄みを廃棄し、洗浄液の 500 μ L でペレットを再懸濁します。スピン列に溶液を移および 15,000 × gで 1 分のスピンします。流れを破棄し、洗浄ソリューションの追加の 500 μ L のサンプルを洗ってください。その後、回転のスピン フィルターから任意の余分なエタノールを削除する 15,000 × gで 2 分間サンプル。
4. イルカ チューブにスピン フィルターを転送し、prewarmed 溶出液 (65 ° C) の 80 μ L で列でペレットを再懸濁します。65 ° C で 1.5 分間サンプルをインキュベートし、15,000 × gで 1 分の回転によって溶出します。
5. 分光光度計または RNA 濃度と品質の定量化は、同様のツールを使用して浄化された RNA 濃度を測定します。

5. RNase III 断片化と RNA のクリーンアップします。

注: C seq ライブラリを生成するための適切な循環の RNA 分子を準備する (重要) の長さの約 60-80 拠点に RNA を断片化しなければなりません。以前の方法は、RNA のフラグメントに化学断片化を使用しても、重金属の化学の断片化は最終的な分析の中に転写エラーとして誤って解釈されることができる RNA のサンプルに損害を紹介します。この問題を回避するために小さな断片を生成する RNase III を使用して断片化の代わりに依存します。この酵素的アプローチの追加の利点は、結紮、化学の断片化後終わり修理のための必要があるに必要な互換性のある端を作成することです。

1. RNA 核破砕反応の浄化された RNA の 1 μ g を設定、10 μ L の反応バッファー、RNase III の 5 μ L と十分な NF 100 μ L にボリュームをもたらす水 (材料の表を参照してください)。最後に酵素を追加し、ミックスを上下に 10 回以上の混合物をピペットします。長さ約 60-80 拠点の RNA 断片を生成する傾向がある 25 分の 37 ° C でサンプルをインキュベートします。
2. 25 分培養が完了したら、一度、オリゴとすぐに反応をクリーンアップ クリーンアップとコンセントレーターを (材料表参照) キットそれ以上の消化を防ぐために。オリゴ バインディング サンプルでは、バッファーを 200 μ l 添加、ボルテックス混和し、100% のエタノールの 800 μ L を追加を追加します。ボルテックスによってサンプルを混合し、コレクション チューブに付属のスピンの列にそれを転送します。
3. 30 s や洗浄のための 10,000 x gでサンプルを遠心洗浄バッファーを RNase III を削除して 750 μ L でそれ。遠心 10,000 × g 30 でサンプル s、流れを破棄し、上記のように洗浄バッファーの 750 μ L でもう一度サンプルを洗います。2 番目の通過を破棄した後は、15,000 × g任意の余分なエタノールを削除する 2 分の位置にある列を遠心します。
4. 列を新しい 1.5 mL チューブに転送し、1 分 10,000 x gで回して NF 水の 24 μ L のサンプルを溶出します。
5. 品質チェック:浄化された RNA のフラグメントの 2 μ L を取り、倍希釈の NF 水 2 μ L を追加することによって。断片化された RNA の長さ (図 2 c) で 50-100 塩基の範囲で確実にスクリーン テープで断片化された RNA を実行します。

6. RNA 環状とローリング サークル逆のトランスクリプション

1. RNA 断片を座標系に 20 μ L のサンプル 1 分の 65 ° c の熱変性し、すぐに 2 分間氷の上に置きます。T4 RNA リガーゼのバッファー、10 mM ATP、RNase 阻害剤の 1 μ L、NF 水 1 μ L の 4 μ L x 10 の 4 μ L と 50% ポリエチレング リコール (PEG) の 8 μ L を追加します。
2. ボルテックスによってサンプルを徹底的にミックス、それをピペッティングによる T4 RNA リガーゼ I. ミックスの 10 U/μ L の 2 μ L のサンプルを再度追加し、2 蓋 30 ° C で設定温度をたち h 25 ° C でインキュベート
3. 2 時間後のサンプルに NF 水の 10 μ L を追加、製造元の仕様に従ってオリゴ クリーンアップと濃度キットとサンプルをクリーンアップします。NF 水の 20 μ L のサンプルを溶出します。
4. 逆に円形の RNA 分子を転写、RNA の 9 μ L に 10 mM の dNTPs の 4 μ L、50 ng/μ L のランダムな hexamers の 4 μ L と NF 水の 9 μ L を追加。ピペッティングで徹底的にミックスのすべて、1 分の 65 ° C でサンプルの変性、バックアップとして残りの RNA 2 分店の氷の上に置きます。
5. 5 x 最初繊維の統合バッファーの 8 μ L、0.1 mm DTT、2 μ L、200 μ L U/逆転写酵素の 4 μ L を追加し、ピペッティングでミックスのすべて。10 分、5 ° c の孵化の温度よりも高い設定ふた付き 42 ° C で 20 分孵化によって続いて 25 ° C でサンプルをインキュベートします。
   注: 繊維変位機能を持つ逆転写酵素は、ローリング サークル逆のトランスクリプションのためにこの手順で使用する必要があります。
6. サンプルに NF 水の 10 μ L を追加し、メーカーの推奨事項に従ってオリゴのクリーンアップと濃度のキットでそれをきれいします。溶出液の 42 μ L のサンプルを溶出します。
7. 品質チェック:NF 水 2 μ L に一本鎖 cDNA の 2 μ L を希釈し、感度の高い RNA テープ付け塩基配列解析装置でこのサンプルを実行します。逆のトランスクリプションが正常、cDNA 分子のライブラリ場合の長さは、約 60-1,500 拠点からは見えるはずです。理想的には、ほとんどの cDNA は 500-1,000 拠点 (図 2 d) の範囲内です。

7. 第二の鎖 cDNA 合成と終わり修理

1. 2 番目の鎖合成キットを使用すると、二本鎖 cDNA ライブラリを生成できます。氷のサンプルを置き、サンプルの 38 μ L に NF 水の 30 μ L を追加します。2 番目のストランド バッファー x 10 の 8 μ L と 2 番目の鎖酵素の 4 μ L を追加し、2.5 h の 16 ° c の孵化前に穏やかなピペッティングによるサンプルをミックスします。
2. Oligo のサンプルをクリーンアップ クリーンアップと濃度 100 μ L 反応の製造元の推奨事項に従ってキットし、NF 水の 38 μ L のサンプルを溶出します。
3. 終わり修復反応を二本鎖 cDNA の 35.5 μ L、最後修復反応バッファーの 6.5 μ L、終了準備酵素ミックスの 3 μ L NF 水の 20 μ L を追加することによって設定します。慎重に白色沈殿が生成の反応バッファーを確認し、存在する場合手温暖化によってそれらを解消します。
4. ピペッティングで終わり修復反応をミックスし、20 ° c、65 ° C で 2 番目 30 分孵化によって続いて 30 分インキュベート5 ° c の孵化の温度より高いたちふたの温度を設定します。

8. アダプター結紮と準備された図書館のサイズ選択

1. (材料の表を参照してください) 最後のライブラリの準備のためマルチ ステップ ライブラリ準備モジュールを使用します。最初に、次世代シーケンス 10 倍用のアダプターを希釈 10 mm トリス-HCl を最終濃度 1.5 μ m。各サンプルに希釈したアダプターの 2.5 μ L と結紮エンハンサーの 1 μ L を追加し、ボルテックスでそれらをミックスします。
2. 鈍/TA リガーゼ マスター ミックスの 15 μ L を加えてピペッティングにより混合 20 の ° c で 15 分間加温します。ウラシル固有切除試薬酵素の 3 μ L を追加し、37 ° c 15 分間インキュベートします。結紮の完了後、100 μ L の総ボリュームのサンプルに NF 水量 13.5 μ L を追加し、サイズ選択に進みます。
   注: をお勧めサイズ-600-800 塩基の長さの範囲内にある cDNA の分子のための選択。断片化された RNA の分子の長さは約 60-80 拠点なら、600-800 塩基の長さの分子のための選択は、選択した分子のほとんどがダウン ストリーム処理に最適な少なくとも 3 つのタンデム繰り返しが含まれて、解析。
3. 長さは 600-800 bp は、分子の選択、30 μ L の再懸濁の磁気ビーズ (材料の表を参照してください)、各サンプル、ピペッティングにより混合し、RT に順応を追加します。1.5 mL チューブにサンプルを転送し、5 分 RT インキュベートします。
4. 5 分上清からビーズを分離するためのマグネット スタンドにサンプルを配置します。新しい 1.5 mL チューブに磁性体ビーズ (これは大規模な cDNA の分子に区切られる) を破棄する (目的の cDNA 分子を含む) の上澄みを転送します。
5. 各サンプルを 15 μ L の磁気ビーズの新しい因数を追加、ピペッティングにより徹底的にミックスし磁気ラックにサンプルした場所で 5 分間インキュベート、室温 5 分間インキュベートします。その後、慎重に取り外し、ビーズの邪魔にならないように、培養上清の処分します。
   注: は、目的のターゲットの cDNA を今含んでいる磁気ビーズの捨てないでください。
6. 200 μ L 80% の作りたて各サンプルにエタノール ペレットの磁気ビーズを乱すことがなく追加し、インキュベートする 30 s. 破棄エタノール 80% エタノールでもう一度サンプルを洗います。完全にサンプルからエタノールの痕跡を削除し、5 分のビーズを風乾もビーズを過剰に乾燥しないように注意してください。ビーズが overdried ペレットに亀裂が表示されます。
7. ビーズからサンプルを溶出するマグネット スタンドからチューブを削除し、10 mm Tris 19 μ L を追加-塩酸ピペットそれアップ ダウン複数回にビードを再停止して右で 5 分間のサンプルをインキュベートビーズが overdried だった場合のためにそれらをインキュベート > 10 分。
8. マグネット スタンドに戻るサンプルを置き、上澄みからビーズを分離する 5 分のためにそれらをインキュベートします。慎重にチューブから精製、サイズ選択の cDNA ライブラリを含む上清の 15 μ L を削除し、新しい 1.5 mL チューブにそれを転送します。

9. PCR 増幅と最終的なビード浄化

1. 普遍的なプライマーの 5 μ L と一意なインデックスのプライマーの 5 μ L を追加各 cDNA ライブラリーを精製し、ピペッティングして徹底的にそれらを混合 (材料の表を参照してください)。慎重に結晶と他の沈殿物のためのポリメラーゼ マスター ミックスを確認し、沈殿物を溶解するまでマスター ミックスを手で温めます。
   1. サンプルでは、ポリメラーゼ マスター ミックスの 25 μ L ピペットによってそれらをミックスし、PCR 増幅の下サイクリング条件に従ってを追加します。30 98 ° C で初期変性を実行 s、10 の 98 ° C でサンプル濃度分配によってデュアル ステップ PCR の反作用を行いますと s と 75 65 ° C で PCR の製品の熱処理/延長 s (12 x)、65 ° C 5 分で最後の拡張が続くと4 ° C で不明確な把握
2. きれいな 45 μ L の PCR 反応に直接再懸濁の磁気ビーズを追加することによって最終的なライブラリ、ピペッティングで混ぜると 5 分の転送のための RT でそれらに 1.5 mL チューブにサンプルをインキュベート、マグネット スタンドに配置。5 分間インキュベート、上澄みを廃棄し、30 の作りたての 80% エタノールで 2 回洗浄 s。
3. 第 2 洗浄後に、完全にエタノールをサンプルから削除し 5 分のビーズ ペレットを風乾し、0.1 x テの 35 μ L の溶出します。それらをピペッティングによるビードを再停止しなさいそれらでインキュベート RT 5 分場所サンプル マグネット スタンド、5 分後、上澄みの 30 μ L を新しい 1.5 mL チューブに転送。-80 ° C のライブラリを保存します。
4. 品質チェック:NF 水の 9 μ L で最終的なライブラリの 1 μ L を希釈し、高感度チップ付け専用 DNA 解析装置で、サンプルを実行cDNA の大半は、長さ (図 2 e) 600-800 bp の範囲でする必要があります。
5. 溶出後、250 bp ペアエンド リード、または 300 bp シングル エンド読み取りを用いた大量並列シーケンス プラットフォーム上の配列のためサンプルを送信します。

10. バイオ情報解析データを配列の円の

注: 分析・ C seq 試金からの生データを解釈専用バイオ情報パイプラインが必要です。私たちの分析に使用されたパイプラインの模式図は、図 3に描かれています。Https://github.com/LynchLab/MAPGD でこのパイプラインをダウンロードします。

1. まず、トリム削除アダプター シーケンス、cutadapt¹⁸20 の品質スコアのしきい値を使用して低品質基本電話に読み取り。
2. Concatemerized RNA の分子が最小サイズ 30 ヌクレオチドの任意の繰り返しを検出する適切なアルゴリズムを使用してエンコードされた繰り返しを確認し、2 にミスマッチの最大は¹⁸を繰り返します。これらの繰り返しからコンセンサス シーケンスを派生しのすべてのデータベース呼び出しやそれぞれの位置に関連付けられている品質スコアを追跡します。
   注: 逆のトランスクリプションを合成 RNA 分子の任意の位置で開始することができます、ので繰り返しの開始されません必ずしも (以下、結紮点) 断片化された rna の 5 ' 端に。したがって、コンセンサス シーケンスでは、継続的には結紮点の識別を要する対応するトランスクリプトームに対してマップできません。
3. 結紮術のポイントを識別するために爆発のような配置ツール (BLAT)¹⁹を使用して参照トランスクリプトームに対するコンセンサス配列のコンカテマーをマップします。
   1. 一致シーケンスを初期の RNA のフラグメントのシーケンスの少なくとも 1 つの完全連続発生が割り当てられたシーケンスに含まれていることを確保するための 2 つのインスタンスを連結します。その後、始まる予測結紮点位置にコンセンサス配列を回転させます。
4. トップハット²⁰を使用してゲノムに対して回転コンセンサス シーケンスをマップし、アライメントを使用して転写エラーと間違われる可能性があります任意単一ヌクレオチド多形 (SNPs) を検出します。
5. マップ回転コンセンサス シーケンスから転写エラーを呼び出し、候補エラー 4 つの追加テストに合格するかどうかをテストします。
   1. まず、転写エラーが (一般的な要件は、少なくとも 20 の読み取りが特定の基本および代替基本呼び出しをサポート可能性があります読み取りの 5% 以上をカバーする必要がある)、SNP と重複しないことを確認します。
   2. 第二に、コンセンサス シーケンスがそれぞれの呼び出し同じ塩基対の少なくとも 3 のタンデム繰り返しから派生することを確認します。第三に、その位置の品質スコアの合計は 100 以上である必要がありますを確認します。
6. 4 番目と最終チェック (結紮ポイントのすべての可能な位置をシミュレートする) すべての可能な組み合わせのコンセンサス配列を回転、トップハットを使用して参照ゲノムに対して各バージョンのマップします。
   注: ゲノムの完全な一致が見つかった回転シーケンスの 1 つ対応する結紮点は今正しいと見なされ、転写エラーの呼び出しを拒否する必要があります。

結果

大量並列シーケンスのアプローチのすべてのような各 C seq 実験は扱いにくく、大規模なデータセットを生成します。初めてユーザーのためそれはこれらのデータセットを処理することは困難することができます。したがって、実験前に経験豊富なバイオ informatician をすべてのユーザーに連絡をお勧めします。平均では、期待は、ユーザーあたりのほとんどの大量並列シーケンスのプラットフォームの実行 55-70 ギガ基地 (Gbases) 約生成することです。通常、このプロトコルのため、各サンプルの約 2-6 Gbases に買収されたので、あたりの実行 12-30 サンプルされた多重化されます。アダプター シーケンス、低品質基本電話 (< 20) このデータセットからトリミング後の初期データ サイズ 〜 70% に残った。

生成された繰り返しのサイズを決定することにより RNA の断片化と環状の効率を調査するため、これらの基地はさらに分析しています。長さ...

ディスカッション

ここでは、酵母、ショウジョウバエ、線虫で転写エラーの検出のための C seq ライブラリの準備のための最適化されたプロトコルについて述べる。このプロトコルには、代替技術と同様に、既存のプロトコルでは、多くの利点があります。

過去 15 年間、レポーターの多数のシステム開発されているルシフェラーゼ^7,8や Cre Lox 組換え^3,4,15,21転写を検出するために依存します。エラー。これらのレポーター システムは、彼らは遺伝子、対立遺伝子、および識別する直接転写の忠実度を調節する分子機構を許可ため転写の忠実度の者を理解する貴重なされています。しかし、彼らのレポ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
RiboPure RNA精製キット	ThermoFisher	AM1926	Total RNA精製
Genelute mRNA精製キット	Sigma-Aldrich	MRN70-1KT	mRNA精製
ヌクレアーゼフリー ウォーター	Ambion	AM9937	溶出・希釈
Ambion RNase III	ThermoFisher	AM2290	RNAフラグメンテーション
T4 RNAリガーゼ1 (ssRNALigase)	New England Biolabs	M0204S	RNA環状化
Ribolock	ThermoFisher	EO0381	RNase inhibitor
SuperScript III Reverse Transcriptase	ThermoFisher	18080044	Rolling circle reverse transcription
10 mM dNTP mix	ThermoFisher	18427013	Rolling circle reverse transcription
ランダムヘキサマー (50 ng/µL)	ThermoFisher	N8080127	Rolling circle reverse transcription
NEB Second Strand Synthesis Module	New England Biolabs	E6111S	Second Strand Synthesis
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina	New England Biolabs	E7370S	cDNA Library preparation
NEB Next index primers	NEB	E7335S	Multiplex PCR primers
オリゴクリーン&濃縮器	Zymo Research	D4061	RNAおよびDNAサンプルのクリーンアップ
DynaMag-2 マグネット	ThermoFisher	12321D	磁気ビーズ精製
AMPure XP ビーズ	ベックマン・コールター	A63881	磁気ビーズ精製
Eppendorf 5424 微量遠心分離機	FisherScientific	05-403-93	遠心分離
INCU-Shaker 10 L	ベンチマークScientific	H1010	細胞培養
T100 サーマルサイクラー	BIO RAD	1861096	中温から高温のサイクリング条件
PTC-200 サーマルサイクラー	GMI	8252-30-0001	低温サイクル条件
RNase Away	Molecular Bioproducts	700S-11	滅菌
50 mL 遠心チューブ	Corning	430290	ヌクレアーゼフリー
15 mL 遠心チューブ	Corning	430052	ヌクレアーゼフリー
エッペンドルフチューブ	USA Scientific	1615-5500	ヌクレアーゼフリー
4200 タペステーションシステム	Agilent	G2991AA	RNAおよび一本鎖DNAサンプルの品質管理のためのヌクレオチド分析装置
高感度RNAスクリーンテープ	Agilent	5067-5579	RNAおよび一本鎖DNAサンプルの品質管理
RNAスクリーンテープサンプルバッファー	Agilent	5067-5577	RNAおよび一本鎖DNAサンプルの品質管理
RNAスクリーンテープラダー	Agilent	5067-5578	RNAおよび一本鎖DNAサンプルの品質管理
2100 バイオアナライザー機器	Agilent	G2939BA	二本鎖DNAの品質管理
高感度DNAキット	Agilent	5067-4626	二本鎖cDNAサンプルの品質管理
ウォーターバス	VWR	462-0244	インキュベーション
NanoDrop 2000/2000C 分光光度計	サーモフィッシャー	ND-2000C	RNA濃度の測定