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方法論記事

歯科用インプラント ・異種材料の口腔バイオ フィルム形成

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DOI:

10.3791/57756

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2018年6月24日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Dental Materials and Prosthodontics, School of Dentistry of Ribeirão Preto, University of São Paulo, 2Department of Restorative Dentistry, School of Dentistry of Ribeirão Preto, University of São Paulo

この記事について

サマリー

ここでは、口腔バイオ フィルム形成細菌の細胞生存率と形態的特徴の分析を含む歯科補綴アバットメント チタン、ジルコニア材料を評価するためのプロトコルを提案する.強力な顕微鏡検査の技術に関連付けられているその場でモデルは、口腔バイオ フィルムの解析に使用されます。

要約

歯科インプラントと補綴コンポーネントが細菌の植民地化およびバイオ フィルム形成しやすいです。低い微生物付着を提供する材料の使用は、有病率とインプラント周囲の病気の進行を減らすことができます。観点から、口腔内環境の複雑さと口腔バイオ フィルムの不均一性歯や歯科材料の表面のバイオ フィルムの解析を有効にすることができます技術が必要な顕微鏡検査。この資料では、口腔バイオ フィルム形成チタンとセラミック補綴支台用材として形態学的および細胞レベルで口腔バイオ フィルム解析にかかわる方法を比較するために実装されたプロトコルのシリーズを説明します。前述のように本研究ではチタン、ジルコニアの歯科補綴物の支台用材料の口腔バイオ フィルム形成の評価の in situモデルは、方法論の妥当性を実証することにより、48 h のバイオ フィルムの良好な保全を提供します。多光子顕微鏡には、試験材料に形成されるバイオ フィルムの領域代表者の分析ができます。さらに、蛍光物質の使用と多光子顕微鏡による画像の処理微生物の非常に異質人口の細菌生存率の解析をことができます。電子顕微鏡用試料の調製は、バイオ フィルム、画像解像度が良いとしない人工の構造の保全を推進しています。

概要

細菌バイオ フィルム複雑構造的機能的組織微生物、細胞、生物学的活性ポリマー マトリックス1,2を合成する微生物種の多様性によって特徴付けられます。生物的または非生物的表面に細菌の付着には、主に唾液糖タンパク質1,3,4から成る, 獲得被膜の形成が続きます。微生物とペリクルの物理化学的相互作用弱い最初確立、細菌アドヘシンと獲得被膜の糖蛋白受容体との間の強い相互作用によって続いた。多種間コミュニティ1,3,4,を形成、既に添付している細菌の受容体への二次植民の 1006 ヘテロ凝集を通じて徐々 に微生物の多様性5。

口腔微生物叢とホストとの共生関係の恒常性は、口腔の健康を維持する上で重要です。口腔バイオ フィルム内 dysbiosis は齲蝕と歯周疾患2,5の開発のリスクを高める可能性があります。臨床研究は、歯またはインプラントのバイオ フィルムの蓄積と歯肉炎やインプラント周囲粘膜炎6、7の発展と因果関係を示しています。炎症性プロセスの進行は、インプラントとインプラント8の結果の損失に します。

歯科インプラントと補綴コンポーネントは、細菌の植民地化およびバイオ フィルム形成9になりやすいです。低い微生物付着を提供する表面の構造と化学組成と材料の使用は、有病率とインプラント周囲疾患9,10の進行を減らすことができます。チタンは、インプラントの補綴橋台の製造のためほとんど使用材料しかし、セラミック材料は最近導入された、彼らの審美的な特性と生体適合性11,12のためチタンに代わるものとして人気を集めています。また重要なは、セラミック材料に関連付けられているおそらく減らされた潜在的な表面粗さ、濡れ性、表面自由エネルギー10,13のために主に、微生物に付着します。

In vitro研究は補綴支面9,14,15,16,17に微生物の理解の進歩に貢献しています。しかし、その変化する温度と pH および栄養アベイラビリティおよびせん断力の存在によって表される口腔内の動的な環境はない体外実験プロトコル18、再現性のあります。 19。この問題を克服するために代わりに、その場で有利ex vivo解析10,20,のための立体構造を保持するバイオ フィルム形成のモデルの使用21,22,23,24。

口腔の基板上に形成されたバイオ フィルムの複雑な構造の解析光学的高密度物質25を表示することができる顕微鏡検査の技術が必要です。多光子レーザー顕微鏡は、バイオ フィルムの構造解析26モダンなオプションです。フェムト27にパルス赤外の波長に近い光源と非線形光学の使用が特徴です。このメソッドは、蛍光材料または材料の蛍光物質、第 2 高調波発生と呼ばれる現象から派生した非線型光信号によって生成された画像に加え、マークの画像の獲得のために示されます。多光子顕微鏡の利点の中では励起光27の強度によるセルの最小被害で得られた素晴らしい画像の深度です。

多光子顕微鏡による非生物的表面にバイオ フィルムの実行可能性分析、蛍光核酸の使用染料分光特性の異なると、細菌の細胞の浸透能力必要な28です。ライブとデッド細菌28,29,30間の視覚的な差別の fluorophores が付いて SYTO9 (緑色蛍光) とヨウ化 propidium (赤色蛍光) を使用できます。Propidium ヨウ化 SYTO9 そのままと侵害された膜を細菌細胞に入る間だけ破損した膜細菌に浸透します。両方の染料がセル内に存在する場合 propidium ヨウ化核酸の相性が大きいとマーク赤28,30SYTO9 を転置します。

観点から、口腔内環境の複雑さと口腔バイオ フィルムの不均一性歯や歯科材料の表面のバイオ フィルムの解析を有効にすることができます技術が必要な顕微鏡検査。この資料では、口腔バイオ フィルム形成チタンとセラミック補綴支台用材として形態学的および細胞レベルで口腔バイオ フィルム解析にかかわる方法を比較するために実装されたプロトコルのシリーズを説明します。

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プロトコル

本研究は、リベイラン ・ プレトの歯学部の制度検討委員会によって承認された、ボランティア参加者署名された書面による同意 (2011.1.371.583 プロセス)。

1. バイオ フィルム形成その場観察

  1. 参加者の選定
    1. 次の包含の規準に基づく患者の選択: 完全な歯や口腔疾患の臨床徴候と健康な人。
    2. 以下の除外基準に基づいて患者を除外: 妊娠、母乳、齲蝕、歯周病や歯周の状態に影響を与えることができる任意の全身性疾患や喫煙者、最後の 3ヶ月で抗生物質による治療。
  2. 口腔内のデバイスの準備
    1. アルジネート印象による上顎歯列を記録します。
    2. タイプ IV 石を準備するには、石の粉 100 g に水 19 mL を追加すます。石を上顎歯列弓のモデルを作成するアルギン酸金型に注ぐ。
    3. 設計および試験片 (チタン ・ セラミック ディスク) をサポートするアクリル口腔内装置を作製します。
      1. NiCr ワイヤ (0.7 mm 径) #139 の矯正用プライヤーを使用してから保留め金を作製し、モデルにそれらを配置します。上の小臼歯の間クランプを配置して、ループを形成する各ワイヤの一方の端を曲げます。
        1. 歯間乳頭部にループを適応します。咬合、咬合と接触点と干渉しないように穏やかな曲率を挿入します。アクリルの固定クランプの端を折る 90 ° を作る。
        2. 上顎の第 2 大臼歯にクランプを合わせて頚側 1/3 の線の曲率を適応に (遠位部) の歯の輪郭を見つけ、アクリルの固定クランプの端を折る 90 ° (前庭)。
          注: 十分な保持/口腔内のデバイスに安定性を提供するために保の留め金は上顎歯列弓の両側に第二大臼歯の遠位面と配置されました。
      2. 製造元の指示に従って自己硬化アクリル樹脂を操作し、プラスチック フェーズ 3 mm 厚いシート (介在 3 mm 厚スペーサー) と 2 のガラス板アクリル樹脂を押します。
      3. デバイスの設計によるとモデルの, 口蓋部にアクリル板を置き、重合前に、カーバーで余剰レジンを切り落とします。
      4. マトリックスに溶けたロウを配置しワックスを待っている金属行列 [2 mm 厚 (78.5 mm2の面積) で、直径 10 mm] を使用した、固めるワックス ディスクを作製します。アクリル樹脂、小臼歯と第二大臼歯の横にある他の 2 の間それらの 2 に 4 ワックス ディスクを手動で埋め込みます。
      5. 圧力鍋 20 psi 未満 20 分のための圧縮空気で重合アクリル樹脂ができます。
      6. 電気歯科ラボ ハンドピースとカッターと口腔内のデバイスを終了し、ソフトス トーンで磨いてください。
      7. 上記機器を使用して口の中で適切な適合のためのデバイスを調整します。
  3. チタン、ジルコニアの標本の作製
    注: 標本 (n = 14) 直径 10 mm 厚さ 2 mm は、78.5 mm2の表面積を持っています。
    1. 摩損の減少の水冷サンドペーパーで標本の表面を磨く (600、1200、および 2000 グリット)、約 20 分。
      注: 試料の研磨表面粗さ 0.2 μ m での標準化を行った。
    2. きれいし、標本や液体洗剤と水道水で口腔内装置を消毒し使用イソプロピル アルコール超音波浴 15 分吸水紙タオルで乾かします。
    3. 口腔内口腔デバイスで無毒ホットメルト接着剤 (図 1) の約 0.1 mL で試料を固定します。
    4. 口腔内に試料を含むデバイスをインストールします。
      注: 標本を含む口腔内のデバイスは 48 時間着用必要があります。デバイスを除去し、患者が食べると口内清掃を実行するリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) に格納されます。

2. 細菌性の評価

注: サンプル サイズn = 10。

  1. SYTO9 の 3 μ L を追加することによって染色ソリューションを準備 (緑色の蛍光核酸色素) と 3 μ L propidium ヨウ化物イオン (赤い蛍光核酸色素) 1 mL の滅菌蒸留水します。
    注: は、光から保護ソリューションを準備します。
  2. 24 ウェル プレートに試料を転送し、任意の非付着性細胞を除去する PBS でそれらを徹底的に洗浄します。
  3. バイオ フィルムを含む試料をカバーする蛍光色素溶液の適切なボリューム (1 mL) を追加します。バイオ フィルムを聖ように非常に慎重に染料を追加します。
  4. 部屋の温度、光から保護で 20-30 分のための標本を孵化させなさい。
  5. 水洗いして余分な染料を除去する滅菌蒸留水とバイオ フィルム サンプル。
  6. ガラス底皿に試料を置きし、バイオ フィルム分析用顕微鏡多光子レーザーを実行します。
    注: 多光子顕微鏡システムを使用して細菌細胞生存率の解析を行った。Propidium ヨウ化物イオンの蛍光は励起/蛍光波長 546/680 のフィルターを使用して検出された nm と 477/600 SYTO9 の nm。得られた画像のサイズ (78.5 mm2) 各試験片の面積や総面積 33.94 %26.64 mm2に対応する 5.16188 x 5.16188 mm であった。画像は、1,024 × 1,024 ピクセルの解像度のサンプルの最も中心的部分から作られました。赤チャン ネル、緑チャンネルの画像は、フィジー ソフトウェア31を使用して別々 に分析しました。選択ツールを使用して選択された各セル、蛍光性の強度を画像の背景を引く、ピクセルの統合の密度を測定しました。

3. エネルギー分散分光法 (EDS) で試料の化学組成の分析

注: サンプル サイズn = 3。

  1. 各バイオ フィルム無料テスト材料の 3 片を選択し、結合した分散型エネルギー分光計、電子ビーム電圧 10 kV32の走査型電子顕微鏡を使用して各試験片の 2 つの異なるエリアの化学組成を評価します。

4. 走査型電子顕微鏡による細菌のバイオ フィルムの解析

注: サンプル サイズn = 1。

  1. 24 時間 pH 7.0 7.3 0.1 M ナトリウム cacodylate バッファーで希釈した 2.5% グルタルアルデヒドで標本を浸すことによってバイオ フィルムを修正します。
  2. PBS バッファーでサンプルを洗う (pH 7.6 を =)。
  3. 1 時間 1% オスミウム四酸化でバイオ フィルムを後置します。
  4. PBS バッファーでサンプルを洗う (pH 7.6 を =)。
  5. バイオ フィルムのサンプルを慎重に脱水するため、エタノール溶液 (50%、70%、90%、95%、100%) の濃度を高めることに没頭してそれらを保ちます。
    注: は、100% の濃度でエタノールの 3 つの交換を実行します。合計脱水ステップは、約 2 時間かかります。
  6. 臨界点乾燥機に標本を転送し、二酸化炭素 (CO2) いくつかの置換を行う標本が乾くまで。
  7. 装置から乾燥標本を削除し、走査型電子顕微鏡のホールダーにそれらをマウントします。
  8. スパッタ コート 120 のため試験片の表面に金の 20 nm 層 s。
  9. 走査型電子顕微鏡室にゴールド コーティング ディスクを挿入します。各試験片は、圧力可変下 20-30 kV、650 X 倍率12の異なる 5 つのエリアからイメージを取得します。

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結果

本研究では多光子顕微鏡検査 (を使用して標本の合計スキャン領域に関連してチタン、ジルコニア ディスクに植民地化された領域の割合によって表されるバイオ フィルムの in situ成長の 48 時間後の植民地化の密度26.64 mm2)。図 2は、3 のテスト材料の表面の細菌の定着密度を表します。バイオ フィルムの密度が高いが、加工チタン ディスク上、キャストの表面に観察された (0.0292 μ m2と 0.0213 μ m2、それぞれ) よりジルコニア ディスク (0.0099 μ m2;p < 0.05;ダンのテスト続いて Kruskal-Wallis テスト)。

図 3は、ジルコニアの表面の細菌の細胞生...

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ディスカッション

本研究で説明されたプロトコルは、チタン、ジルコニア補綴橋台は、細菌の細胞生存率と形態的特徴の分析を含む用材料のバイオ フィルム形成を評価するため開発されました。このため、テスト材料のサンプルを収容し、48 h の動的な口腔環境にさらされるそれらを保つために口腔内装置から成るバイオ フィルム形成の場でモデルは設計されました。デバイスは、快適かつ簡単に挿入、削除、およびボランティアによってきれいと考えられていた。まだ、音声学と美学にはほとんど影響はシンプルかつ低コストに、でき、バイオ フィルムの構造の中断のない標本の簡単な回復を示した。さらに、メソッドは、細菌細胞と細胞外マトリックスの整合性の保持を許可しました。標本と舌の接触実験中にディスクの偶発的な損失は、提案モデルの制限事項。メソッドの制限事項を最小限にするためには、口腔内のデバイスのディスクの位置決めは配布されたランダムに;さらに、ディスクが非毒性ホットメルト接着剤で修正され、サンプルの損失は報告されませんでした。

口腔内環境に生息する菌種の高の不均一性による強力な顕微鏡検査の技術はそのハード面を植民地化するバ...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者に感謝顕微鏡マルチユーザ研究室 (リベイラウンプレトの医学) からジョゼ ・ アウグスト ・ Maulin EDS と SEM の彼の寛大な支援の分析とビデオ版の彼の寛大なテクニカル サポートにビッグブラザー テイシェイラ マチャド。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ハイドロガム 5Zhermack デンタル C302070
デュロン IVデンツプライ17130500002
NiCr ワイヤー モレリ55.01.070
ジェット自動重合アクリルClássico
デンタルワックス Clássico
プレッシャーポット エッセンスデンタル
サンドペーパー 600グリットノートンT216
サンドペーパー 1200グリットノートンT401
サンドペーパー 2000グリットノートンT402
メタログラフィック研磨機アロテック
イソプロピルアルコールシグマ・アルドリッチW292907
ホットメルト接着剤TECSILPAH M20017
Filmtracer LIVE/DEAD Biofilm Viability KitInvitrogenL10316
ピペットチップ、10 & マイクロ;LカズヴィK8-10  
ピペットチップ、1,000 & マイクロ;LKASVIK8-1000B  
24ウェルプレート KASVIK12-024
ガラス底皿Thermo Scientific150680
AxioObserver 倒立顕微鏡 ZEISS
Chameleon vision ii レーザーCoherent
Objective EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DICZEISS440452-9903-000
SDD センサー - X-Max 20mm²オックスフォード・インストゥルメンツ
グルタルアルデヒド溶液SIGMA-ALDRICHG5882
カコジル酸ナトリウム バッファー シグマ・アルドリッチ97068 
四酸化オスミウムSIGMA-ALDRICH201030
Na2HPO4SIGMA-ALDRICHS9638リン酸緩衝生理食塩水の調製に使用
KH2PO4>SIGMA-ALDRICHP9791&;
NaClMERK1.06404
KclSIGMA-ALDRICHP9333 
分析用エタノールアブソリュート EMSUREMERK1.00983
CPD 030 臨界点乾燥機BAL-TEC
JSM-6610シリーズ 走査型電子顕微鏡JEOL
SCD 050 スパッタコーターBAL-TEC

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