魚類に下垂体細胞の電気生理学的調査のための健康的な脳下垂体スライス

サマリー

続いて硬骨魚メダカ (メダカ) を使用して実行可能な脳下垂体組織スライスを作るとパッチ ・ クランプの技術を用いた下垂体細胞の電気生理学的記録のために、最適化されたプロトコルを説明、穴あきのパッチ構成。

要約

下垂体細胞の電気生理学的調査は、多くの脊椎動物でも魚類に非常にいくつか行われています。これらのうち、過半数は解離の主細胞で行われています。どの硬骨魚の下垂体細胞の私達の理解を改善より生物学的関連性の高い環境での動作は、このプロトコルは、小さな淡水魚メダカ (メダカ) を使用して実行可能な脳下垂体スライスを準備する方法を示します。値 25 に 28 ° C で住んでいる淡水魚の体液の pH および浸透圧のすべてのソリューションの脳下垂体スライスを作り、調整されました。次のスライス標本は、プロトコルは、穴あき細胞パッチク ランプ法を用いた電気生理学的録音を実施する方法を示します。パッチ ・ クランプの技術は、前例のない時間分解能と感度、単一イオン チャネルにそのまま全体のセルからの電気的特性の調査を許可する強力なツールです。それはそのままパッチ ピペット電極溶液で希釈されてから細胞質の規制要素を防止する細胞内の環境を保つユニーク穿孔パッチです。対照的に、伝統的な全細胞記録を実行すると、めだかの下垂体細胞が迅速に活動電位を発生させる能力を失うことが観察されました。様々 な穿孔技術を利用可能な中でこのプロトコルは殺菌剤のアムホテリシン b. を使用してパッチを適用した膜の穿孔を実現する方法を示します

概要

下垂体は視床下部の下に位置し、視交叉の後方、脊椎動物の主要内分泌器官です。生成され、特定の細胞型から 6 ~ 8 ホルモンを分泌します。下垂体ホルモン脳と末梢器官との間の中間体を構成し、成長、生殖、恒常性の調節など重要な生理学的なプロセスの広い範囲をドライブします。神経細胞、下垂体の内分泌細胞と同様、自発的に活動電位を発生させる能力を持つ電気的興奮性¹。これらの活動電位の役割は、細胞依存性です。哺乳類の下垂体のいくつかのセルの種類、活動電位を昇格できます、細胞内 Ca^{2 +}ホルモン²の持続的なリリースを十分に。また、下垂体は、脳細胞の^3,4,5,6の膜電位に影響を与えるから促進と抑制の両方の情報を受け取ります。通常、刺激入力興奮性を増加、しばしば細胞内ストアからの Ca^{2 +}の放出を含むと同様発射周波数⁷増加します。どのようにセルがイオン チャネル構成を利用し、脳からこれらの入力信号に適応を理解理解ホルモンの合成と放出の鍵です。

パッチ ....

プロトコル

生命科学研究科の承認された調査官の監督の下でケアとノルウェーの大学での研究の動物の福祉のための推奨事項に従ってすべて動物取扱を行った。

1. 機器およびソリューションの準備

注: すべてのソリューションは、無菌でなければなりません。細心の注意は、pH と慎重に学びの種の細胞外の環境に適応する必要がありますすべてのソリューションの浸透圧 (osmol/kg 水) に与えべき。pH および浸透圧はそれぞれ pH メーターと凝固点 osmometer など精密電子機器で調整する必要があります。

1. なし Ca^{2 +}の細胞外液の 500 ml ペットボトル (Ca^{2 +}無料 EC): 150 mM の NaCl、KCl、1.3 mM MgCl₂, 5 mM 4 mM グルコース、10 mM Hepes。
   1. 4.38 g nacl、KCl、186.37 mg の MgCl₂グルコースと 450 mL の超純水に HEPES 1.19 g 360.32 mg の 61.89 mg を溶解 (0.055 米国/25 ° C での cm、18.2 m ω の抵抗率) H₂O 磁気攪拌機を使用してガラス ビーカーに。
   2. 7.75 NaOH で....

結果

このプロトコルはターゲット細胞の (Lh 生産アクチビン) めだか形質転換線 [Tg (1塩基変異hrGfpII)] を使用して、下垂体 (gonadotrope) セルから信頼性の高い記録を達成する方法のステップ バイ ステップ プロトコルを示します緑色蛍光タンパク質 (GFP) が付いています。

当初は、全細胞の構成を使用して電気生理学的調査を行った。しかし、任意調査細胞ので自発的な活動電位は見られなかった。セルのサブセットで-50 と-60 mV (図 6) の間の静止電位から小さな現在注射 (5-9 pA) を使用して活動電位をトリガー可能性があります。これらの活動電位が高速ランダウンと誘発電位が可能であったもはや約 4-6 分後。観測された特に高速ランダウンは、小さいセルのサイズによって説明されるかもしれない。一般に、下垂体細胞、ニューロン

ディスカッション

脳下垂体スライスのパッチ ・ クランプの技術を使用して電気生理学的記録は、慎重に最適化を必要とします。特に硬骨魚類における生細胞調査のためよく最適化されたプロトコルは哺乳類システムに基づくプロトコルを使用して、文書の大半と限られます。この点で、それは重要な pH および浸透圧のようないくつかの生理学的パラメーターの事実を知っている種だけでなく扶養家族、しかしまた非常に土地や水の問題の生物が住んでいるかどうかに依存します。魚、海洋または淡水環境で暮らす場合にも、考慮に入れる、必要です。たとえば、CO₂分圧は魚まで 1.7-3.4 mmHg pCO₂魚と哺乳類の³⁶の 40-46 mmHg pCO₂哺乳類に比べてはるかに低い。これに基づいて、我々 は 7.75 · ^37,·^{38,39,4.......}

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ビブラトーム	ライカ	VT1000 S
Chirurgical glue	WPI	VETBOND	3M Vetbond ティッシュ接着剤
ステンレス製ブレード	カムデンインスツルメンツ	752-1-SS
金型	さくら	4122
スチールハープ	ワーナーインスツルメンツ	64-1417
PBS	シグマ	D8537
超高純度LMPアガロース	invitrogen	166520-100
パッチピペット	サッター機器	BF150-110-10HP	フィラメント付きホウケイ酸 O.D.:1.5 mm, I.D.:1.10 mm
顕微鏡 Slicescope Scientifica		pro6000
P-Clamp10	Molecular Devices	#1-2500-0180	ソフトウェア
デジタイザー Digidata 1550A1	Molecular Devices	DD1550
Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7B	Molecular Devices	1-CV-7B
GnRH	Bachem	4108604	H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH トリフルオロ酢酸塩
ピペットプーラー	Sutter Instrument	P-1000
amphotericin B	SIGMA	A9528	細孔形成抗生物質
ポリエチレン	SIGMA	P3143	50% PEI solution
microfiler syringe	WPI	MF28/g67-5
ガラス 寒天ブリッジ用	サッター機器	BF200-116-15	ホウケイ酸フィラメント付き O.D.:2.0 mm, I.D.:1.16 mm Fire polished
Micro-Manager software			Open Source Microscopy Software
optiMOS sCMOS camera	Qimaging	01-OPTIMOS-R-M-16-C
超音波処理器	エルマ	D-7700シンゲン
NaCl	SiGMA	S3014
KCl	SiGMA	P9541
MgCl<サブ>2	>SiGMA	M8266
D-グルコース	SiGMA	G5400
プ	スSiGMA	H4034
CaCl2	SiGMA	C8106
ショ糖	SiGMA	84097
D-マンニトール	SiGMA	63565
MES酸		SIGMA M0895
BSA	SIGMA	A2153

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