Method Article

新鮮凍結ひと組織から腸管神経節の隔離のためのレーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクションの最適化

DOI:

10.3791/57762

⸱

June 14th, 2018

 ,  , 
1Vanderbilt University Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルの目標は、レーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) を使用して固定されていない、新鮮な切除のひと腸管組織から分離した腸管神経節から整合性の高い RNA サンプルを取得することです。このプロトコルは、人間の腸組織、セクショニング、エタノール染色脱水、LCM、フラッシュ凍結サンプルの準備および RNA の抽出。

Abstract

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このメソッドの目的は、腸管神経節レーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) を使用して固定されていない、新鮮な切除のひと腸管組織から収集から整合性の高い RNA サンプルを取得することです。RNA シーケンスの十分に高い品質と量と腸管神経節から RNA 分離を得るために重要であるワークフローで 5 つのステップを識別しました。まず、腸組織を準備しているとき、各サンプルは大きな基本金型の下に可能な限りの漿膜を平坦化する前にしみが付くことによって削除すべての余分な液体が必要です。サンプルは、スラリー状のドライアイスと 2 methylbutane の上にすぐにフリーズします。第二に、組織を区分するとき、腸のセクション並列スライドごと腸内神経節の最大の表面積降伏、筋間神経叢完全な平面に配置するには、cryomolds 重要です。第三に、LCM、ポリエチレン napthalate (ペン) 中-膜のスライドは、最大速度および腸管神経節を収集するとき、腸管神経節の一様でない図形をアウトラインで柔軟性を提供します。第四に、セクション内で腸管神経節の異なる可視化、エタノール互換染料、クレシル バイオレットのような水性染料を基準にして RNA 整合性の優秀な保存を提供します。最後に、キャプチャした節からの RNA の抽出のため、我々 は DNA 汚染を排除しながら優れた RNA 量が得られた商業の RNA 抽出キットと、品質の違いを観察しました。これらの要因の現在のプロトコルの最適化は大きくワークフローを加速し、例外的な RNA の品質と量と腸管神経節のサンプルが得られます。

Introduction

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このメソッドは、レーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) を使用して人間の腸組織から腸管神経節の高品質 RNA サンプルを取得します。ここで説明したプロトコル RNA シーケンス (seq RNA) の十分な RNA の品質と生産性を提供するために最適化されているし、新鮮な切除、固定されていない、フラッシュ冷凍人間の腸組織で使用するものです。

機能性消化管・腸の運動障害、米国のすべての 4 人の影響を与えます。腸神経系 (ENS)、2 つ目の脳の1とも呼ばれます、しばしば、これらの無秩序の中心に腸内の恒常性と運動で重要な役割を果たしています。消化管運動の操作は一般的に結腸/noncontractile 組織、慢性的な食餌療法の修正および/または薬の外科的切除に制限されています。驚いたことに、大人の ENS のにおけるトランスクリプトームの大幅薬学的ターゲットまたは幹細胞療法に活用できる ENS 内の分子を識別するために我々 の能力を制限するシーケンスするままです。

人間の腸管神経節からの RNA を隔離するため比較的少数の方法があります。高い温度と長い潜伏時間; 細胞解離2、最初のアプローチが必要です。両方あるの RNA の劣化を促進し、トランスクリプトーム2

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Protocol

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ここで説明されているすべてのプロトコルは、ヴァンダービルト大学制度審査委員会 (IRB) によって承認されています。

1. 組織の到着前に準備

  1. 適切な IRB の承認し、研究に必要なすべての研究条件を満たすドナーからの新鮮な切除、固定されていない腸組織を取得する人間の臓器寄贈機関と連携。
    注: このプロトコルはマウスとその他の齧歯動物モデルで使用のために適応することができます。
    1. すぐに腸管各部位の切除時に徹底的に冷やした PBS または組織記憶媒体, 材料の残留や糞便を削除すると内腔をフラッシュします。
    2. フラッシュと適切なバイオハザード容器廃棄物を破棄後、組織記憶媒体 (3-5 回腸組織量) などの十分な量のティッシュが水没し、個別にラベリング、水タイトなプラスチックに格納氷に浸漬または使用するまで冷蔵コンテナー)。
    3. プロセスの相当な RNA の劣化を防ぐために収集時から 18 26 時間以内組織。
      注: によって腸管とストレージの清潔、それあります当社推奨の制限時間を拡張することが可能。
  2. このプロトコルで示されているように、人間の組織のコレクションを事前にために必要なすべての材料を準備 (より詳細な製品情報については材料の表を参照してください)。必要なすべてのすべての回で保護具を着用することを確認します。....

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Results

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RNA シーケンスの基準を満たして、LCM を使用して人間の腸サンプルから腸管神経節の比較的急速なコレクションを有効にする既存のプロトコルをいくつかの改良を行った最初に、我々 は 2 MB (図 1B) にドライアイスのスラリーの表面で置かれた大きい基本金型内の腸組織のセグメントの急速凍結を最適化されています。セクショニングおよび後続の LCM の中に最高の成功は、腸管 (1 b ・ 1 C の数字) を粘膜側に直面している、基本金型内でフラットを置くことによって得られました。基本型がベースでできるだけ平ら任意の曲率は筋間神経叢に断面積の大きなを取得する非常に難しくなることを確認します。このアプローチは、8 μ m の厚み (図 1E) で簡単に断面化し、染色のプロセスから TFM の完全な除去は、組織の結果します。TFM 染色のプロセスと干渉して従って.......

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Discussion

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この手順により、RNA シーケンスの RNA を導出するソースとして多数の腸管神経節の収集の効率化ここでは、私たちが最大限に RNA の整合性を維持しながら、既存のプロトコルで概説されているプロセスを加速しました。この手順のすべてのステップは互いに、そのすべての問題は、研究の開始から排除され、すべてのサンプルが準備されていると同様に互いにできるだけ信頼性の高い RNA シーケンスを取得することが重要です。

プロシージャの発症から RNA の整合性が低下する場合研究室で処理の臓器提供の時に組織のコレクションと組織の領収書との間の時間間隔 (冷阻血時間) が長すぎる場合。この問題を考えると、我々 は高品質の RNA は、冷阻血時間の 24 時間後も腸サンプルからまだ抽出することができます驚いていた。腸のサンプルは冷蔵、コールド ストレージ ソリューションに適切に格納されている、組織の整合性と RNA の品質の最高の保護があります。腸の組織がオルガン コレクション チーム、腸の消化酵素、RNases、この期間中に RNA の品質に影響を与える可能性があります他の分子への暴露を制限するコレ.......

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Disclosures

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著者はある利益相反を開示します。

Acknowledgements

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この作業を可能にした家族とドナーに感謝しております。我々 はまた国際医学研究所と本研究で使用される組織の座標のコレクションを助けるためテネシー州ドナー サービスのスタッフの援助を感謝しています。この作品は、健康の国民の協会、NIH OT2-OD023850 EMS2と奨学金支援に AMZ に NIH から T32 DK007673 からの補助金によって支えられました。LCM 楽器およびティッシュの準備についてのアドバイスへのアクセスのヴァンダービルト並進病理学共有リソースのスタッフに感謝しております。ヴァンダービルト組織病理学共有リソースは、NIH 助成金 P30 CA068485 14、U24-DK059637-13 によって一部サポートされます。ゲノム解析のヘルプありがとうワシントン大学医学部遺伝学教室で、ゲノム技術センター。GTAC サポートは部分的に NCI 癌センター サポート助成金 #P30 CA91842 Siteman がんセンターに、センターから ICT/CTSA グラント #UL1TR002345 研究リソース (傘下)、国立機関の健康 (NIH)、および NIH のコンポーネント医学研究のためのロードマップです。この出版物は著者の責任と NIH 傘下の公式見解を必ずしも表さない。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10% 中性緩衝ホルマリンSigmaHT501128-4L
2-メチルブタンフィッシャーO3551-4
3 mL シリンジBD309628
50 mL コニカル チューブ、ポリプロピレン コーニング05-526B
ベースモールド37x24x5mm、使い捨て電子顕微鏡科学5025511
Belzer UW コールドストレージソリューションBridge to LifeN.A.
CapSure Macro LCMキャップArcturus、ThermoFisherLCM0211
Cling Wrap、Press'n シール   うれしい  N.A. 
クレシルバイオレットアセテートアクロス有機物AC405760025
まな板電子顕微鏡科学63308
エタノール、190プルーフPharmco-AAPER111000190
エタノール、200プルーフPharmco-AAPER111000200
ガラス顕微鏡スライドフィッシャー12-550-343
グローブ、拡張カフMicroflex 
ガウン、外科用キンバリー・クラーク 19-088-2116
トレー 20 L (大型ポリプロピレン滅菌パン)Nalgene  1335920B
キムワイプ(大)キンバリー・クラーク 34120
キムワイプ(小)Kimberly-Clark 34133
レーザーキャプチャマイクロダイセクションシステム(ArcturusXT)ThermoFisherN.A.
ライカ クライオスタットチャック 大  40 mm サウスイースト病理機器サービスN.A. 
光学顕微鏡オリンパスCX43
顕微鏡対物レンズ (20X)オリンパスUPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17N.A.
顕微鏡対物レンズ (10X)Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/-N.A. 
モレキュラーシーブアクロス オーガニックスAC197255000
ヌクレアーゼフリー水アンビオンAM9937
PicoPure RNA抽出キットApplied Biosystems12204-01
ペレット 乳棒キンブル Kontes4621973
PEN膜 LCMスライドArcturus, ThermoFisherLCM022
RNaseフリーチューブ、1.5 mLAmbionAM12400
RNaseZAP SigmaSigma-R2020
RNA 抽出キット "A" (PicoPure)Applied Biosystems12204-01
RNA Extraction Kit "B" (RNeasy マイクロキット)Qiagen74004
RNA Extraction Method "C" (TRIzol)Invitrogen15596-026
RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit)Qiagen74134
Splash Shield, disposable faceshieldFisher17-310
Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp"Fine Science Tools14002-14
シリンジフィルター、酢酸セルロース (0.2 μm)ナルゲン  190-2520
組織凍結媒体一般データ ヘルスケアTFM-5
キシレンフィッシャーX3P1GAL
19010144使い捨て

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gershon, M. D. The second brain : the scientific basis of gut instinct and a groundbreaking new understanding of nervous disorders of the stomach and intestine. , HarperCollinsPublishers. 1st edn (1998).
  2. Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schafer, K. H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse ....

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