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方法論記事

コレラの植民地化と大人のゼブラフィッシュ モデルで下痢を定量化

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DOI：

10.3791/57767

⸱

2018年7月12日

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, and Biochemistry, Wayne State University School of Medicine

この記事について

サマリー

ゼブラフィッシュが自然なコレラをホストし、要約し、トランス ミッションに植民地から全体の感染サイクルを研究する使用ことができます。ここでは、植民地化レベルのコレラを評価し、下痢ゼブラフィッシュを定量化する方法を示します。

要約

コレラは、コレラの人間の病気を引き起こす病原菌として有名です。人間のホストの外のコレラ主に存在する様々 な高い水生種のやり取り、水生環境で。脊椎動物の魚環境のホスト知られているで、本質的に潜在的なコレラの貯水池です。コレラゼブラフィッシュ、通称魚類種動脈分布、水生環境で長期にわたる相互作用を示唆しているインドの亜大陸から起きる。ゼブラフィッシュは、感染症を含む生物学の多くの側面を研究するための理想的なモデル生物です。ゼブラフィッシュことができます簡単かつ迅速に植民地化されるコレラによって水の暴露後。コレラによって腸の植民地化は、下痢の生産とレプリケートされたコレラの排泄に します。これらの細菌が排泄し、新たに魚のホストを植民地化するに行きます。ここでは、コレラを評価する方法を示します-ゼブラフィッシュとコレラを定量化する方法で腸の植民地化-ゼブラフィッシュ下痢を誘発します。植民地化モデルは興味の遺伝子が環境の生存および/またはホストの植民地化の重要な可能性があるかどうかを研究している研究者に役立つはずです。ゼブラフィッシュ下痢の定量化は、モデルとしてのゼブラフィッシュを探究することに興味を持っているすべての腸内の病原体を勉強して研究者に役立つはずです。

概要

コレラは、散発的な下痢1,2と同様、人間の病気のコレラを引き起こす水生、グラム陰性細菌です。コレラは、しばしば他の水生生物に関連付けられている、世界中の多くの地域で環境にあります。プランクトン、昆虫の卵塊、貝、および脊椎動物の魚の種3,4,5,6、7これらの関連付けられた生物が含まれます。いくつかの研究はコレラの異なる地理的領域7,8,9,10魚の腸管から分離しています。魚のコレラの存在は、魚環境の貯水池として機能するかもしれないことを示します。魚は人間に病気を送信およびコレラ菌6の地理的な広がりにも関与する可能性が。

理解どのように魚と対話するコレラ、動脈分布としてよりもっとよく知られているゼブラフィッシュはコレラ対e11を研究するためのモデル システムとして開発されました。ゼブラフィッシュ、コレラの初期貯留層と考えられているベンガル湾の地域を含む南アジアにネイティブです。1817 年に最初コレラ大流行開始、する前にコレラはインドとバングラデシュは今外報告されていなかった。したがって、ゼブラフィッシュとコレラほぼ確実に関連付けられてお互い進化的時間スケールでそのゼブラフィッシュが自然環境12内のコレラのホストを示唆しています。

コレラのゼブラフィッシュ モデルが実行するシンプルで全体の病原性を研究するためのコレラのライフ サイクル。魚は、コレラの知られている数に接種されている水で入浴でコレラにさらされています。数時間以内腸の植民地化は下痢の生産に続いて、起こる。下痢は、粘液、蛋白質、排泄の細菌や他の腸の内容で構成されています。下痢の程度は、いくつかの簡単な測定13を用いて定量化することができます。コレラ感染魚が排泄されていることができますを行く素朴な魚に感染する感染のサイクルを完了します。したがって、ゼブラフィッシュ モデルはコレラ人間の病気プロセス12,14を繰り返します。

コレラ最も頻繁に使用される動物モデル マウスおよびウサギ14,15,16,17,18されてきました。これらのモデルは、コレラ発症の私達の知識に追加するのに尽力されています。ただし、自然のコレラはマウスおよびウサギのためのホストのコレラのライフ サイクルのどのような側面を学ぶことができますに制限があります。マウスおよびウサギのコレラ菌は通常、腸内細菌叢、腸内細菌叢を損傷するために抗生物質を用いる前処理の不在を必要とします。両方のモデルでは、消化管に細菌を導入する強制経口投与または直接腸に細菌を注入する手術操作のいずれかを必要があります。ゼブラフィッシュそのまま腸内細菌叢と成魚はすぐに植民地化および伝染のプロセスは、必要な操作をすることがなく、自然に起こりますという点で利点があります。

現在の仕事は、コレラ感染のモデルとしてのゼブラフィッシュの使用率を示しています。感染症、解離、植民地化のコレラの列挙およびコレラによる下痢の定量化説明12,13になります。このモデルは、コレラ病プロセスとコレラ環境生活の両方に興味がある科学者に有用である可能性が高いです。

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プロトコル

ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ウェイン州立大学によって承認されています。このメソッドは最初に Runftらの説明12

1. 腸の植民地化のレベルの決定

注: 相対フィットネス系統のコレラまたは突然変異や遺伝子のノックアウトの効果を比較する使用できるように、腸の植民地化はゼブラフィッシュ モデルで最も有用な指標です。

  1. 浸漬によるゼブラフィッシュの接種
    注: 露出のつまり感染症の自然経過と似ています。
    1. コレラの準備
      1. ホストゲノム スープ (LB)、分離のコレラとの 5 mL を接種する LB から植民地板し、6-8 時間 (夜間文化) 37 ° C (180 rpm) を揺れインキュベートします。
      2. 上記の宿泊文化の 50 μ L で 250 mL の三角フラスコに新鮮なオートクレーブ LB 培地の 25 mL を接種します。それは揺れ (150 rpm) で 37 ° C で 16-18 時間孵化させなさい。
      3. 600 の光学濃度を読む 1 mL あたりの菌数を推定するため一晩文化の 1/10 希釈の nm (外径600) (外径600 = 1 は 10 〜9 CFU/mL)。
      4. ピペットでメディア 6,000 g で 10 分間削除での遠心分離によって細胞を収穫したり消毒液にオフそれを注ぐ。目的の濃度は、通常の 1 x 107 1 x 10 の10 ml の PBS あたり間滅菌 PBS で細胞を再懸濁します。
        注: ここでは、我々 はオートクレーブ逆浸透水滅菌感染水として 60 mg/L 海塩を含むを参照してください。
    2. 接種と培養
      1. 滅菌感染水 200 ミリリットルを含む 400 mL ビーカーに 4 つまたは 5 つのゼブラフィッシュを配置します。
      2. 感染水の 200 mL の目的感染濃度 (通常 5 × 104 5 x 107 CFU/mL) を取得する (ステップ 1.1.1.4) からのコレラの 1 mL を追加します。
      3. ジャンプから魚を防ぐために穴あきふた付きビーカーをカバーします。200 μ L チップ ボックスの上部はこのためにうまく動作します。
      4. 各ビーカーにラベルを付けるし、実験の期間の 28 ° C で設定前面ガラスの定温器に配置します。
    3. 一時的な露出のための手順
      注: 接種した細菌の除去が続くコレラ(通常 6 h) に一時的な露出は伝送を勉強し、排泄細菌のより正確な定量化するのに役立ちます。
      1. 露出の 6 h 後魚を収集するために網タイツをビーカーの水を注ぐ。コレラを殺すために漂白剤の容器には、感染した水を破棄します。
      2. 滅菌感染水の 200 mL のビーカーに削除された魚を配置します。魚魚から表面の細菌を除去するために 5 分でこのきれいな水で泳ぐことができます。
      3. Net 手順 (ステップ 1.2.2) を繰り返し、新しい滅菌感染水を 200 mL ビーカーに魚を置きます。このビーカーで実験の期間の魚を保ちます。
  2. 安楽死
    1. 実験が目的のエンドポイントに達したら、感染のサンプル水を取る (15 mL は通常十分な) 排泄の細菌数と下痢 (ムチン アッセイ、たんぱく、OD など) の計測を可能にする場合に必要な (セクション 2)。
    2. (魚を集める) に網目を通して水の残りを注ぎ、コレラ水を殺すために漂白剤。
    3. 感染水に加えて 336 μ g/mL のエチル 3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸 (tricaine) を含むビーカーに魚を置き、室温に 20 分間この tricaine ソリューションで魚を孵化させなさい
      注: フィッシュ ネット 10% の漂白剤溶液で殺菌されました。
  3. 郭清
    1. 魚の準備
      1. 使い捨てのプラスチック スプーンで tricaine ソリューションから魚をすくうし、解離性の表面の上に置きます。
      2. 位置の腹側を上向きに、ピンで魚体の中心から離れて角度ピンの鈍端と下顎を介して。別のピン配置も体から離れて角度、肛門にちょうど後部。
    2. 腸管の露出
      1. 綿棒 - リントフリーで魚の腹側表面は、70% エタノールに浸漬。
      2. 70% エタノールに浸漬して、それらを炎のメスと Vannas のはさみを滅菌します。
      3. スケールを貫通し、メスを使用して皮膚のすぐ下の腹で縦の小切開を作る。腸管は皮膚のすぐ下に位置する、あまりにも深く切らないように注意してください。
      4. はさみを使って、皮膚レベルよりも深い切断の肛門を回避、体の長さに沿って慎重に切開を拡張します。
      5. 切開の開くことを許可する魚の頭に向かってハサミで 2 つの水平カットを作る。
      6. 体から、ピンを釣り、解離性表面に横切開の各側に皮膚をピンします。
        注意: ピンの先端が以前アルコールとそれらを燃やすことによって殺菌します。
    3. 腸管の除去
      注: 腸管が他の臓器の上に薄い、非常に薄いチューブとして表示されます。
      1. 鉗子を火炎滅菌するし、全体の腸管の長さ (通常 12-15 mm) を削除するそれらを使用します。ガラスビーズ (手順 1.4.1–1.4.2 を参照) および PBS または氷の上のポンド x 1 の 1 mL を含む均質化管に腸管を配置します。
  4. 均質化
    1. 均質化管の事前準備 1 mm ガラスビーズの注ぐ ~1.5 g で 2 mL にスクリュー キャップ チューブ (それらの約半分の方法を記入) し、オートクレーブに入れることによってそれらを殺菌しなさい。
    2. 1 mL 滅菌ポンドまたは 1x PBS を追加します。
    3. ゼブラフィッシュ腸にされている追加 (手順を 1.3.3.1 詳細ページ)、チューブ、スクリュー キャップ、非常にしっかりと、渦ホモジナイザーでチューブを固定します。
    4. 最大の設定で 1 分のサンプルを均質化し、クールで 1-2 分間氷の上にサイクルを繰り返すこの均質化もう一度完全な均質化のため。
      注意: 均質化のためのいくつかの代替方法も稼働します。
  5. 腸の植民地化のレベルを定量化
    1. 磨砕液の連続希釈の管 (小さなガラス試験管や 1.5 mL 容マイクロ チューブ) を準備するには、各管に LB または 1x PBS の 900 μ L を追加します。それぞれの魚の 5-6 管を準備し、最初の管の磨砕液 100 μ L を追加することによって腸の磨砕液の 10 倍のシリアル希薄を作るボルテックス ミックス、および最初のチューブから 2 番目の管に 100 μ L を追加します。
    2. この手順を繰り返してすべての希釈液が用意されています。
    3. 各希釈ストレプトマイシン (ストレプトマイシン耐性菌の場合) の 100 μ g/mL と X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) の 40 μ G/ml を含む LB 寒天培地プレート上の 100-200 μ L をプレートします。16-18 h 30 ° C でプレートを孵化させなさい。
    4. 一晩インキュベートした後カウント; 植民地のカウントを手動でまたは自動コロニー カウンターを使用して、プレートのコロニーのコレラマーカー先端で数えられたコロニーをマークすることをお勧めします。
    5. メッキ量を考慮して、懸濁液の希釈倍率のプレート数を乗じて魚腸あたり CFU を決定します。

2. 魚下痢の測定

注: 4 つの異なる評価指標を用いて魚下痢を評価する: 水、水、水13で、水と、コレラCFU の OD600の全体的な排泄タンパク質レベルで粘液のレベル。下痢は通常視覚的に明白になるコレラ前述のように、ゼブラフィッシュの暴露後約 6 時間。

  1. 粘液のレベルを決定します。
    注: 粘液分泌のコレラ植民地時代は誘導され、感染13の特に早い段階での排泄レベルの良い指標です。ムチン アッセイ マイクロタイター過ヨウ素酸シッフ アッセイ19のバリエーションであります。
    1. 以下の資料を準備: 50% (w/v) 周期酸原液と 0.1% 水溶液作業の周期 (7% 酢酸 5 mL に添加 50% 過ヨウ素酸株式の 10 μ L-後すぐに使用)、ムチン基準、96 ウェル マイクロ プレート、シフ試薬です。
      1. ナトリウム酢酸緩衝液 (100 mM ナトリウム 5.5 氷酢酸と酢酸、5 ミリメートルの EDTA、pH) に次 (ブタの胃型 III) から粘液量を中断することにより粘液の基準を準備: 400 μ g/mL、300 μ g/mL、200 μ g/mL、150 μ g/mL、100 μ g/mL、75 μ g/mL、50 μ g/mL、25 μ g/mL、10 μ g/mL。
        板を準備するには、次のように試金で使用される各ウェルに水感染の 100 μ L を追加することによって: 空白の 1x PBS。前述のように、ムチン基準や魚の感染症からの水のサンプル。3 通の各サンプルを行います。
    2. 上下に数回ピペッティングで混ぜるし、それぞれよくマルチ チャンネル ピペットに新鮮な 0.1% 周期酸の 50 μ L を追加します。
    3. プレートをしっかりとラップで包み、1-1.5 h の 37 ° C でそれを孵化させなさい。
    4. 各井戸と上下にそれをミックスするピペットにフクシン溶液 (シフの試薬) の 5-10 分を追加 100 μ L の室温までプレートを冷やします。
    5. プレートをラップで包み、インキュベートそれロッキング プラットフォームで室温まで色を開発してきました。色は 560 で吸光度を読み 20 分以内一般に開発される nm プレート リーダーを使用しています。
    6. ムチン標準曲線 (外径560対μ G/ml ムチン標準) をプロットします。各未知の外径560が標準曲線に該当の識別とその値に対応するムチン濃度未知のムチン レベルが決定します。
  2. タンパク質レベルを決定します。
    注: 別にムチン、タンパク質レベルで水の全体的な魚によって生成される下痢 (曇り、液体便) のレベルの別のプロキシです。この手順では、標準のブラッドフォードの試金を使用して蛋白質のレベルを推定します。タンパク質レベルは、ウシ血清アルブミン (BSA) の標準曲線に基づいて推定されます。
    1. ミックス (下のメモを参照) BSA の標準の 1 つの 100 μ L または 100 μ L 水感染症 (感染した魚を含んでいるビーカーから水) のブラッドフォードの 900 μ L で使い捨てのキュベットの試金の試薬 (ピアス蛋白質の試金の試薬はこのためにうまく動作します)。すべてのサンプルを 2 分間室温で孵化させなさい。
      注: 次の BSA の標準は使用された: 1,800 μ g/mL、1,000 μ g/mL、750 μ g/mL、500 μ g/mL、250 μ g/mL、125 μ g/mL、50 μ g/mL、25 μ g/mL。BSA の標準は、オートクレーブの蒸留水で希釈されました。
    2. 各標準の OD660を読んだり、サンプルの分光光度計を使用してください。
    3. BSA の標準曲線 (660対OD μ g/mL) をプロットします。各未知の OD660が BSA の標準曲線に落ちるし、その値に対応するムチン濃度を読んで識別することによって未知の蛋白質のレベルを決定します。
  3. メジャーの OD600
    注: いくつか h と OD600の簡易定量法は、これを定量化する使用ことができます後、下痢 (曇り、液体便) の存在は目に見えて明らか。
    1. 内容を均等に数回感染水を含むチューブを反転します。使い捨てのキュベットに水サンプルの 1 ミリリットルを追加します。陰性対照として滅菌感染水 1 mL を使用します。
    2. 600 で分光光度計を使用して「空白」の測定を行い陰性対照サンプルを使用して nm。600 nm でのレコードごとの水のサンプルを読んで結果。
  4. 定量感染後のコレラCFU/mL の排泄
    注: ゼブラフィッシュによって生成される下痢の主要成分は排泄のコレラ。CFU/mL の定量は、伝送実験の伝染性の線量の測定と魚の腸管内細菌の複製の推定などの目的で使用できます。このメジャーは最高、一過性感染が行われたときに行われます。感染症は 24 h を使用すると、この試金は複合菌に加えて、排泄のコレラ測ります。
    1. 目的の時点で水サンプルを取るし、連続希釈して前述のよう。
    2. 選択培地 (DCL または別の適切な抗生物質ストレプトマイシンを含む LB 寒天培地) のシリアル希薄をプレートし、30 ° C 24 時間でそれらを孵化させなさい。
    3. コロニーをカウントします。手順 1.5 mL の水当たり CFU を計算します。

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結果

ゼブラフィッシュ腸管のコレラ菌

遵守する典型的な植民地化のレベルの例を提供するために 5 × 106エル Torのコレラパンデミック N16961 いくつかのゼブラフィッシュを含むビーカーの水の 200 ml の CFU を接種しました。感染症の 6 h 後魚は新鮮な水で洗浄されプロトコルで説明されているようにオートクレーブ感染水の 200 mL のビーカーに転送。18 h 転送 (または一次感染後 24 h) 後魚を安楽死させ、腸の植民地化のレベルを決定するのに運ばれました。約 10 魚腸あたりのセルのコレラ106 5通常、5 x 106接種量と腸管 24 h 後感染 (hpi) (図 1) で観察されました。

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ディスカッション

ゼブラフィッシュのコレラ研究の比較的新しいモデルですが、将来コレラ生物学および病因11,12,13の未知の側面の発見を多くの約束を保持しています。.アダルト ゼブラフィッシュ モデルに両方自然であることの利点は、そのままに、成熟した腸内細菌叢と環境モデルを含むホストのコレラ。モデルの欠点は、2 つの主要な人間の病原因子、コレラ毒素と毒素 coregulated 毛、ゼブラフィッシュ植民地や病因12必要ないことです。しかし、この見なすことができるまたは小説のコレラ菌の同定を有効にすることができるもう一つの利点として要因および他のコレラ毒素の研究を容易にします。これは特に非-O1/O139「環境」の大半に関連するコレラ菌、ほとんどない農産物コレラ毒素毒素 coregulated 毛かし、まだ病気

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

おかげでメロディー ニーリー, ジョンアレン、バーゼルの Abuaita とドナ Runft ゼブラフィッシュ モデルの開発を助けることに彼らの努力のため。ここで報告された研究は、国立研究所のアレルギーと感染症 [受賞番号 R21AI095520 と R01AI127390 (ジェフリー ・ h. Withey) に健康の国民の協会によって支えられました。内容は著者の責任と国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Instrument
シェーカーインキュベーターニューブランズウィックサイエンティフィック、エジソン、ニュージャージー州エクセラE25
インキュベーターNUAIRE、プリマス、ミネソタ州自動フロー
分光光度計サーモ、ウォルサム、マサチューセッツ州Geaesys 6
テックスホモジナイザーMinibeadbeater24112011
計量機ハウス、コロンビア、MDAdventurer Pro
ヒートスターラーコーニング、コーニング、NYPC-420D
バーナー
自動コロニーカウンターREVSCI120417B
Materials
400mlガラスビーカーパイレックス
穴あき蓋チップボックス
使い捨てプラスチックスプーンオフィスデポ、ボカラトン、フロリダ州D15-25-7008
フィッシュタンクシステムアクアニアリング、サンディエゴ、CA
RO 浄水器アクアFXTK001
フィッシュネットマリーナ
フィッシュフードテトラフィン
ブラインシュリンプレッドジャングルブランドOSIプロ80
発泡スチロールボード
ピン
メスファインサイエンティフィックツール、フォスターシティ、カリフォルニア州10000-10
鉗子ファインサイエンティフィックツール、フォスターシティ、カリフォルニア州11223-20
バンナスはさみファインサイエンティフィックツール、フォスターシティ、CA15000-11
2 mlスクリューキャップチューブフィッシャーサイエンティフィック、ハンプトン、ニューハンプシャー州02-681-375
1 mmガラスビーズバイオスペック11079110
広がるためのガラスビーズシグマ、セントルイス、ミズーリ州18406-500G
ペトリプレートフィッシャーブランド、ハンプトン、ニューハンプシャー州 FB0875713
1.5 ml遠心分離管Midsci、ミズーリ州バレーパークAVSS1700
50 ml 遠心分離管コーニング ファルコン、コーニング、ニューヨーク352098
試験管パイレックス9820
ガラス ピペットフィッシャー ブランド、ハンプトン、ニューハンプシャー州13675K
マイクロピペットザルトリウス バイオヒット、Göttingen、ドイツm1000 / m200 / m20
ジェネシーサイエンティフィック、サンディエゴ、CA24-150RS / 24-412
Chemicals
インスタントオーシャンソルトリン酸
緩衝生理食塩水VWRライフサイエンス、ラドナー、PAK813-500ml
トリカイン(エチル3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸)塩シグマ、セントルイス、ミズーリ州A5040
5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-&β;-D-ガラクトピラノシドシグマ、セントルイス、ミズーリ10651745001
シフ'試薬Sigma, St. Louis, MO84655-250 mL
過ヨウ素酸Fisher Scientific, Hampton, NH10450-60-9
豚の胃からのムチンSigma, St. Louis, MOM2378-100G
ウシ血清アルブミンFisher Scientific, Hampton, NH9046-46-8
Pierce 660nm Protein Assay ReagentThermo, Waltham, MA22660
LB medium
TryptonBD Biosciences、カリフォルニア州サンノゼ211705
Teast ExtractBD Biosciences、サンノゼ、CA212750
NACLFisher Scientific、ハンプトン、ニューハンプシャー州BP358-212
寒天BD Biosciences、サンノゼ、CA214010
TCBS 寒天BD Biosciences、サンノゼ、CA265020
DCLS寒天シグマ、セントルイス、ミズーリ70135-500gm
Software>
Microsoftオフィス
プリズム5
ボルオーの穴付きマイクロチップホルダーのヒント州州

参考文献

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