がんに関連した疲労におけるミトコンドリア機能の役割の評価

サマリー

私たちの目標は、がん患者における倦怠に関連付けられているミトコンドリアの機能障害を評価する実用的なプロトコルを開発することでした。この革新的なプロトコルは、臨床使用を含む標準的な瀉血と基本的な検査に最適です。

要約

疲労は共通、ほとんどの患者に影響を与える条件を衰弱させます。これまで疲労残る悪い特徴ないの診断を客観的に測定するこの条件の重大度をテストします。ここで疲れのがん患者から採取した PBMCs のミトコンドリアの機能を評価するための最適化手法について述べる.基底のミトコンドリア呼吸、呼吸の余力を記述するエネルギーの表現型を測定することによって PBMC ミトコンドリア機能状態を検討した小型細胞フラックス システムと呼吸阻害剤の連続注入を使用して、ストレスに反応する最寄りのエネルギー経路。新鮮な PBMCs は臨床設定で標準的な瀉血を使用して容易に利用できます。このプロトコルで記述されている全体の分析は、複雑な生化学的手法の関与なし 4 時間未満で完了ことができます。さらに、再現性のあるデータを取得する必要がある正規化手法について述べる。同じ患者および潜在的な治療効果を評価する時のポイント間で比較することができる再現性のあるデータの生成から繰り返しサンプル収集できる簡単な手順と正規化方法を提示します。

概要

疲労は、¹がん患者の生活の質にマイナスの影響は、普及していると悲惨な状態です。これまで、ガン疲労定義が不十分なまま、患者²で主観的な報告だけに依存しています。したがって、臨床設定^3,4で疲労を客観的に特徴付けるため簡単に適応可能な診断検査を識別するために緊急の必要性があります。

疲労⁵を原因とするミトコンドリアの機能不全を含む複数の基になるメカニズムを提案されています。ミトコンドリアの酸化的リン酸化を介した細胞のエネルギー需要の 95% を提供する発電所器官し、カルシウム シグナル伝達、アポトーシス、免疫シグナル伝達、他は細胞内のシグナル伝達イベント⁶の規制に重要な役割を果たす.したがって、障害ミトコンドリア生体エネルギーとエネルギー生産の欠陥に貢献するかもしれない疲労。この仮説をサポートするには、以前の研究は、慢性疲労症候群⁷患者におけるミトコンドリア DNA の変異を観察しています。疲労の病態生理学的起源は、中枢神経系や骨格筋^8,9などの末梢組織内であるかどうかは不明のままがない現在を正確に評価する直接法ライブ、respiring 細胞の疲労に関連するミトコンドリアの機能障害。

末梢血単核球 (PBMCs) を使用して、ミトコンドリアの機能を研究するいくつかの利点を提供しています。まず、PBMCs は臨床設定で標準的な瀉血を使用してすぐに利用できる、基本的な実験技術を使用して迅速に分離することができます。第二に、採血は、筋生検等の組織を収集するよりも低侵襲です。したがって、血液サンプルを収集できます同じ患者から繰り返し治療効果の縦断的評価を容易にする時間をかけて。興味深いことに、PBMCs のミトコンドリアの機能は動物モデル¹⁰腎ミトコンドリアの状態とよく相関しているように見えた。さらに、免疫細胞のミトコンドリアは異なった病気の条件^11,12の下での制度の変更を検出するためのプロキシとして使用されています。循環免疫細胞内のミトコンドリアは、特に免疫機能の変化に敏感と免疫シグナル分子サイトカイン^13,14,15などです。たとえば、急性のリウマチ性の炎症性疾患患者から PBMCs が高いベースライン酸素消費量¹⁴を示すことが観察されています。対照的に、敗血症¹⁶を含む全身の炎症性疾患を持つ患者から分離された PBMCs の酸素消費量が減った。炎症性の条件の下で高い酸化ストレスと炎症¹⁷ミトコンドリアの機能不全によって生成されるフリーラジカルを貢献することかもしれないさらに。ミトコンドリア酸化ストレスと同様、エネルギー生産の中心的な役割は、がん患者¹³で疲労を勉強するためのプロキシとしてミトコンドリアの機能を使用しての潜在的な有用性を示唆しています。

ミトコンドリアの機能を調べる研究活用生化学的手法、ミトコンドリアの膜電位測定、または臨床設定^5,に容易に適応できない可能性があります特定の細胞集団の分離^14,18。近年、細胞外のフラックスの試金の開発研究者を簡単に許可しているし、正確に呼吸阻害剤^19,20の自動注射に対する酸素消費量 (OCR) の変化を調べる^,21,22します。 しかし、これらの研究のほとんどは、特定の細胞型の設計されています、高スループット大判を臨床場面に適用できない場合があります。本稿では臨床使用のためのミトコンドリアの機能を検査するための最適化されたプロトコルについて述べる。

プロトコル

(NCT00852111) の現在の研究は、制度レビュー委員会 (IRB) の国立研究所の健康 (NIH)、ベテスダ、メリーランド州で承認されました。参加者が本研究に登録された euthymic 男性 18 歳以上年齢の人は非転移性前立腺がん以前前立腺摘除術の有無と診断され、された外部ビーム放射線療法 (照射線量) を受信する予定します。彼らは大きな疲労を引き起こす可能性のある進行性の病気を持っていた場合、潜在的な参加者が除外された過去 5 年以内に精神疾患があった、あった裸眼甲状腺機能低下症や貧血、または 2 番目の悪性腫瘍があった。非ステロイド系抗炎症剤やステロイド、鎮静剤を使用される方はまた除かれました。健常者の血液サンプルは、IRB 承認プロトコル (NCT00001846) の下で健康なドナーから NIH 輸血科で得られました。すべての参加者は、NIH のマグナソン臨床研究センターで募集しています。研究への参加前に署名された書面によるインフォームド同意が得られました。

1. ミトコンドリア機能測定準備 (実験の 1 日)

1. センサー カートリッジを水和物 (テーブルの材料のおおよその時間を参照してください: 5 分)。
   1. センサー カートリッジをパッケージから削除します。ユーティリティ プレートの各ウェルに 200 μ L Calibrant ソリューションを追加し、400 μ L Calibrant ソリューションで各堀を埋めます。
   2. センサー プレートを Calibrant のソリューションは、それ今ユーティリティ板に戻ります。非 CO₂の 37 ° C の定温器でカートリッジを一晩メタンハイド レートします。
      注: センサー カートリッジは 4 h の最小値と最大 72 h の水和を受ける必要があります。

2. 臨床試料 (実験 2 日目)

1. 13 項目機能評価の慢性的な病気の治療 - 疲労 (FACIT F)^2,23,24 (気管支腔内照射の開始) の前にベースライン、中点、気管支腔内照射、および 1 年間ポスト気管支腔内照射を用いた疲労を測定します。
   1. 0 - を使用して各項目の応答、どこ 0「全然」を表し、4 は、申立人に関連している対応するステートメント「非常にします」を示します 4 スケール。合計スコアは、高疲労強度を反映して低いスコアを持つ範囲 16-53 でなければなりません。
   2. FACIT F スコアがなく臨床的に有意義な疲労²の有無を示す ≥43 の 43 より低い FACIT F スコアとして疲労を定義します。
      注: FACIT F スコア 43 最高の疲労度ががん患者の一般的な人口²で除算します。
   3. FACIT 疲労尺度で以下の 13 項目が含まれます: 1) 私は疲れがある;2) 気が弱い一面。3) 私は脱力感を覚える、(「洗浄」);4) 私は疲れた。5) 問題; 疲れたから始めることがあります。6) 仕上げ; 疲れたから問題があります。7) 私はエネルギーがあります。8) 私は私の通常の活動を行うことができます。9) 私は一日中にスリープする必要10) 私は疲れていたので食べる。11) 私は私の通常の活動をやって助けを必要12) 私のやりたい事をして疲れすぎていてイライラします。13) 私は疲れたため社会的活動を制限する必要があります。
2. 新鮮血液サンプルから PBMC を分離 (おおよその期間: 1 h)。
   1. 単核細胞調製管に 8 mL の血液を収集 (材料の表を参照してください)。
      注: コレクションの 2 時間以内の血液サンプルに処理されます。血液サンプル サンプル採取後 2 h 以上で処理される場合、PBMCs の質が妥協されることがあります。
   2. 部屋の温度 (18-25 ° C) で 30 分間 1,750 × g で遠心分離機します。曇りの層を 15 mL の円錐管に転送します。最大 15 mL の PBS を追加し、5 回を反転します。
   3. 4 ° C で 15 分間 300 × g で遠心します。慎重に削除し、不穏なペレットなし上澄みを廃棄します。再 10 mL、PBS を追加することでペレットを中断し、5 回を反転します。
   4. 300 x g で 4 ° C で 10 分間遠心上澄み液を破棄し、再 1 mL の PBS のセルを中断します。1.5 mL および microfuge の管に、PBMCs を転送します。
   5. 610 x g で 10 分間遠心します。慎重に上清を除去し、完全な RPMI 1640 でペレットを再懸濁します (10% 添加 RPMI 1640 10 mM ペニシリン/ストレプトマイシン FBS)。
3. 非付着性のセルのセル板をコート (おおよその時間: 30 分)。
   1. 細胞・組織の接着ソリューションを準備 (材料表参照) 0.1 M 炭酸水素ナトリウム pH 8.0 で原液を希釈することによって。作業ソリューションは、表面積の 3.5 μ g/cm²をする必要があります。
      注: このソリューションには、ムラサキイガイ、イガイから抽出されたポリフェノールのタンパク質が含まれています。これらのタンパク質は、表面に自分自身を固定するムール貝によって分泌される接着剤のキー コンポーネントです。我々 は、セル徳 PBMCs の最高の作品を見つけます。
   2. 各ウェルに希釈した接着剤溶液 100 μ L を追加し、室温で 20 分間インキュベートします。・ ディ ・水と空気で 3 回洗って乾燥。

3. ミトコンドリア機能測定

1. アッセイ媒体の作製 (おおよその時間: 10 分)。
   注: 分析メディアは、新鮮な実験の日に準備されなければなりません。
   1. L-グルタミン、ピルビン酸、およびブドウ糖メディア (同じ成分ダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) が、重炭酸ナトリウム、ブドウ糖、グルタミン、やピルビン酸ナトリウム) をベースにしてアッセイのメディアを追加します。メディアをウォーム アップ 37 ° c、7.4 に pH を調整します。
      メモ: グルコース、ピルビン酸、L-グルタミンの濃度は、通常、通常成長媒体中の濃度と同じが分析に基づいて調整することができます。
2. 水戸ストレス テストに備えて PBMCs (おおよその時間: 2 時間)。
   1. 80-90% の confluency に到達する各ウェルにステップ 2 から十分な PBMCs をプレートします。我々 の経験では、10⁵細胞/ウェル x 1.5 は、最も一貫性のある結果を得られました。
      注: 井戸 A と H は、背景井戸しかない細胞アッセイ メディアを含める必要があります。井戸 B G、外れ値を考慮するために患者のサンプルあたりの少なくとも 3-6 ウェルズをめっきすることをお勧めします。
   2. 井戸の底に付着する細胞を許可するように 2 分間 200 x g でプレートをスピンダウンします。アッセイのメディアで一度セルを洗浄します。この手順では、血清と炭酸水素ナトリウムが成長媒体から削除します。
      注: 我々 の経験で洗浄のステップ、通常細胞の 20-30% に削除します。
   3. 45-60 分の非 CO₂の 37 ° C 定温器で背景井戸 A および h. 加温を含む、各ウェルに 180 μ L 測定メディアを追加します。
3. 水戸のストレス テストを実行します。
   1. アッセイ メディアで水戸ストレス キットで薬をとおり再構築します。
      1. オリゴマイシン: 50 μ M で原液を生成するバイアルに 252 μ アッセイ メディアを追加します。
      2. FCCP: 50 μ M で原液を生成するバイアルにアッセイ メディアの 288 μ L を追加します。
      3. アンチマイシン A/ロテノン: 25 μ M で原液を生成するバイアルにアッセイ メディアの追加 216 μ L。
   2. 渦は、約 1 分の薬を再構成しました。作業ソリューションに希釈します。
      注: 作業ソリューションの濃度を滴定、細胞の種類に応じて実験前にあらかじめ決められました。PBMCs、我々 は見つけるのオリゴマイシンその 1 μ M、FCCP、1 μ M、0.5 μ M アンチマイシン A/ロテノンは最高の作品します。
   3. センサー カートリッジの各ポートに順番に薬をピペットします。
      1. ポート a: ピペット 20 μ 10 μ M の 1 μ M の各ウェルに最終濃度のオリゴマイシン。
      2. 1 μ M の各ウェルに最終濃度 10 μ M、FCCP のポート b: ピペット 22 μ L。
      3. ポート c: 5 μ M アンチマイシン A のピペット 25 μ L/0.5 μ M の各ウェルに最終濃度のロテノン。
4. 細胞外フラックス計測器で「水戸ストレス テスト」を選択します。楽器のガイダンスに従うし、センサー カートリッジを挿入します。楽器は、センサーのキャリブレーションを自動的に実行されます。センサーの校正や計測器は、アッセイの残りの部分を終了後、セル板を挿入します。530 での酸素動態を測定 nm (励起)/650 nm (排出), 470 でプロトン濃度の測定と nm (励起)/530 nm (排出) します。

4 ミトコンドリアの機能データの正規化

1. 細胞増殖試験ソリューションを準備 (おおよその時間: 5 分)。
   1. 11.7 mL PBS に 48 μ 核酸染色 (500 x) および 240 μ L 背景抑制を追加 (2 x)。核酸染色は細胞側の透過物 DNA 結合色素と背景抑制は死んだ細胞や染色されてから整合性が危険にさらされた細胞膜細胞をブロックするマスキング染料。DNA 結合色素と背景サプレッサーの組み合わせにより細胞のみが染色になります。
   2. 水戸のストレス テストが完了した後、各ウェル内の媒体に直接作業ソリューション (180 μ L) x 2 の等量を追加します。
2. 45-60 分生きているセル (蛍光) 508 でプレート リーダーの数を定量化するための 37 ° C の定温器で細胞増殖アッセイ液の存在下で細胞をインキュベート nm (励起)/527 nm (排出) して OCR データを正規化する (おおよその時間: 10 分).
   注: 数の生きているセルに加えてユーザーことができますセルの合計数、核酸、タンパク質濃度などの量を使用してデータを正規化します。

結果

水戸のストレス テストは、完全なミトコンドリア プロファイルにマップする様々 な呼吸阻害剤の逐次投与後酸素消費量 (OCR) の測定に依存します。ミトコンドリアの健康に関連する各注入剤は、次のパラメーターを計算する使用ことができます後の OCR 測定:基底 OCRはまず安静時レベルの ATP 需要を満たすために必要な酸素消費量を評価するために任意の薬物投与前に、測定します。基底の呼吸はオリゴマイシン注入前に OCR のベースラインから非ミトコンドリア呼吸率を差し引いて計算されます。次に、ATP のシンターゼ (複雑な V) のプロトン チャネルを阻害するオリゴマイシンを注入します。OCR のオリゴマイシン注射後のそれに続く低下は、 ATP 生産関連の酸素消費量を表します。FCCP (カルボニル シアン 4-[フッ素系低分子] phenylhydrazone)、プロトンの勾配とミトコンドリア膜電位を混乱させるため、イオノフォア最大酸素消費量を引き出すために使用されます。最大呼吸

ディスカッション

がん患者における倦怠は、正しく定義されていませんまたは¹を特徴と衰弱状態です。疲労の診断は全く主観的な報告に依存している、現在の診断基準や主にその競走²理解の欠如のため、この条件のための治療がないです。がん患者における倦怠の提案されたメカニズム、ミトコンドリアの機能障害が最も治療対象の経路の 1 つ。したがって、積極的に開発が早く疲労を含むがん治療関連毒性のリスクの高い患者を識別するために使用することができます臨床サンプルでミトコンドリアの機能を測定するための迅速かつ実用的な手法を開発しました。管理は提起することができます。

呼吸阻害剤の連続注入との組み合わせで細胞外のフラックス技術ミトコンドリア機能の状態の評価を可能にして両方生体外で使用されているし、体内モデル^{19, 20,2...}

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
CPT単核細胞調製チューブ	BD Biosciences	362761	瀉血後のPBMCの単離
RPMI-1640	Corning	10-040	PBMCsの増殖培地を作るため
シ胎児血清(FBS)	Corning	35-010-CV	PBMCsの増殖培地を作るため
ペニシリン/ストレプトマイシン	ThermoFisher	15140122	PBMCsの増殖培地を作るため
Cell-Tak	Corning	354240	細胞と組織のための接着剤溶液; 懸濁細胞を表面
に接着させるタツノオトシゴ XF キャリブラント溶液	Agilent	103059-000	ハイドレーティングカートリッジ用
XFp Fluxpak (ミニプレートとセンサーカートリッジ)	Agilent	103022-100	XFp 細胞培養ミニプレートとセンサーカートリッジを含む
XFベース培地	Agilent	103335-100	XFアッセイ培地を作るため
45% 細胞培養 D-(+)-グルコース溶液	コーニング	25-037-CI	XFを作るためアッセイ媒体
ビン酸ナトリウム溶液	コーニング	25-000-CI	XFアッセイ培地作成用
L-グルタミン溶液	サーモフィッシャー	25030081
XFoHorse XFp 水戸ストレステストキット	アジレント	103010-100	オリゴマイシン、FCCP、アンチマイシンを含む A/ロテノン
CyQUANT 直接細胞増殖アッセイ	サーモフィッシャー	C35011	生細胞の定量とデータの標準化用
タツノオトシゴXFp	アナライザーAgilent	S7802AEA	生細胞のミトコンドリア機能の測定用
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader(またはプレート内の蛍光細胞を定量できる任意の装置)	BioTek	BTCYT5PV	生細胞の定量化とデータの正規化