ラット網膜血管ペリサイト、すなわち、低温セクション、全体-マウント、および血管ネットワークの低張性分離の免疫組織化学的可視化のための 3 つの異なったティッシュ準備テクニックを紹介します。
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この記事について
サマリー
要約
網膜血管は目の多くの疾患で重要な役割を果たします。免疫組織化学的染色技術網膜血管と血管ペリサイト眼科研究の中心であります。微小血管を可視化する適切な方法を選ぶことが大切です。網膜血管周皮細胞免疫組織化学的染色クライオ セクション、全体-マウント、および血小板由来増殖因子受容体 β (PDGFRβ) と 2 (NG2) 神経・ グリア抗原抗体を用いた分離の低張性の血管について述べる。これは利点と網膜の微小血管の可視化の 3 つのティッシュの準備のそれぞれの欠点を強調する私たちことができます。低温セクションすべての網膜の層の transsectional 可視化がだけいくつか時折横のカット、血管を含みます。全体マウント全体の網膜血管の概要を説明しますが、血管の可視化は面倒なことができます。低張性の分離は、神経細胞の除去による全体の網膜血管を可視化するメソッドを提供しますが、これは非常に壊れやすい組織になります。
概要
網膜の血管は、これらの細胞は、血管系の整合性に大きな役割を果たす多くの研究所の焦点です。糖尿病網膜症1、虚血2緑内障3など病態ペリサイトの関数を含む血管の特徴であります。ペリサイトは内側の網膜毛細血管叢で発見されます。毛細血管叢の 2 つの層に内部の網膜を供給する網膜中心動脈の枝.内側の血管床が神経節細胞と内部の核層の間に位置しています。深い層はより濃厚で複雑と内側と外側核層4,5間ローカライズされます。さらに、網膜の一部には、放射状の脈絡毛細血管と呼ばれる 3 番目のネットワークも含まれています。これらの長い、そして稀に神経線維間でうそをつくストレート毛細血管が別の 1 つまたは他の 2 つの叢6と吻合します。毛細血管の壁内ペリサイトは基底膜に埋め込まれているし、血管内皮細胞の abluminal 側のラインします。
これまで、他の血管の細胞と区別することができますこれらのペリサイトのユニークな生物学的マーカーはありません。血小板由来増殖因子受容体 β (PDGFRβ) 神経・ グリア抗原 2 (NG2) は、また他の血管細胞ですが血管に存在する一般的に使用されるマーカ....
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プロトコル
プロトコルは、最適化され、男性大人の白子のラットで示されます。すべての実験手順で動物は ARVO ステートメントで眼科と視覚に関する研究における動物の使用のための規則に従って扱われました。動物を二酸化炭素とそれに続く頚部転位によって安楽死させ。
1. ラット網膜のティッシュの準備
-
低温セクション
- メスのラットの眼瞼の後部と前部 ~0.5 cm のスリットを作る。
- オプション: ジアテルミー バーナーを使用して、埋め込み中に一貫した方式で目をオリエンテーションと視神経を通って垂直クライオスタット切片では、内部の角度で目をマークします。
- 目を鉗子でつかんで慎重に周囲の組織を公開する側に傾けてください。結合と筋肉組織の解剖はさみでカットすることによって眼を摘出します。
注意: 目も強く引っ張らない視神経に過度の圧力は網膜剥離を引き起こす可能性があります。 - リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) メスの先端で光の圧力を適用することによって角膜の角膜輪部に最初の穴を作る前に安定させるために、4% のホルムアルデヒドで簡潔に目を入れ。
- 顕微鏡、解剖ハサミ鉗子で 4% のホルムアルデヒドを PBS で 2-4 時間で水没する前にレンズを削除し角膜角膜の縁に沿ってカットします。
- デニスソ....
- メスのラットの眼瞼の後部と前部 ~0.5 cm のスリットを作る。
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結果
成功したプロトコルは、微小血管を可視化する 3 つの異なる網膜準備を提供します。これらの各メソッドは、PDGFRβ と NG2 陽性の共局在と血管内皮の区分の周りを包むペリサイトの固有の位置を使用します。
低温セクション、DAPI ラベル核と内側の蛍光の密度によって神経細胞の層を識別できるし、深い毛細血管叢が含まれて PDGFRβ、NG2 陽性 (図 1) を表示するペリサイトにはです。(図 1の矢印) の血管の周囲に円形または馬蹄形の陽性として血管壁内のペリサイトのユニークな位置を見ることができるまたは時折縦カット血管 (図 1の矢印)。
成体ラットのホ.......
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ディスカッション
微小血管網膜血管の研究に適用できる 3 つの網膜の調製技術を提案します。以下、それぞれの方法を比較し、プロトコルで重要な手順を強調表示。
網膜は矢状セクションのカットを用いて、電子顕微鏡で、したがって、同じ網膜から多数の標本を得ることが可能です。このメソッドから生じる数字のセクションでは、抗体の特異性と滴定試験動物の不必要な犠牲を防ぐための理想的な選択。準備作業は、良い結果のために決定的です。目を引くではなく目の周りのすべての筋肉をカットする目を解剖しながら、それは重要です。力が使用される場合、網膜剥離の危険性があります。アイカップが薄いので、あまりにも長い 1 つ修正しないでください。4% のパラホルムアルデヒドを PBS で 2-4 時間で浸漬は組織を修正します。もはや固定、興味の抗原を破壊の危険性があります。最高の可能な immunostainings を生成するためにガラスに対して可能な限り平坦にする各セクションにとって重要です。セクションにはのみ、いくつか時折横のカット、血管が含まれて、ためこの組織の準備方法は、血管の断続的な可視化のみを提供しています。したがって、このメ.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
デンマーク ルンドベック財団によって資金が供給された研究。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 豚の皮からのゲレチン | Sigma-Aldrich | G2625-500G | |
| 鶏卵白からのアルブミン | Sigma-Aldrich | A5253-500G | |
| デオキシリボヌクレアーゼ (DNAse) I ウシ膵臓由来 | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | 0.15 M NaCl |
| ウシ血清アルブミン (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| 正常なロバ血清 | ジャクソンImmunoResearch | 017-000-121、ロット129348 | |
| ウサギ抗PDGFR&β; | Santa Cruz | sc-432 | 1:100 |
| Mouse anti-NG2 | Abcam | ab50009 | 1:500 |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson | ImmunoResearch | 711-585-152 | 1:100 |
| フルオレセイン (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-151 | 1:100 |
| Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | JacksonImmunoResearch | 711-225-152 | 1:100 |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | 1:100 |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dissolved in DMSO |
| Anti-fading mounting medium | DAPI Vector Laboratories | H-1000 | |
| Anti-fading mounting medium with DAPI | Vector研究所 | H-1200 | |
| Nunc Lab-Tek II 4 ウェルチャンバースライド | Thermo Fisher Scientific | 154526 |
参考文献
- Eshaq, R. S., Aldalati, A. M. Z., Alexander, J. S., Harris, N. R. Diabetic retinopathy: Breaking the barrier. Pathophysiology. , (2017).
- Cai, W., et al. Pericytes in Brain Injury and Repair After Ischemic Stroke. Translational Stroke Research. , (2016).
- Trost, A., et al. ....
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再版と許可
