新鮮凍結ひと組織から腸管神経節の隔離のためのレーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクションの最適化

サマリー

このプロトコルの目標は、レーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) を使用して固定されていない、新鮮な切除のひと腸管組織から分離した腸管神経節から整合性の高い RNA サンプルを取得することです。このプロトコルは、人間の腸組織、セクショニング、エタノール染色脱水、LCM、フラッシュ凍結サンプルの準備および RNA の抽出。

要約

このメソッドの目的は、腸管神経節レーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) を使用して固定されていない、新鮮な切除のひと腸管組織から収集から整合性の高い RNA サンプルを取得することです。RNA シーケンスの十分に高い品質と量と腸管神経節から RNA 分離を得るために重要であるワークフローで 5 つのステップを識別しました。まず、腸組織を準備しているとき、各サンプルは大きな基本金型の下に可能な限りの漿膜を平坦化する前にしみが付くことによって削除すべての余分な液体が必要です。サンプルは、スラリー状のドライアイスと 2 methylbutane の上にすぐにフリーズします。第二に、組織を区分するとき、腸のセクション並列スライドごと腸内神経節の最大の表面積降伏、筋間神経叢完全な平面に配置するには、cryomolds 重要です。第三に、LCM、ポリエチレン napthalate (ペン) 中-膜のスライドは、最大速度および腸管神経節を収集するとき、腸管神経節の一様でない図形をアウトラインで柔軟性を提供します。第四に、セクション内で腸管神経節の異なる可視化、エタノール互換染料、クレシル バイオレットのような水性染料を基準にして RNA 整合性の優秀な保存を提供します。最後に、キャプチャした節からの RNA の抽出のため、我々 は DNA 汚染を排除しながら優れた RNA 量が得られた商業の RNA 抽出キットと、品質の違いを観察しました。これらの要因の現在のプロトコルの最適化は大きくワークフローを加速し、例外的な RNA の品質と量と腸管神経節のサンプルが得られます。

概要

このメソッドは、レーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) を使用して人間の腸組織から腸管神経節の高品質 RNA サンプルを取得します。ここで説明したプロトコル RNA シーケンス (seq RNA) の十分な RNA の品質と生産性を提供するために最適化されているし、新鮮な切除、固定されていない、フラッシュ冷凍人間の腸組織で使用するものです。

機能性消化管・腸の運動障害、米国のすべての 4 人の影響を与えます。腸神経系 (ENS)、2 つ目の脳の¹とも呼ばれます、しばしば、これらの無秩序の中心に腸内の恒常性と運動で重要な役割を果たしています。消化管運動の操作は一般的に結腸/noncontractile 組織、慢性的な食餌療法の修正および/または薬の外科的切除に制限されています。驚いたことに、大人の ENS のにおけるトランスクリプトームの大幅薬学的ターゲットまたは幹細胞療法に活用できる ENS 内の分子を識別するために我々 の能力を制限するシーケンスするままです。

人間の腸管神経節からの RNA を隔離するため比較的少数の方法があります。高い温度と長い潜伏時間; 細胞解離²、最初のアプローチが必要です。両方あるの RNA の劣化を促進し、トランスクリプトーム^2,3を変更知られています。代替アプローチ、LCM、詳細は確実にトランスクリプトームを保存し、RNA の整合性を保護します。いくつかの研究は、LCM を使用新鮮凍結ひと腸管組織^4,5,6から大脳基底核を収集するが、これらのアプローチが貧しい人々 の RNA の品質や数量に阻まれたか、非常に労働集約的であったか汚れるか、または私たちの手で動作するように RNA 抽出技術の変更を必要とします。マニュアル提供腸管神経節^8,の分離に適用されるときに追加改善^7、8、しかし適応が必要だった LCM 製品で発見された RNA を保持するために設計された他 LCM のプロトコル⁹しますこれらの理由から、我々 はひと腸管神経節から整合性の高い RNA の相当な量を生成、比較的高速なワークフロー、大規模な全体で一貫性のある結果を生成するこれらのリソースに基づいて最適化されたプロトコルを開発。サンプルの数。

本研究では人間の腸切除から腸管神経節から整合性の高い RNA の分離を容易にする最適化された手順の概要を提案します。私たちの方法には、5 つの重要な側面が組み込まれています。最初、新鮮な切除、固定されていない人間の腸サンプル研究所組織で除去し、スラリー状のドライアイスと 2-methylbutane (2 MB) 上にフラッシュ凍結する前に大規模な基本金型で平坦化のすべての余分な水分は、サイズに整うべきであります。筋間神経叢に腸の神経節細胞の大規模なペイロードを提供するスライド上の完全な平面を取得には、腸の第二に、組織学的セクションを備える必要があります。この手順での成功は組織の準備プロセスに大きく依存です。第三に、神経節、ENS の不均一構造ポリエチレン napthalate (ペン) 膜スライド⁶、LCM プロセス中に最大の速度と精度を提供するの使用が必要です。クレシル バイオレットなどの第四に、エタノールと互換性のある染料は、腸の神経節細胞を染色しながら RNA の整合性を維持するために使用ください。最後に、RNA 抽出プロセスは RNA シーケンスで成功を収めるのための重要です私たちは真心を RNA を生成、腸管神経節の小さなコレクションを開始するときに RNA の収量を最大化、DNA 汚染を排除しできるだけ RNA の多くの種を保持 RNA 抽出方法を追求しました。

一緒に取られて、本研究ではこれらの要因の最適化は大きくワークフローを加速し、例外的な RNA の量と質と腸管神経節のサンプルが得られます。結果は、主としてこのアプローチの一貫性を示すサンプルのかなりのグループの間で一貫しています。さらに、正常に腸の神経節細胞からの RNA のサンプルの数十をシーケンス処理するこれらの方法を使いました。ここを強調する戦略には、目的の神経節の LCM あるいは末梢と中枢神経系と高品質 RNA の隔離を必要とするその他の場合の核を実行するため広く適応ことができます。

プロトコル

ここで説明されているすべてのプロトコルは、ヴァンダービルト大学制度審査委員会 (IRB) によって承認されています。

1. 組織の到着前に準備

1. 適切な IRB の承認し、研究に必要なすべての研究条件を満たすドナーからの新鮮な切除、固定されていない腸組織を取得する人間の臓器寄贈機関と連携。
   注: このプロトコルはマウスとその他の齧歯動物モデルで使用のために適応することができます。
   1. すぐに腸管各部位の切除時に徹底的に冷やした PBS または組織記憶媒体, 材料の残留や糞便を削除すると内腔をフラッシュします。
   2. フラッシュと適切なバイオハザード容器廃棄物を破棄後、組織記憶媒体 (3-5 回腸組織量) などの十分な量のティッシュが水没し、個別にラベリング、水タイトなプラスチックに格納氷に浸漬または使用するまで冷蔵コンテナー)。
   3. プロセスの相当な RNA の劣化を防ぐために収集時から 18 26 時間以内組織。
      注: によって腸管とストレージの清潔、それあります当社推奨の制限時間を拡張することが可能。
2. このプロトコルで示されているように、人間の組織のコレクションを事前にために必要なすべての材料を準備 (より詳細な製品情報については材料の表を参照してください)。必要なすべてのすべての回で保護具を着用することを確認します。
3. 図 1に示すように、ドライアイス スラリーと共にドライアイス バケツを準備します。
   1. 4 標準的な円形の氷のバケツと 1 つの長方形の氷のバケツを埋めるに十分なドライアイスを粉砕します。標準バケットのいずれかが小 (11 x 21 cm) 所あるはず組織がドライアイスの表面に配置されます。可能であれば、研究所組織の新しい、未開封のボックスを使用します。
   2. きれいな長方形の氷バケットにドライアイスの 2 L を粉末化によってドライアイス スラリーを作る。
   3. ドライアイスの表面にあらかじめ冷やした 2 MB を追加します。少しミックス、長方形のバケツの側面に沿ってドライアイスのより大きい部分に囲まれたチャネルにスラリーの面形状にピペット チップ ボックス カバーを使用してスラリーを平らにします。
   4. ドライアイスより急速凍結を奨励するための氷のバケツの縁に沿っていくつかの薄いブロックを配置します。≥4 時点でドライ氷スラリーのバケットに緩くフィットする基本型のための部屋があるはずです。
      1. 必要に応じて、スタック内で別の長方形の氷のバケツの氷のバケツはドライアイスと満たされました。この位置よりドライ氷スラリーを分離するのに役立ち、プロシージャの間にドライアイスと 2 MB の頻繁な調整の必要性を防ぎます。
   5. 次の順序で組立ラインにおけるドライ氷バケットの位置: ドライアイス 1) スラリー バケツ、2) 研究所組織ドライ アイス用バケツ、3 & 4) 通常乾燥の氷のバケツ、バケツ 5) 長方形のドライアイス (図 1A)。

2. フラッシュ冷凍人間の腸組織の準備

メモ: このプロセス全体は、腸組織の質によって、腸内のセグメントあたり 45 80 分間かかります。また、RNA の品質および LCM に進む前に組織を評価する品質管理サンプルの収集をお勧めします。

1. 濡れた氷と大きなトレイを埋めるし、ドライアイスの上に手術用まな板を配置します。
2. このセットアップでコールド ストレージ ソリューションに組織とトリミングされたセグメントを格納するための 500 mL と 100 mL ビーカーを冷やします。組織を受信する準備ができているので、あらかじめチル ベースをカッティング ボードに成形します。
3. 新鮮な腸組織を受信すると、組織は運ばれるメディアを注ぎ、あらかじめ冷やしたビーカーでそれを保持します。腸組織、以降の手順で準備がトリミングされたセグメントの一時的なストレージのためのこれらのビーカーでいくつかの部屋を残してください。
4. 腸内のセグメントをダウン ストリーム アプリケーションの RNA を生成する十分な組織 (40 ~ 60 cm²) と品質コントロールのサンプルを提供しています約 20 cm の長さにカットします。組織の整合性によって (すなわち腸の 5 cm) はるかに小さい長さとダウン ストリーム処理のための RNA の隔離を達成するために実行可能な場合があります。
5. 離れて脂肪と手術用のはさみを使用して腸から膠原病をトリミングします。腸の漿膜に沿って脂肪残留は、以降の手順で組織を完全に平坦化機能を妥協します。構造的に筋間神経叢の損傷または区分のため均等にフラット化組織の外観を作ることができます脂肪と結合組織の除去中に漿膜を傷つけないでくださいするために、組織を慎重に切り落とします。
6. 腸間膜の添付ファイルのサイトでできれば腸のサンプルの全体の長さに沿って縦切開を確認します。
7. 先を解剖し、緊張から解放されてより容易にフラット化、大腸から大腸菌を破棄します。
8. 冷製のまな板の上にダウン腸粘膜側をスプレーし、ティッシュの完全な長さから 1.25 cm 幅のストリップをカットします。
   注: このサイズをそれに応じて調整する必要がありますので、腸組織はトリミング後、よく展開します。
9. 冷蔵組織ソリューションにストリップを一時的に格納します。
   注: 我々 は比較的優れたコスト パフォーマンスは、長い貯蔵寿命を持って、必要になるまで室温で保存することができますのでベルザー UW コールド ストレージ ソリューションを使用します。
10. コールド ストレージ ソリューションから組織のストリップを外し、セグメント ~1.5-2 cm の長さに切る。
11. すぐに余分な液体を削除し、フラッシュ凍結中に腸の漿膜に沿って氷結晶の形成を防ぐために、研究室のワイプのスタックの腸管をしみ。組織が十分に乾燥しない場合それは筋間神経叢から高品質のセクションを取得することは困難になります。
12. 中古冷蔵, 大規模な, 使い捨てプラスチック ベース金型 (37 × 24 × 5 mm) ブロッティングの腸の部分の粘膜側が横たわっていた。
13. 慎重に軽く優しく押し、漿膜の下に閉じ込められる可能性があります任意の気泡を追放するカーブタイプ鉗子を使用して基本金型の表面に組織をストレッチして各セグメントを平らにします。組織をフラット化しながら拡大するに注意してください。必要に応じてセグメントをトリムし、小さいサイズで残りのサンプルをカットします。
    注:組織がオーバー ストレッチの場合これは筋間神経叢を歪めます。すべての空気の泡を削除した後に前に凍結試料の厚さを評価します。必要な場合は、腸内のサンプル、元の厚さに近づくまで試験片内側のエッジを押し込みます。
14. ドライアイス、2 MB のスラリーのサーフェイスに読み込まれた基本型を置きます。組織が 30-60 秒、サイズと腸内のセグメントの厚さに応じて内で完全に固定します。
15. ドライアイスの 2 番目のバケットであらかじめ冷やして研究所組織の基本金型をすぐに擦って残留 2 MB を削除する基本型の底を乾燥させます。
16. ドライアイスの 3 番目の浴槽に乾燥したサンプルを転送し、ラップする準備ができるまでドライ氷の表面の下でそれを埋めます。
17. すぐに折り返し、試料の品質を調べる前に基本型の底を観察します。これらセクショニング メーター パネルおよび LCM を避けるべきである、フラットに表示のない、または大きい空気泡、サンプルのメモしておきます。
18. 完全に凍結を秘められながらティッシュの折り返しが行われるように、バケツにドライアイスの上に配置される事前ラベル付きアルミ箔でサンプルをラップします。
19. -80 ° C で保存中の組織の脱水症状を最小限に抑えるためのプラスチック製のラップの層でサンプルをラップします。
20. 冷凍庫に移動する準備ができるまでは、長方形のバケツでサンプルを格納します。
21. 事前にラベルを付ける、事前コレクション後のサンプルの-80 ° c の即時ストレージ用冷凍ボックスを冷やしなさい。
22. LCM を行う前に RNA の整合性の評価のための腸管各部位からのティッシュの小さい部分を取る。
    1. 前のラベル、各セグメントの 2 mL RNase フリー チューブ換散バッファーの ≥500 μ L でいっぱい。我々 は RNA 抽出キット材料の表に記載されている"D"を使用してお勧めします。
    2. 標準組織マイクロ ホモジナイザー (20-40 秒、組織塊がなくなるまで) 腸の小さな (2 mm × 2 mm) 作品をホモジナイズしてください。その後、RNA の抽出に進むまでドライアイスと-80 ° C でストアのライセート RNA を凍結します。
    3. 必要に応じて、バックアップとして組織凍結培地 (TFM) で一部のセクションを埋め込みます。このセクションに記載されている正確な同じ方法でティッシュ セクションの準備が、TFM でフラッシュ凍結前に基本金型内のサンプルが水没します。

3. セクショニング

1. セクショニング、前に染色と脱水のためのすべての必要な材料を準備し、ドライアイスの入ったバケツに-80 ° C のフリーザーから目的の組織サンプルを転送します。
2. 最適な切削温度 (-18-22 ° c) を設定して 100% エタノールで表面を拭き、ブレードの治療で使用用クライオスタットを準備し、RNase 除染液でトレイをブラシします。
3. 最高チャックにサンプルを付着するには、次の方法を使用します。
   1. 少なくとも 30 のドライアイスに鉗子を置く s 腸サンプルを開けるとドライアイスの漿膜側を表面に置くことの前に。
   2. 大型クライオスタット試料ホルダーに組織凍結媒体 (TFM) の 3 ~ 5 mm のマウンドを注ぐし、すぐに転送、腸サンプル漿膜側-アップ、TFM に。
   3. 室温で 2-5 秒のサンプルに付着する TFM を可能にした後ドライアイスと粉々 になったドライアイス カバー試料ホルダーをすばやく転送します。筋間神経叢の平面より下、TFM が残っていることを確認します。
      注: 理想的には、腸粘膜の外側の表面は完全準拠、TFM、TFM が試料の融解せず凍り始める前に。
4. クライオスタットの試料ヘッドに試料ホルダーをマウントし、筋間神経叢の平面は切刃を平行になるように、クライオスタットの刃で供試体を合わせます。
5. 8 μ m のクライオスタットの断面の厚さを設定します。試料を完全に位置合わせの目的筋間神経叢に各スライドに最大可能な表面積を得ることです。この厚さは人間および齧歯動物の組織の一般的にお勧めしますが、必要に応じて調整することができます。
6. 漿膜や筋間神経叢に到達するまで縦の筋肉を介してセクション。
   1. 筋間神経叢をスライドのサンプル セクションをマウントし、 1% クレシル バイオレットやトルイジン ブルーなどなどの水性染料のセクションを染色します。
   2. 縦走筋層間の接合部を識別するために 40-2000年倍の倍率の顕微鏡の下でセクションを表示します。顕微鏡のパラメーターは、テーブルの材料で提供されます。セクショニングの開始、漿膜結合組織の存在によってマークされます。いくつかの残りの腸間膜の脂肪は、漿膜に沿って存在もあります。外側の縦走筋層のシートを開始します。縦走筋層間の境界に達すると、腸の神経節の部分が観察されます。
      注: 次のいくつかのセクションで筋間神経叢になります (図 2C) 1 つのセクション内に存在する神経節の大 swaths で非常に明白。組織は、セクショニングの開始時は完全にフラットではない、神経節の部分にだけは指定された時間に各セクションに存在ものになります。時に、腸内のサンプルは、にもかかわらず、完全にフラットに表示される組織の本質的に不均一な腸管神経叢にあります。これは十二指腸のサンプルの特に当てはまります。我々 の経験でこれらのサンプルは、LCM で処理するため時間がかかりますが、十分な RNA は 1 日のセッション内で収集することができます。筋間神経叢の正確な位置は、サンプル組織および凍結する前に準備をによってかなり異なります。
7. ニューロンとグリア スライドごとの最大数を提供する最適なコレクションで、最小公倍数の連続切片を収集を開始します。サンプルの表面積によって単一のペン膜スライド上に複数のセクションを結合できます。
8. ペン膜スライド、5-10 s 用クライオスタットで簡単に冷蔵にセクションをマウントします。マウントするとき、組織が RNA の整合性を最大限に維持、わずかに溶かします。

4. 染色

注: 染色プロセスの概要については、表 1を参照してください。使用されるすべてのソリューションは、標準的な 50 mL コニカル バイアル用意しています。RNase 除染液をチューブの外側の治療は、(データは示されていない) の結果を改善するためには表示されません。

1. 少なくとも 1 日前 95% エタノールの 4% クレシル バイオレットの飽和溶液を準備し、完全に再注射器をロードする前にクレシル バイオレットを中断します。
   注: ディスカッション セクションで説明するよう、エタノールの濃度は効果的な汚損のため低下する必要があります。我々 は RNA の整合性を削減大幅に染色時に 50% または 75% エタノールを使用しているかどうかをテストしていません。クレシル バイオレットは、光に敏感なしたがって、光から保護する必要があります。
2. 筋間神経叢にスライドにセクションをマウントした後すぐに 30 (-20 ° C であらかじめ冷やして) 95% エタノールの円錐形の瓶でスライドを水没 s。
   1. セクションは、前の手順では、スライドに完全に付着しなかった場合、は、手袋をはめた手で (研究所拭く必要があります配置間スライドをして手袋)、95% エタノールに水没する前に完全な固執のスライドの下部やや暑い。このソリューションは、RNA の整合性を低下させることがなく、少なくとも 3-6 スライドの再利用することができます。
3. スライドの顔アップを前処理、RNase フリー コンテナー⁸頂上置かれたラボ ワイプに横たわっていた。
4. 事前に記入 3 mL シリンジ 4% クレシル バイオレット、0.2 μ m のシリンジ フィルターを取り付けます。
   注:セルロース アセテート フィルターをお勧めします。
5. 6-10 滴ティッシュのセクション⁸に直接汚れを適用し、10-30 秒、または十分な色素まで孵化させなさいとき保持解除ステンド グラスします。染色しながら優しくティッシュ セクションは均等に汚れが塗られることをように手でスライド コンテナーを回転させます。
6. 汚れを注ぐし、すぐに解除 75% のエタノールのバイアルのスライドを染色します。サンプルから余分な染料が染みこみ主まで繰り返しスライドが水没します。これは 10-20 秒間かかる場合があります。
7. ファイナライズ解除繰り返しを浸すことによって 95% のエタノールのバイアルのサンプル 10 s. 埋没サンプルを繰り返しすべての余分な汚れを削除するまで染色します。
   1. 大脳基底核の染色を最適化するために、必要に応じては、染め色の期間を変更します。場合はあまりにも多くの汚れを除去すると、サンプルがあまりにも透明になるし、可視化が困難になる場合があります。
      注: この汚損のプロトコルはに基づくいくつかの出版物^5,8,10,11満足のいく結果が得られた前に、変更を必要とする最適化されています。したがって、染料と染め色のプロセス中に使用されるエタノールの濃度を変更する必要があります、最適な結果を得るため、必要があるとき。

5. 脱水

1. 2-3 回、10-20 s の合計は、100% エタノールでスライドのディップをすぐに。
2. 少なくとも 30 の無水の 100% エタノールでスライドを水没 s。無水エタノールは非常に吸湿性が、水気を吸収し、こうしてより完全に脱水サンプル⁵プロシージャの開始前に 100% エタノールのバイアルにモレキュラーシーブ (8-12 メッシュ) を追加します。
3. 15-20 秒のキシレンのスライドを繰り返し浸しなさい。このステップは完全にスライドのエタノールのレイヤーを削除します。キシレン、余分なエタノールと水分子⁵を完全に吸着管に早めにモレキュラーシーブを追加します。
   注意: キシレン眼及び上部気道への刺激物として分類され、化学の発煙のフードで使用する必要があります。
4. 少なくとも 10 分 (分子篩、8-12 メッシュ) とキシレンのスライドが水没します。
   注:必要な場合、この手順の後簡単な休憩を取ることが。汚損、LCM や RNA の収量/整合性に悪影響なしで 4-5 時間サンプルはキシレン左することができます。
5. 必要に応じて、個別には、この時点でいくつかの追加スライドを準備します。スライドの 2 番目のラウンドを準備して、すべての準備されたスライドに LCM を完了した後、クリオスタットで組織が組織表面の脱水のため refaced する必要があります。4 個に 1 つのセクションは、使用可能なセクションが収集する前に破棄する必要があります。

6. レーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM)

1. キシレンからスライドを削除し、LCM 顕微鏡ステージに LCM キャップの少なくとも 1 分、カートリッジの挿入のための化学発煙のフードでそれを空気乾燥します。ステージ上にスライドを読み込み、スライドの概要イメージを取得します。
2. LCM の目的の場所を特定し、スライド上にキャップを読み込みます。
3. 赤外線 (IR) レーザーを合わせ、キャプチャ 20-30 μ m 径をスポットするそのパワーと期間を調整します。
4. 紫外線 (UV) レーザーを検索し、適切な切削速度と強度を設定します。
5. (緑の円としてソフトウェア プログラムのスライドの概要に示されている) キャップの回収領域の境界内にとどまることを確かめる LCM ソフトウェアを使用して収集する目的の神経節を概説します。
6. トレースのそれぞれで、IR スポットごとの 100-500 μ m の少なくとも 1 つがあるような赤外線スポットを調整します。
7. すべてのマークされた節のコレクションを続行する IR/UV カット ボタンを押します。
8. コレクションを完了すると、cap を新しい場所に移動しコレクション プロセスを繰り返すか、節で (または 60-80 分の推薦された制限時間に到達するまで)、キャップはいっぱい十分にいったん QC 駅で LCM キャップで検査します。
9. キャップの破片がある場合は、離れては RNase 除染液と前処理、ヌクレアーゼ フリー水ですすぎ、完全に乾燥する細い絵筆を使用して拭いてください。
10. 慎重にキャップを目で確認またはすべての残骸を確保するため明視野顕微鏡の倍率では削除されています。破片を前処理の絵筆の使用によって除去できない (RNase フリー) 罰金のピペット チップを使用して破片を削り。
11. RNA 換散バッファー (バッファー RLT から RNA 抽出キット"B"β-メルカプトエタノールを 10 μ L/mL の濃度で追加) の 230 μ L でいっぱい 0.5 mL および microfuge の管にキャップを固定します。
12. キャップ、簡潔に渦を反転し、30 分間室温でインキュベートします。
13. ドライアイスに 5 分とし、転送、および microfuge の管のためには、5,000 × g ≥ の遠心分離機します。
    注: プロトコルはここで一時停止することができます。RNA lysates は-80 ° c 少なくとも 1 週間の RNA の劣化に大きな影響を与えることがなく保存できます。RNA の隔離が同じ日に実行される場合は、抽出の準備ができるまで氷のサンプルを冷やします。
14. キシレンからスライドを削除した後に、80-90 分の推薦された最大制限時間内のすべての追加コレクションを実行します。ステータス退避済みのセクションは、周囲の湿度に公開されて、RNases 徐々 に再活性化します。収集期間を制限することで、このような効果を最小化し、RNA の整合性を最大限に維持します。

7. RNA の隔離

1. RNA の抽出の RNase フリーのワークステーションを準備します。
2. RNA 抽出キットのすべての管およびマニュアルによると試薬を準備します。
   注: 次の LCM の RNA の隔離のための多くのキットがある、RNA 抽出キット材料一覧に"B"を使用して最高の成功を収めています。RNA 抽出試薬のサイド ・ バイ ・ サイド比較のため図 5を参照してください。
3. -80 ° C のフリーザーからサンプルを削除し、37 ° C の水浴で急速に解凍します。
4. すぐに渦解凍ためチオシアン酸塩を均等に分散する 2-3 秒のサンプルです。
5. 70% のエタノールの等量と各サンプルを組み合わせます。必要に応じて、十分な RNA 濃度に到達する 2 つ以上の lysates を一緒にプールします。
6. Microdissected サンプルのために最適化されたプロトコルを使用して RNA 抽出プロセスのマニュアルを製造元の指示に従って進んでください。
7. ヌクレアーゼ フリー水 (14 μ L) の最小の推奨されるボリュームに最後のステップで RNA を溶出します。
8. RNA の隔離、次因数新しい各サンプルからの RNA の 1-2 μ L 事前品質評価・品質管理の RNase フリー チューブが付いて、バイオアナライザーなどの RNA の少量を視覚化できるマイクロ流体デバイス。因数高感度 RNA 定量キットと定量化のための別々 のチューブに追加の 1 μ L。
   1. 下流解析のための RNA の十分な量を取得、必要に応じてこれらの手順を調整 (すなわち。、プールの RNA の抽出前に LCM キャップの大きい数)。
9. ストア RNA 下流解析のための十分なサンプルを収集まで-80 ° c。

結果

RNA シーケンスの基準を満たして、LCM を使用して人間の腸サンプルから腸管神経節の比較的急速なコレクションを有効にする既存のプロトコルをいくつかの改良を行った最初に、我々 は 2 MB (図 1B) にドライアイスのスラリーの表面で置かれた大きい基本金型内の腸組織のセグメントの急速凍結を最適化されています。セクショニングおよび後続の LCM の中に最高の成功は、腸管 (1 b ・ 1 C の数字) を粘膜側に直面している、基本金型内でフラットを置くことによって得られました。基本型がベースでできるだけ平ら任意の曲率は筋間神経叢に断面積の大きなを取得する非常に難しくなることを確認します。このアプローチは、8 μ m の厚み (図 1E) で簡単に断面化し、染色のプロセスから TFM の完全な除去は、組織の結果します。TFM 染色のプロセスと干渉して従って...

ディスカッション

この手順により、RNA シーケンスの RNA を導出するソースとして多数の腸管神経節の収集の効率化ここでは、私たちが最大限に RNA の整合性を維持しながら、既存のプロトコルで概説されているプロセスを加速しました。この手順のすべてのステップは互いに、そのすべての問題は、研究の開始から排除され、すべてのサンプルが準備されていると同様に互いにできるだけ信頼性の高い RNA シーケンスを取得することが重要です。

プロシージャの発症から RNA の整合性が低下する場合研究室で処理の臓器提供の時に組織のコレクションと組織の領収書との間の時間間隔 (冷阻血時間) が長すぎる場合。この問題を考えると、我々 は高品質の RNA は、冷阻血時間の 24 時間後も腸サンプルからまだ抽出することができます驚いていた。腸のサンプルは冷蔵、コールド ストレージ ソリューションに適切に格納されている、組織の整合性と RNA の品質の最高の保護があります。腸の組織がオルガン コレクション チーム、腸の消化酵素、RNases、この期間中に RNA の品質に影響を与える可能性があります他の分子への暴露を制限するコレ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10% 中性緩衝ホルマリン	Sigma	HT501128-4L
2-メチルブタン	フィッシャー	O3551-4
3 mL シリンジ	BD	309628
50 mL コニカル チューブ、ポリプロピレン	コーニング	05-526B
ベースモールド37x24x5mm、使い捨て	電子顕微鏡科学	5025511
Belzer UW コールドストレージソリューション	Bridge to Life	N.A.
CapSure Macro LCMキャップ	Arcturus、ThermoFisher	LCM0211
Cling Wrap、Press'n シール	うれしい	N.A.
クレシルバイオレットアセテート	アクロス有機物AC405760025
まな板	電子顕微鏡科学	63308
エタノール、190プルーフ	Pharmco-AAPER	111000190
エタノール、200プルーフ	Pharmco-AAPER	111000200
ガラス顕微鏡スライドフィ		ッシャー12-550-343
グローブ、拡張カフ	Microflex
ガウン、外科用	キンバリー・クラーク	19-088-2116
トレー 20 L (大型ポリプロピレン滅菌パン)	Nalgene	1335920B
キムワイプ(大)	キンバリー・クラーク	34120
キムワイプ(小)	Kimberly-Clark	34133
レーザーキャプチャマイクロダイセクションシステム(ArcturusXT)	ThermoFisher	N.A.
ライカ クライオスタットチャック 大  40 mm	サウスイースト病理機器サービス	N.A.
光学顕微鏡	オリンパス	CX43
顕微鏡対物レンズ (20X)	オリンパスUPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17	N.A.
顕微鏡対物レンズ (10X)	Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/-	N.A.
モレキュラーシーブ	アクロス オーガニックス	AC197255000
ヌクレアーゼフリー水	アンビオン	AM9937
PicoPure RNA抽出キット	Applied Biosystems	12204-01
ペレット 乳棒	キンブル Kontes	4621973
PEN膜 LCMスライド	Arcturus, ThermoFisher	LCM022
RNaseフリーチューブ、1.5 mL	Ambion	AM12400
RNaseZAP	Sigma	Sigma-R2020
RNA 抽出キット "A" (PicoPure)	Applied Biosystems	12204-01
RNA Extraction Kit "B" (RNeasy マイクロキット)	Qiagen	74004
RNA Extraction Method "C" (TRIzol)	Invitrogen	15596-026
RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit)	Qiagen	74134
Splash Shield, disposable faceshield	Fisher	17-310
Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp"	Fine Science Tools	14002-14
シリンジフィルター、酢酸セルロース (0.2 μm)	ナルゲン	190-2520
組織凍結媒体	一般データ ヘルスケア	TFM-5
キシレン	フィッシャー	X3P1GAL