AtHIRD11 本質的な障害とキャピラリー電気泳動と親和性キャピラリー電気泳動による金属イオンへの結合の解析

植物は他の多くの生命よりも自分の環境に依存しています。植物は、他の場所に移動できません、ので彼らは (例えば干ばつ、寒さと高い塩濃度)、環境の変化に慣れる必要があります。その結果、高等植物は、高塩分に関連する細胞のストレスを軽減するマニホールドのタスクを達成する dehydrins のような特殊なストレス蛋白質を開発しました。これらの蛋白質は細胞内の水とイオンのバインド、バインド Cu^{2 +}による酸化ストレスを軽減-イオン、リン脂質と細胞骨格との対話します。また、バインド Zn^{2 +}のイオンにより、転写因子として機能するこれらの蛋白質。Ca^{2 +}結合する機能-イオン リン酸化もされて後報告¹。

多機能動作これらの蛋白質の疎水性アミノ酸残基の不在に関連しています。その結果、彼らはペプチド鎖とも拘束された構造内の任意の疎水性相互作用を欠いています。しかし、これらのタンパク質は、制限の厳しい構造を欠いている、ので彼らは同じ条件下で異なるコンフォーマを占有できます。したがって、彼らを記述できます最高単一構造ではなく構造のアンサンブルとして。これらのプロパティが付いている蛋白質は、ストレス蛋白質と真核細胞の²で異なる経路間のクロストークのため広く使われている概念は、本質的に無秩序なタンパク質 (IDPs) として知られています。

これらのストレス関連国内避難民の 1 つは、AtHIRD11 です。シロイヌナズナのほとんど非常に干ばつ表明した国内避難民の一つです。したがって、比を充電する、有効半径によって異なるコンフォーマを分けることができ、キャピラリー電気泳動 (CE) は、さらに調査のために使用されています。以前エース実験実証 AtHIRD11 と Cu^{2 +}-、Zn^{2 +}-、Co^{2 +}、および Ni^{2 +}などの遷移金属イオンの相互作用-イオン。原らの詳細な結果を見つけることができます。³ノーランゲルシリコーンナックバーら⁴。

ここで使用されるエース メソッドは、私たちの前の出版された作品⁶に基づいています。ただし、蛋白質のサンプルに EOF マーカー アセトアニリドの添加は適していません。AtHIRD11 はブロードなピーク パターンを示し、サンプルに EOF マーカーを追加する 2 つのピークを隠すでしょう。したがって、マーカーは、別々 の実行で使用されます。バインドの動作を検討する前に、前の実験中に検出されたピークは、異なるコンフォーマからことを確認しました。したがって、CGE タンパク質コンフォーマを区別するために使用、翻訳後修飾タンパク質と質量の違いにより、AtHIRD11 のかけらなどの不純物。その後、様々 な異なる金属イオンへの特徴付けられる AtHIRD11 サンプルのバインディング動作を検討しました。

この資料の目的は、異なる conformers の結合挙動の違いを評価するために IDP とサンプルの他のコンポーネントと区別するために実験装置を記述するためです。

1. キャピラリー電気泳動装置の準備

1. 毛細血管を準備します。
   1. (CGE 実験) の 33 cm と 30 cm (エース実験) の長い毛細血管に裸の溶融シリカのポリイミド外部塗装 50 μ m の内径と毛細血管をカットするのにガラス カッターを使用します。ガラス板の切断を実行します。
      注: 2 の異なった実験組み立ては 2 つの異なる楽器のため開発されました。他の楽器にそれらを使用するために適切なメソッドの転送が実行され、キャピラリー長さは計測器の許容長を調整します。
   2. ペンを使用して、ACE 実験 (有効長) の毛管の一端から 21.5 cm、24.5 cm CGE 実験用キャピラリーの端から端までの距離で 1 cm 広い検出ウィンドウの真ん中をマークします。
   3. ジェット機、マークの前後に 0.5 cm とバーニングはオフで毛細血管からポリイミド外部コーティングを削除します。同様に、ジェット機を使用して、毛細血管の両端にコーティングの 1 cm を削除します。
      注意: キャピラリー電気泳動の器具に頼るので、有効長が若干異なります。
   4. 毛細血管とエタノールと軟部組織の検出窓の両端をきれいに。
      注: ノンコートの毛細血管より柔軟でブレークする可能性が高い。
2. 毛細血管をインストールします。
   1. コンセント近く検出ウィンドウ CE システムにキャピラリーをインストールします。
      注: さまざまな CE 機器モデル毛管のため別の保持システムがあります。正確な手順については、使用機器の説明書を参照してください。

2. ソリューションを準備します。

1. CGE 分析用のソリューションを準備します。
   1. トリス (ヒドロキシメチル) アミノメタン (トリス) の準備-pH 8.0 で SDS バッファー (100 mM/1% w/v)。
      1. ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) 100 mL ビーカーでの 1.00 g を計量用呼吸マスクとブースを使用します。
      2. 100 mL ビーカーにトリスの 1.21 g を追加し、磁性攪拌器に 50 mL の脱イオン水と磁気攪拌棒を使用してそれを分解します。
      3. ソリューションに pH 電極を入れ、8.0 1.0 M HCl を使用するために pH を調整します。
      4. 100 mL のメスフラスコにソリューションを記入し、マークまで脱イオン水を追加します。優しく、泡の形成を避けるためにそれを振る。
   2. 0.1 M NaOH 水溶液を準備します。
      1. 100 mL のメスフラスコに NaOH の 4.0 グラムの重量を量る。マークまで 1 M 在庫を作るための脱イオン水でそれを埋めます。
      2. 10 mL 電球ピペットを使用して別の 100 mL のメスフラスコにこの溶液 10 mL を転送し、脱イオン水でそれを埋めるマークまで。
   3. 0.1 M HCl 溶液を準備します。
      1. 10 M 塩酸 10 mL を 10 mL のピペットを使用して 100 mL のメスフラスコに入れ、マークまで脱イオン水でそれを埋めます。0.1 M HCl を得るにこの手順を繰り返します。
   4. サンプル ソリューションを準備します。
      1. 1 mL 管に蛋白質の 0.5 mg の重量を量る。マイクロ ピペットとステップ 2.1.1 から 0.5 mL のトリス SDS ゲル バッファーを追加します。
      2. 優しく、泡を形成し、タンパク質の分解を避けるために揺することによってタンパク質を溶解します。
         注: 使用超音波前述タンパク質を溶解することができない場合ソリューションの任意の加熱は避けてください。
   5. バイアルにソリューションを入力します。
      1. 各溶液は 0.22 μ m ポリフッ化ビニリデン (PVDF) バイアルに直接適切な注射器を使用してフィルター処理をフィルターします。
         注: ゲルを含むソリューションでは、背圧が、粘度の高い高ですることができます。
      2. 合計で 15 のバイアルを準備し、任意の混乱を避けるためにそれぞれをマークします。
         1. 3 バイアルを pH 8 で市販のナトリウム dodecyl 硫酸塩 (SDS) ゲル バッファーに入力します。
            注: 市販 SDS ゲル バッファーの使用より正確な結果を提供します。
         2. フラッシュの 0.1 M NaOH と 0.1 M HCl で 1 バイアル 1 バイアルを入力します。
         3. サンプル ソリューションを 1 バイアルを入力します。
         4. 脱イオン水と 0.1 ml の脱イオン水 (バイアルを浸漬) の 4 バイアル、5 バイアルを入力します。
            注: 浸漬のバイアルは、それぞれの実行前に毛細血管のフラッシング中に廃棄物容器として使用されます。毛細血管の先は、任意のゲルの残渣を洗い流すために水につけてください。
2. エース分析用のソリューションを準備します。
   1. 1 M 水酸化ナトリウム溶液を準備します。
      1. 100 mL のメスフラスコに NaOH の 4.0 グラムの重量を量る。
      2. マークまで 1 M 在庫を作るための脱イオン水でそれを埋めます。
   2. 0.1 M NaOH 溶液に 0.1 M ethylendiaminetetraacetic 酸 (EDTA) を準備します。
      1. 10 mL 電球ピペットを使用して 100 mL のメスフラスコに 0.1 M 水酸化ナトリウム 10 mL を転送します。マークまで脱イオン水でそれを埋めます。
      2. 計量ボートに EDTA の 2.42 g の重量を量るし、0.1 M NaOH の 100 mL の固体の化合物を溶解します。
   3. トリス緩衝 (30 mM) を準備します。
      1. 500 mL ビーカーに 200 mL の脱イオン水と攪拌棒、トリス、3.63 g を追加します。撹拌プレートにビーカーを置き、それを切り替えます。
      2. PH メーター電極をビーカーに入れるし、0.1 M HCl を使用して 7.4 に pH を調整します。
      3. 純水で 1 L メスフラスコで塗りつぶし、マークまでソリューションを入力します。
         注: この手順が繰り返される、または全体の分析に 1 L 以上は必要なので、大きなメスフラスコは必要があります。
   4. 準備アセトアニリド電気浸透流 (EOF) のマーカー (60 μ M) ソリューション。
      1. 100 mL のメスフラスコに 6 mg アセトアニリドの 100 mL の Tris バッファーを追加します。
      2. 超音波のお風呂に、メスフラスコを入れて 30 分間それを切り替えます。
   5. (1 mg/mL) 溶液を準備します。
      1. 精密バランス 0.5 mL 遠心チューブを入れて、チューブに AtHIRD11 粉末の 0.3 mg を追加します。
      2. マイクロ ピペットを使用して、チューブに 0.3 mL の 30 mM Tris バッファー (pH 7.4) を追加します。タンパク質を溶解するために慎重にチューブを振る。
   6. リガンド ソリューションを準備します。
      1. CaCl₂ (5 mM) 原液を準備します。
         1. ボートツアーを計量、分析用天秤の上に置く、CaCl₂36.76 mg の重量を量る * H₂o.
         2. CaCl₂、マイクロ ピペットを使用してフラッシュ * H₂O 計量から事前に準備された Tris バッファーを 50 mL メスフラスコにボートします。
         3. 容積測定フラスコをマークまで Tris バッファーに入力します。
      2. 残り原液 (5 mM) を準備します。
         1. 2.2.6.1 章その他の金属を使用して、手順を繰り返しますは、CaCl₂の代わりに塩 * H₂O [MgCl₂: 23.80 mg、BaCl₂: 26.02 mg、Sr (₃)₂: 52.91 mg、MnCl₂: 31.46 mg、SeCl₄: 52.91 mg、CoCl₂* 2 H₂o: CuCl₂41.47 mg * 2 H₂o: 42.62 mg、ZnCl₂: 3.41 mg と NiCl₂* 6 H₂o: 59.43 mg]。
            注: ZnCl₂ソリューション 0.5 mM の濃度があります。濃度は 10 の要因によって減ったイオンと毛細管内壁の間の強い相互作用が観察されたので⁴。
      3. 500 μ M CaCl₂ソリューションを準備します。
         1. CaCl₂原液 10 mL を記入し、100 mL のメスフラスコに入れてください。
         2. マークに Tris バッファーと、メスフラスコを埋める、フラスコを振る。
      4. 250 μ M CaCl₂ソリューションを準備します。
         1. CaCl₂原液 5 mL を記入し、100 mL のメスフラスコに入れてください。
         2. マークに Tris バッファーと、メスフラスコを埋める、フラスコを振る。
      5. その他の原液 2.2.6.3 と 2.2.6.4 の手順を繰り返します。
   7. バイアルにソリューションをご記入ください。
      注: すべての繰り返しの実行は、入口と出口のバイアルのセットを必要があります。入口と出口で新鮮なリガンド ソリューションの使用は、各実行後移行時間でシフトを低減します。
      1. 10 mL 注射器で 250 μ M CaCl₂ソリューションをご記入ください。
      2. このフィルタ リング ソリューションを破棄するために注射器を用いたフィルターを介して注射器とプッシュ溶液 2 mL に 0.22 μ m PVDF フィルターを置きます。
      3. 注射器の残り 250 μ M CaCl₂ソリューションの最大許容量まで 10 バイアルを入力します。それぞれ250 μ M CaCl ₂ソリューション入口バイアルとしてマークします。
      4. 250 μ M CaCl₂液で半分いっぱいになるまで 10 バイアルを入力します。それぞれ250 μ M CaCl ₂ソリューション アウトレット バイアルとしてマークします。
      5. 2.2.7.1 - 2.2.7.4 アドバイザー他金属塩添加の解決のための手順を繰り返します。
      6. 代わりに 30 mM Tris バッファー (pH 7.4) ソリューションを使用して入り口と出口のバイアルのペアごとに手順を繰り返します。
         注: 30 ミリ モル/L Tris バッファー pH 7.4 は、金属イオンのない状態で蛋白質の移行時のデータを取得するために実行の間に使用されます。EOF の変化を無視するために必要があります。
      7. 1 バイアル アセトアニリド EOF マーカー (60 μ M) ソリューションを使用して上記の手順を繰り返します。また、代わりにサンプル (1 mg/mL) ソリューションを使用してこの手順を繰り返します。

3. キャピラリーゲル電気泳動分離

注: ノーランゲルシリコーンナックバーらによって前作で説明する方法に従って分離を準備します。⁴。

1. 分析を準備します。
   1. 毛細血管の状態
      1. 23 ° c. にサーモスタットを設定します。
      2. 0.1 M NaOH で 2.5 バーで 10 分の毛細血管をフラッシュします。
      3. 0.1 M HCl で 2.0 のバーで 5 分の毛細血管をフラッシュします。
      4. 2.0 のバーを脱イオン水で 2 分間毛細血管をフラッシュします。
   2. SDS ゲル バッファーに入力します。
      1. 2.0 のバーで 10 分の毛細血管を pH 8.0 で市販の SDS ゲルのバッファーに入力します。
   3. 各分離実行前にキャピラリーをフラッシュします。
      1. 0.1 M NaOH で 4.0 のバーで 3 分の毛細血管をフラッシュします。
      2. 0.1 M HCl で 4.0 のバーで 1 分の毛細血管をフラッシュします。
      3. 脱イオン水で 4.0 のバーで 1 分の毛細血管をフラッシュします。
      4. SDS ゲル バッファーと 4.0 のバーで 10 分の毛細血管をフラッシュします。
2. 分離を実行します。
   1. 入口で 4 分の 0.1 のバーを適用することで流体 CGE 実験 (ステップ 2.1.4) のサンプル溶液を注入します。
   2. 適用-16.5 kV と 25 分の毛細血管の両端に 2.0 のバーの圧力。

4. 親和性キャピラリー電気泳動分析

注: ノーランゲルシリコーンナックバーらによる以前の作品で説明する方法に従って分離を準備します。⁴ Alhazmiら⁵。

1. 毛細血管の状態
   1. 23 ° c. にサーモスタットを設定します。
      注: 温度公開プロトコルによるとされており、他の温度^4,5に変更することができます。ただし、相互作用は温度に依存しているし、それに応じて変更されます。
   2. 0.1 M NaOH で 2.5 バーで 40 分の毛細血管をフラッシュします。
   3. 1.0 バーを脱イオン水で 10 分間の毛管をフラッシュします。
   4. 30 mM Tris バッファー (pH 7.4) と 1.0 バーで 30 分の毛細血管をフラッシュします。
2. エースの方法のための準備
   1. 配位子のない測定方法を準備します。
      注: 偽装 2 タンパク質のピークとして、アセトアニリドがサンプル ソリューションに追加されません。
      1. 0.1 M の EDTA 溶液 2.5 バーで 1 分の毛細血管をすすいでください。
      2. 1 分の毛細血管を 2.5 バーを脱イオン水ですすいでください。
      3. 平衡の Tris バッファーと 2.5 バーで 1.5 分の毛細血管をすすいでください。
      4. 6 0.05 バーと入口の変更で s の Tris バッファー バイアルにアウトレット バイアル アセトアニリド溶液を注入します。
      5. 2.4 0.05 バーを適用キャピラリーのさらに内側の先端からアセトアニリド ソリューションをプッシュするために s。
      6. 10.0 を適用 6 分 kV 200 の波長でアセトアニリド ピークを検出し、nm。
      7. 4.2.1.1 の手順を繰り返します。-4.2.1.6。タンパク質を使用してアセトアニリド ソリューションではなくサンプルし、すべてのタンパク質のピークを検出します。
   2. 配位子を用いた測定のメソッドを準備します。
      1. 0.1 M の EDTA 溶液 2.5 バーで 1 分の毛細血管をすすいでください。
      2. 1 分の毛細血管を 2.5 バーを脱イオン水ですすいでください。
      3. 平衡のリガンド溶液で 2.5 バーで 1.5 分の毛細血管をすすいでください。
      4. 6 0.05 バーと入口の変更で s と配位子を含むバッファー バイアルにアウトレット バイアルのアセトアニリド溶液を注入します。
      5. 2.4 0.05 バーを適用キャピラリーのさらに内側の先端からアセトアニリド ソリューションをプッシュするために s。
      6. 10.0 を適用 6 分 kV 200 の波長でアセトアニリド ピークを検出し、nm。
      7. 手順で 4.2.2.1 - 4.2.2.6 アセトアニリド ソリューションの代わりに蛋白質のサンプルを使用して、すべてのタンパク質のピークを検出します。
   3. また様々 なタンパク質-金属イオンの相互作用 (代表結果の下で説明) の電荷サイズ比の変化を計算するために 4.2.1 と 4.2.2 手順を繰り返します。
      1. すべての 60 の h 後タンパク質溶液を新鮮なものに変更します。
         注: この時点でテストを一時停止できます。この手順は、少なくとも繰り返し 10 各ピークのパターンが異なる実行する少しため、配位子濃度の x。60 h 以上にソリューションを使用する場合、変動が大きくなりすぎた。
   4. メソッドを実行します。
      1. 手順、4.2.2 アルカリ土類リガンド ソリューション (CaCl₂MgCl₂BaCl₂SrCl₂ソリューション) を使用してメソッドを実行します。
      2. アルカリ土類リガンド ソリューションではなく MnCl₂SeCl₄CoCl₂CuCl₂ZnCl₂、および NiCl₂ソリューションを使用して、ステップ、4.2.2 の下で説明した方法を使用し続けます。
         注: 後者の遷移金属塩化物は毛細血管との強い相互作用を示したし、完全に削除することはできません。これらの相互作用の結果が実行する移行時間をシフトします。その結果、彼らは他の金属イオン後調べた。

CGE の実験中に手に入れた AtHIRD11 サンプルのレーザービームを図 1に示します。ペプチドのサイズは、左から右に増加します。ピーク数 4 最大の質量を持つし、そのまま蛋白質を示します。2 と 3 の小さなピークは、小さい不純物 (例えば、分解産物) を表します。最初のピークとする前に基準の矛盾は、蛋白質のサンプルのない再現でした。したがって、それは SDS に関連ではゲル化しないとサンプル関連付けられている不純物を表さない。

図 2は、エース実験中アセトアニリドのレーザービームを表します。アセトアニリド ソリューションは、不純物が必要ないので 1 だけ高いピークを示しています。最大のピークの検出時間は電気浸透流 (tEOF) の移行時間を示し、相互作用の計算に使用します。

図 3は SDS と金属イオンのない状態でエース実験中に AtHIRD11 サンプルの一塩です。CGE レーザービームから 2 不純物以外にも、それを示しています少なくとも 5 ピーク蛋白質自体に関連しています。ピーク 1 と 2 は、移行の時間ことを示す小規模または高正荷電から不純物に割り当てることができます。この仮定は、時間の経過とともにピークの高さと面積の増加によってサポートされます。以来、彼らはほとんど請求している、すべての実行で分離することはできません、AtHIRD11 ピーク 3 および 4 は、EOF の近くにあります。彼らはほとんどの相互作用を示さない、アクセス可能な残基金属イオンとの相互作用なしの立体構造を表します。AtHIRD11 は、いくつか異なる電荷-に-サイズ-比異なる conformers の異なる有効な半径のためを示しています。これらコンフォーマを継続的にマージできます。その後、5-7 のピークは、通常タンパク質のピークより広い。広いピークは、相互作用の動力学に関するヒントを与えます。ピークは狭いので高速と異なるコンフォーマ間の非常に遅い変換を除外できます。どちらの場合も、ピークはベースライン分離4になります。この場合、前平衡ステップはピークのパターンを変更することができ、遅い反応速度論との相互作用によりよい洞察力を与えるでしょう。

図 4は、ピーク 6 のための様々 な金属イオンの存在下でシフト測定移動の時間のグラフィックの評価を示しています。それは計算値 ΔR/Rfによって表されます。この値は、どのように強力なシフトは、(値) と (記号) によってタンパク質-金属イオン錯体の電荷の全体的な変化を示します。有意な相互作用と α の信頼区間、偶然 shift キーを区別するために = 0.05 は、同様に計算されます。信頼区間はゼロのラインと交差されていない場合、相互作用が重要なものとしてと見なされます。ピーク中 10 エレクトロフェロ 6 少なくとも存在していた場合に、結果が考慮します。ピーク 6 は 500 μ M Co2 +任意の実行に存在しませんでした。各 AtHIRD11 ピークの相互作用の完全なリストは、ノーランゲルシリコーンナックバーらによる以前の作品で公開されています。4。

ΔR/Rfは、(ligand) の存在下で移行時間比Rは私と (リガンドの不在) の移行時間比Rfを使用して計算されます。

Rは私とRfは EOF マーカーのタンパク質サンプル ピークおよびピーク時間のトップのピーク トップタイムズt蛋白質を使用して計算はtEOF:

Rは私リガンドの存在下で時間ですとRfの不在の回

図 1:ゲルのバッファーで AtHIRD11 サンプルの CGE 分離一塩。ピーク 1 とその左上のピークは、工芸品、サンプル注入がなくても観察できます。大衆と全体的なので 2 と 3 のピークのピーク面積はピーク 4 に比べて、分解産物などの可能性がある不純物。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: 実行 EOF マーカー アセトアニリドの一塩。図は、金属イオンと SDS ゲル バッファーなしの化合物のみ 1 ピークを示しています。ピーク上の時間では、電気浸透流をマークします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: すべての金属イオンのない状態で複雑なピーク パターンを示すエース実験中にサンプル分離のレーザービームの例。少なくとも 7 峰は、識別し、蛋白質とその 2 不純物に関連する可能性があります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4: 500 μ M の濃度を用いたピーク 6 調査金属イオンへの結合行動のグラフィカル評価します。ΔRの値/Rfは、移行時間シフトの強さに関するヒントを与えると金属イオンの結合の構造変化の強さ。ΔRの記号/Rfかどうか複合体はより肯定的または否定的充電非連結のタンパク質と比較することを示します。誤差範囲を示す α の信頼区間 = 0.05。その後、彼らは地域を示す、true ΔR/Rf-値は 95% の確実性で見つけることができます。赤いバーは、不十分なデータ (ピーク未満 6 エレクトロフェロに存在していた) によって得られた計算結果を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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