がんに関連した疲労におけるミトコンドリア機能の役割の評価

サマリー

私たちの目標は、がん患者における倦怠に関連付けられているミトコンドリアの機能障害を評価する実用的なプロトコルを開発することでした。この革新的なプロトコルは、臨床使用を含む標準的な瀉血と基本的な検査に最適です。

要約

疲労は共通、ほとんどの患者に影響を与える条件を衰弱させます。これまで疲労残る悪い特徴ないの診断を客観的に測定するこの条件の重大度をテストします。ここで疲れのがん患者から採取した PBMCs のミトコンドリアの機能を評価するための最適化手法について述べる.基底のミトコンドリア呼吸、呼吸の余力を記述するエネルギーの表現型を測定することによって PBMC ミトコンドリア機能状態を検討した小型細胞フラックス システムと呼吸阻害剤の連続注入を使用して、ストレスに反応する最寄りのエネルギー経路。新鮮な PBMCs は臨床設定で標準的な瀉血を使用して容易に利用できます。このプロトコルで記述されている全体の分析は、複雑な生化学的手法の関与なし 4 時間未満で完了ことができます。さらに、再現性のあるデータを取得する必要がある正規化手法について述べる。同じ患者および潜在的な治療効果を評価する時のポイント間で比較することができる再現性のあるデータの生成から繰り返しサンプル収集できる簡単な手順と正規化方法を提示します。

概要

疲労は、¹がん患者の生活の質にマイナスの影響は、普及していると悲惨な状態です。これまで、ガン疲労定義が不十分なまま、患者²で主観的な報告だけに依存しています。したがって、臨床設定^3,4で疲労を客観的に特徴付けるため簡単に適応可能な診断検査を識別するために緊急の必要性があります。

疲労⁵を原因とするミトコンドリアの機能不全を含む複数の基になるメカニズムを提案されています。ミトコンドリアの酸化的リン酸化を介した細胞のエネルギー需要の 95% を提供する発電所器官し、カルシウム シグナル伝達、アポトーシス、免疫シグナル伝達、他は細胞内のシグナル伝達イベント⁶の規制に重要な役割を果たす.したがって、障害ミトコンドリア生体エネルギーとエネルギー生産の欠陥に貢献するかもしれない疲労。この仮説をサポートするには、以前の研究は、慢性疲労症候群⁷患者におけるミトコンドリア DNA の変異を観察しています。疲労の病態生理学的起源は、中枢神経系や骨格筋^8,

プロトコル

(NCT00852111) の現在の研究は、制度レビュー委員会 (IRB) の国立研究所の健康 (NIH)、ベテスダ、メリーランド州で承認されました。参加者が本研究に登録された euthymic 男性 18 歳以上年齢の人は非転移性前立腺がん以前前立腺摘除術の有無と診断され、された外部ビーム放射線療法 (照射線量) を受信する予定します。彼らは大きな疲労を引き起こす可能性のある進行性の病気を持っていた場合、潜在的な参加者が除外された過去 5 年以内に精神疾患があった、あった裸眼甲状腺機能低下症や貧血、または 2 番目の悪性腫瘍があった。非ステロイド系抗炎症剤やステロイド、鎮静剤を使用される方はまた除かれました。健常者の血液サンプルは、IRB 承認プロトコル (NCT00001846) の下で健康なドナーから NIH 輸血科で得られました。すべての参加者は、NIH のマグナソン臨床研究センターで募集しています。研究への参加前に署名された書面によるインフォームド同意が得られました。

1. ミトコンドリア機能測定準備 (実験の 1 日)

1. センサー カートリッジを水和物 (テーブルの材料のおおよその時間を参照してください: 5 分)。
   1. センサー カートリッジをパッケージから削除します。ユーティリティ プレートの各ウェルに 200 μ L Calibrant ソリューションを追加し、400 μ L Calibrant....

結果

水戸のストレス テストは、完全なミトコンドリア プロファイルにマップする様々 な呼吸阻害剤の逐次投与後酸素消費量 (OCR) の測定に依存します。ミトコンドリアの健康に関連する各注入剤は、次のパラメーターを計算する使用ことができます後の OCR 測定:基底 OCRはまず安静時レベルの ATP 需要を満たすために必要な酸素消費量を評価するために任意の薬物投与前に、測定します。基底の呼吸はオリゴマイシン注入前に OCR のベースラインから非ミトコンドリア呼吸率を差し引いて計算されます。次に、ATP のシンターゼ (複雑な V) のプロトン チャネルを阻害するオリゴマイシンを注入します。OCR のオリゴマイシン注射後のそれに続く低下は、 ATP 生産関連の酸素消費量を表します。FCCP (カルボニル シアン 4-[フッ素系低分子] phenylhydrazone)、プロトンの勾配とミトコンドリア膜電位を混乱させるため、イオノフォア最大酸素消費量を引き出すために使用されます。最大呼吸

ディスカッション

がん患者における倦怠は、正しく定義されていませんまたは¹を特徴と衰弱状態です。疲労の診断は全く主観的な報告に依存している、現在の診断基準や主にその競走²理解の欠如のため、この条件のための治療がないです。がん患者における倦怠の提案されたメカニズム、ミトコンドリアの機能障害が最も治療対象の経路の 1 つ。したがって、積極的に開発が早く疲労を含むがん治療関連毒性のリスクの高い患者を識別するために使用することができます臨床サンプルでミトコンドリアの機能を測定するための迅速かつ実用的な手法を開発しました。管理は提起することができます。

呼吸阻害剤の連続注入との組み合わせで細胞外のフラックス技術ミトコンドリア機能の状態の評価を可能にして両方生体外で使用されているし、体内モデル^{19, 20,2.......}

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
CPT単核細胞調製チューブ	BD Biosciences	362761	瀉血後のPBMCの単離
RPMI-1640	Corning	10-040	PBMCsの増殖培地を作るため
シ胎児血清(FBS)	Corning	35-010-CV	PBMCsの増殖培地を作るため
ペニシリン/ストレプトマイシン	ThermoFisher	15140122	PBMCsの増殖培地を作るため
Cell-Tak	Corning	354240	細胞と組織のための接着剤溶液; 懸濁細胞を表面
に接着させるタツノオトシゴ XF キャリブラント溶液	Agilent	103059-000	ハイドレーティングカートリッジ用
XFp Fluxpak (ミニプレートとセンサーカートリッジ)	Agilent	103022-100	XFp 細胞培養ミニプレートとセンサーカートリッジを含む
XFベース培地	Agilent	103335-100	XFアッセイ培地を作るため
45% 細胞培養 D-(+)-グルコース溶液	コーニング	25-037-CI	XFを作るためアッセイ媒体
ビン酸ナトリウム溶液	コーニング	25-000-CI	XFアッセイ培地作成用
L-グルタミン溶液	サーモフィッシャー	25030081
XFoHorse XFp 水戸ストレステストキット	アジレント	103010-100	オリゴマイシン、FCCP、アンチマイシンを含む A/ロテノン
CyQUANT 直接細胞増殖アッセイ	サーモフィッシャー	C35011	生細胞の定量とデータの標準化用
タツノオトシゴXFp	アナライザーAgilent	S7802AEA	生細胞のミトコンドリア機能の測定用
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader(またはプレート内の蛍光細胞を定量できる任意の装置)	BioTek	BTCYT5PV	生細胞の定量化とデータの正規化

ウピル