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方法論記事

魚類に下垂体細胞の電気生理学的調査のための健康的な脳下垂体スライス

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DOI：

10.3791/57790

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2018年8月16日

 ,  , 
1Department of Basic Sciences and Aquatic Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

続いて硬骨魚メダカ (メダカ) を使用して実行可能な脳下垂体組織スライスを作るとパッチ ・ クランプの技術を用いた下垂体細胞の電気生理学的記録のために、最適化されたプロトコルを説明、穴あきのパッチ構成。

要約

下垂体細胞の電気生理学的調査は、多くの脊椎動物でも魚類に非常にいくつか行われています。これらのうち、過半数は解離の主細胞で行われています。どの硬骨魚の下垂体細胞の私達の理解を改善より生物学的関連性の高い環境での動作は、このプロトコルは、小さな淡水魚メダカ (メダカ) を使用して実行可能な脳下垂体スライスを準備する方法を示します。値 25 に 28 ° C で住んでいる淡水魚の体液の pH および浸透圧のすべてのソリューションの脳下垂体スライスを作り、調整されました。次のスライス標本は、プロトコルは、穴あき細胞パッチク ランプ法を用いた電気生理学的録音を実施する方法を示します。パッチ ・ クランプの技術は、前例のない時間分解能と感度、単一イオン チャネルにそのまま全体のセルからの電気的特性の調査を許可する強力なツールです。それはそのままパッチ ピペット電極溶液で希釈されてから細胞質の規制要素を防止する細胞内の環境を保つユニーク穿孔パッチです。対照的に、伝統的な全細胞記録を実行すると、めだかの下垂体細胞が迅速に活動電位を発生させる能力を失うことが観察されました。様々 な穿孔技術を利用可能な中でこのプロトコルは殺菌剤のアムホテリシン b. を使用してパッチを適用した膜の穿孔を実現する方法を示します

概要

下垂体は視床下部の下に位置し、視交叉の後方、脊椎動物の主要内分泌器官です。生成され、特定の細胞型から 6 ~ 8 ホルモンを分泌します。下垂体ホルモン脳と末梢器官との間の中間体を構成し、成長、生殖、恒常性の調節など重要な生理学的なプロセスの広い範囲をドライブします。神経細胞、下垂体の内分泌細胞と同様、自発的に活動電位を発生させる能力を持つ電気的興奮性1。これらの活動電位の役割は、細胞依存性です。哺乳類の下垂体のいくつかのセルの種類、活動電位を昇格できます、細胞内 Ca2 +ホルモン2の持続的なリリースを十分に。また、下垂体は、脳細胞の3,4,5,6の膜電位に影響を与えるから促進と抑制の両方の情報を受け取ります。通常、刺激入力興奮性を増加、しばしば細胞内ストアからの Ca2 +の放出を含むと同様発射周波数7増加します。どのようにセルがイオン チャネル構成を利用し、脳からこれらの入力信号に適応を理解理解ホルモンの合成と放出の鍵です。

パッチ ・ クランプの技術により開発され 1970 年代後半ザックマンと Neher 8,9,10 、 11・ ハミル、さらに向上でき、細胞の電気生理学的特性の調査下の単一イオン チャネル。また、電流と電圧の両方の研究の手法を使用できます。今日、パッチ クランプは、細胞の電気生理学的特性の測定のゴールド スタンダードです。タイトなシールのパッチ ・ クランプの技術の 4 つの主要な構成はずっと先進11;セル付、インサイド アウト、外アウト、全細胞のパッチ。3 つの最初の構成は通常、単一イオン チャネルの調査のため使用されます。次のセル接続構成では、4 番目の細胞膜の穴は、減圧を使用して行われます。この構成には、 12セル全体のイオン チャネル構成の調査もできます。しかし、この手法の 1 つの制限は細胞質分子希釈パッチ ピペット ソリューション13 (図 1A)、研究の細胞の電気的および生理学的反応に影響を与えることです。確かに、信号の伝達や異なったイオン チャネルの規制重要な役割を再生可能性がありますそれらの分子のいくつか。これを避けるには、リンダウとフェルナンデス14パッチ ピペットに細孔形成化合物を追加する位置方法を開発しました。セル接続構成では、次の化合物はパッチの下の膜に組み込む、ゆっくりと細胞質 (図 1B) と電気的接触を作成する膜を穿孔します。ナイスタチン15とアムホテリシン B 16などいくつかの異なる抗真菌薬または界面活性剤サポニン β エスシン17,18などを使用できます。これらの化合物は一価の陽イオンと Cl-高分子と Ca2 + 15のようなより大きいイオンのゾル性細胞質のレベルを維持しながら細胞質とパッチ ピペットの拡散を許可するのに十分な大きさの毛穴を作成します。 16。

穴あきのパッチを使用しての課題は、潜在的に高い直列抵抗です。直列抵抗 (Rs) またはアクセス抵抗合成抵抗を地面に関連してパッチ ピペット上です。パッチ ・ クランプ記録中に膜の抵抗と並列に Rsになります (Rm)。Rmと Rs電圧ディバイダーとして並列処理で。高 Rs Rsの録音にエラーを与える倒れる電圧。エラーは記録された大きな電流と大きくなります。さらに、電圧ディバイダーはまた周波数依存の時間分解能に影響を与える低域通過フィルターの作成です。事実上、穿孔パッチできないがあります常に大きい高速な電流の録音 (詳細な測定値は、参照19を参照) ために、電圧ゲートの Na+電流のような。また、Rsは、パッチ ・ クランプ記録、記録された電流の変化に再びリード中に異なる場合があります。したがって、偽陽性は、Rsが薬剤の適用時に変更の状況で発生します。

スライスした組織に電気生理学は20の脳における神経細胞の電気生理学的特性を研究するアンデルセン研究室で初めて導入されました。技術よりそのままの環境で細胞間コミュニケーションとセル回路と同様に、単一のセルの詳細な調査のための道を開いた。下垂体のスライスを作るため同様の手法は、Guérineauらによって 1998 年に導入されました。21します。 しかし、それはなかった 2005 年前に、その脳下垂体スライス標本が魚類22のパッチ ・ クランプ学正常に使用されました。本研究で著者らはまた穿孔パッチ ・ クランプ記録の使用を報告しました。しかし、はるかに、下垂体細胞の電気生理学的調査のほとんどで行われている、哺乳類、魚類1,2,22,23 を含む他の脊椎動物のほんの一握り.真骨魚類、一次解離細胞24,25,26,27,28,29,30 ほぼすべての研究を行った.

本論文ではモデルのメダカから健康な脳下垂体スライスの準備のための最適化されたプロトコルの概要を説明します。アプローチは、一次解離細胞培養に比べていくつかの利点を表します。まず、細胞が解離細胞の培養条件と比較して比較的保存状態の良い環境で記録されます。第二に、スライス標本は解離細胞の培養条件で不可能である細胞間コミュニケーション22を介した間接的な経路を研究することを許可します。さらに、孔形成剤としてアムホテリシン B と穴あき細胞パッチ ・ クランプの技術を使用して得られた組織スライスの電気生理学的記録を行う方法を示します。

メダカは小さな淡水魚の原産アジア、主に日本で発見です。それは多くの実験室で一般的に使用される研究モデルや生理学、発生学、メダカの遺伝学は広く以上 100 年31、検討されています。この紙に特に重要なの魚類に視床下部-下垂体複合体の個別の形態学的組織: 哺乳類や鳥類に視床下部ニューロン解放の神経ホルモンの下垂体の内分泌細胞を調節するのに対し正中隆起のポータル ・ システムに硬骨魚32で下垂体の内分泌細胞に視床下部ニューロンの直接神経投射があります。したがって、魚、特にどのように下垂体細胞とよく保存された脳下垂体ネットワークの下垂体細胞の電気生理学的特性を調査することで特に重要なは、慎重に行った脳下垂体スライス興奮性を制御し、それによって Ca2 +恒常性。

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プロトコル

生命科学研究科の承認された調査官の監督の下でケアとノルウェーの大学での研究の動物の福祉のための推奨事項に従ってすべて動物取扱を行った。

1. 機器およびソリューションの準備

注: すべてのソリューションは、無菌でなければなりません。細心の注意は、pH と慎重に学びの種の細胞外の環境に適応する必要がありますすべてのソリューションの浸透圧 (osmol/kg 水) に与えべき。pH および浸透圧はそれぞれ pH メーターと凝固点 osmometer など精密電子機器で調整する必要があります。

  1. なし Ca2 +の細胞外液の 500 ml ペットボトル (Ca2 +無料 EC): 150 mM の NaCl、KCl、1.3 mM MgCl2, 5 mM 4 mM グルコース、10 mM Hepes。
    1. 4.38 g nacl、KCl、186.37 mg の MgCl2グルコースと 450 mL の超純水に HEPES 1.19 g 360.32 mg の 61.89 mg を溶解 (0.055 米国/25 ° C での cm、18.2 m ω の抵抗率) H2O 磁気攪拌機を使用してガラス ビーカーに。
    2. 7.75 NaOH で pH を調整します。
    3. 500 mL のメスフラスコにソリューションを転送します。500 mL まで超純水 H2O、メスフラスコを入力します。
    4. よく、浸透圧を測定する前にソリューションをミックスします。マンニトールと 290 – 300 mOsm に調整されます。フィルター滅菌水真空システムと 0.2 μ m フィルターを用いたソリューションです。
  2. 細胞外液 (EC) の 500 ml ペットボトル: 150 mM の NaCl、KCl、2 mM CaCl2, 5 mM 1.3 mM MgCl2、4 mM グルコース、10 mM Hepes。
    1. NaCl の 4.38 g、KCl の 186.37 mg、147.01 CaCl2mg、61.89 MgCl2mg、360.32 mg のブドウ糖の超純水 H2O の磁気攪拌機を使用してガラス ビーカーの 450 mL に HEPES の 1.19 g を溶かします。
    2. 7.75 NaOH で pH を調整します。
    3. 500 mL のメスフラスコにソリューションを転送します。500 mL まで超純水 H2O、メスフラスコを入力します。
    4. よく、浸透圧を測定する前にソリューションをミックスします。マンニトールと 290 – 300 mOsm に調整されます。フィルター滅菌水真空システムと 0.2 μ m フィルターを用いたソリューションです。
  3. 0.1% ウシ血清アルブミン (BSA を用いた EC) と細胞外液の 500 ml ペットボトル: 150 mM の NaCl、KCl、2 mM CaCl2, 5 mM 1.3 mM MgCl2、4 mM グルコース、10 mM Hepes。
    1. NaCl の 4.38 g、KCl の 186.37 mg、147.01 CaCl2mg、61.89 MgCl2mg、360.32 mg のブドウ糖の超純水 H2O の磁気攪拌機を使用してガラス ビーカーの 450 mL に HEPES の 1.19 g を溶かします。
    2. 7.75 NaOH で pH を調整します。
    3. 500 mL のメスフラスコにソリューションを転送します。500 mL まで超純水 H2O、メスフラスコを入力します。
    4. よく、浸透圧を測定する前にソリューションをミックスします。マンニトールと 290 – 300 mOsm に調整されます。フィルター滅菌水真空システムと 0.2 μ m フィルターを用いたソリューションです。50 mg BSA を追加します。
  4. 細胞内液 (IC) の 250 mL を作る: 110 mM 20 mM ショ糖 20 mM KCl、10 mM Hepes、コー。
    1. 1.54 グラムの KOH、KCl の 327.75 の mg、HEPES の 595.75 の mg、450 mL の超純水 H2O の磁気攪拌機を使用してガラス ビーカーの中のスクロースの 1.712 g を溶かします。
    2. 7.2 (N morpholino) エタン スルホン (MES) 酸の pH を調整します。
    3. 250 mL のメスフラスコにソリューションを転送します。250 mL まで超純水 H2O、メスフラスコを入力します。
    4. よく、浸透圧を測定する前にソリューションをミックスします。280-290 mOsm (EC よりも低い 10 mOsm) とスクロースを調整します。フィルター滅菌水真空システムと 0.2 μ m フィルターを用いたソリューションです。
  5. 2% 低融点アガロース溶液の 100 mL は、Ca2 +と BSA 無料 EC (Ca2 +の 100 mL の低融点アガロースの 2 g 無料 EC)。電子レンジを使用して溶解し、40 ° C で水のお風呂で溶かしたアガロースを配置組織で使用する前に 40 ° C に達するまでそれはクールダウンをみましょう。
    注: EC、Ca2 +無料の EC は、数ヶ月数週間場合生殖不能、-20 ° C での IC ソリューションの 4 ° C で保存されるかもしれない。アガロースは 4 ° C で 1 週間保存でき、簡単に電子レンジで 3-5 回を再利用できます。過度の再利用は、蒸発やアガロースと塩濃度と品質の変化に します。
  6. 寒天橋を作る。
    1. 外径 (外径) 2 mm の 7.5 mm 長いホウケイ酸ガラス管を熱し、径 (内径) 1.16 mm、焦点距離でブンゼン バーナーを使用する内部と、ガラスが曲がり始めるまで 1 つの端から約 1/3 がポイントします。炎からガラスを削除し、(図 2A) 約 120 度の角度で曲げガラスを許可します。
    2. Agarose が液体にガラスの両端のいずれかを置くと、数分待って強制的に既製のガラス毛管現象を用いたキャピラリー液体充填、グルコース、電子レンジを使用せず通常の EC で 2% 寒天を溶かします。グルコース不含 EC 4 ° C での使用まで橋を格納します。
  7. 適切なピペットの引き手を使用してフィラメント パッチ ピペットでホウケイ酸ガラスを準備します。必要な電極の抵抗を取得するピペット引き手マニュアルを参照します。
    注: ピペットの先を細くは可能な限り短くする必要があります。ショート ピペット テーパは 4-6 引きの手順を使用して実現されます。電極抵抗は、セル サイズに応じて 2 と 6 の MΩ の間でなければなりません。
  8. 避けるためにパッチ ・ クランプの実験中に組織の動きはポリエチレンイミン (PEI) ホウ酸バッファー内の 0.1% の記録室の表面をコートします。
    1. ホウ酸バッファー (25 mM) の 500 mL を準備します。
      1. Na2B4O710 H2O 450 ml の超純水 H2O 磁気攪拌機を使用してガラス ビーカーでの 4.768 g を溶解します。
      2. 8.4 塩酸で pH を調整します。
      3. 500 mL のメスフラスコにソリューションを転送します。500 mL、0.2 μ m フィルター滅菌水の真空システムを使用して、ソリューションまで、超純水 H2O、メスフラスコを入力します。
    2. PEI (49 mL 25 mM ホウ酸バッファーに 1 mL 50 %pei)、0.1 %pei 希釈液の原液を 1% 1% ホウ酸バッファーの 100 μ L の原液の希釈 10 μ L 最終用準備します。
    3. スライス ホルダーのガラスに 0.1 %pei の 2 mL を追加し、1 分間インキュベート コーティング。簡単に超純水 H2O の 5 mL で 2 回ガラスを洗浄し、使用するまで乾燥空気します。
  9. アムホテリシン B のソリューションを準備します。
    1. 光から保護 1 mL 管に 50 μ L ジメチルスルホキシド (DMSO)、アムホテリシン B 粉の 3 mg を溶解することにより 60 mg/mL 原液を作る。30 の最大速度で渦 s と均質化に 15 分間、超音波。-20 ° C で 3-5 管に因数を格納し、1 日あたり 1 つの因数を使用します。
      注: アムホテリシン B 原液はないはっきりと黄色の色が 15-20 分超音波処理後 (まだ黄色) ミルキーなら新しい原液。
    2. 以上 10 mL 容量ときれいなガラス ビーカーに IC のピペット 2 ml アムホテリシン B の IC ソリューションを確認します。ピペットのソリューションにアムホテリシン B 原液の 8 μ L を加え、ピペッティングで混ぜます。使用するまで氷の上アルミ箔と場所でビーカーをラップし、すべての 3 h を更新します。

2. 郭清と Vibratome とスライス

  1. ハサミでシャープの 1 つと 1 つの強力な鉗子を含む解剖する前に郭清ツールを準備します。きれいにエタノールとツール (ティッシュ ホルダー、ブラシ、鉗子)、郭清のためだけに、固定組織と接触することで使用されるかどうかを確認します。汚染を避けるために別のボックスでそれらを保ちます。
  2. 1 分の氷冷水の魚を安楽死させます。
  3. その後の手順は、すぐに (3 分以上使用) シャープの鉗子でメダカの脳や下垂体を解剖します。
    1. 押しながら魚強い鉗子で厳しい目の後ろに 2 つの視神経ハサミまたは鉗子を鋭い。
    2. 強い鉗子で一歩一歩の頭蓋骨の骨を壊すことによって後方から前方への頭蓋骨の背の部分を開きます。
    3. 強力な鉗子で片側に頭蓋骨をはがします。
    4. 重症脊髄はさみまたは鋭い鉗子。
    5. 優しく、鉗子で脊髄をつかむ前に後方から脳を反転、冷たい Ca2 +無料 EC と皿に入れます
  4. 液体の agarose が付いて 1.5-2 cm3金型を記入し、氷の上に置きます。
  5. Agarose を (およそ 25-30 ° C) で凝固、直前に優しく鉗子で脊髄が脳をつかむ、上質紙の切れ端で鉗子を乾燥、agarose に組織を置きます。すぐに周囲の組織を残して EC の痕跡を希釈し組織をオリエンテーションし、agarose を硬くなるまで数秒間氷にカビを聞かせてする agarose をミックスします。
    注意: この手順で高速が重要です。金型は氷による冷却、agarose が迅速に固化します。
  6. メスの刃で組織を含む agarose の正方形のブロックをトリムし、vibratome 試料ホルダーの手術 (無毒) 接着剤を使用して接着します。
  7. 冷たい Ca2 +無料理事会とホルダー (脳下垂体) を受け取る vibratome のキュベットを埋める
  8. Vibratome に試料ホルダーを置き、矢状断面を 150 μ m、高周波および低速を使用して、区分のために agarose ブロックをカットします。選択したセクションを収集し、3 ml の氷冷 Ca2 +無料 EC のパッチ ・ クランプ記録室に配置
  9. ティッシュ セクションのグリッド ハープ (図 2B) を配置します。
    注: ハープ コーティングと共に組織を安定化、パッチ ・ クランプ記録中に動かないようにします。
  10. ハープを配置した後、Ca2 +通常の EC および BSA に Ca2 +無料 EC メディアを変更します。10 分はティッシュを聞かせてください。

3. 穿孔パッチ ・ クランプと電気生理学的記録

  1. 次の手順により塩化銀ワイヤ電極の実験を開始する前に: 最初に、銀線電極をきれいに目の細かいサンドペーパー (p180) を使用します。第二に、2 mL、70% エタノールでリンスします。第三に、2 mL、10 分の 2-5% 塩素でワイヤを浸しなさい。最後に、すすぎ 2 mL、超純水 H2o.
  2. 顕微鏡ステージの脳-下垂体スライスと録音室を配置および対物レンズ 10 倍を使用してターゲット領域 (下垂体) 40 × 対物を使用してセルを検査します。
    注: 準備に成功した場合、非常に少数の円形細胞が見えるはずです。これらの丸い細胞は、通常損傷した細胞の組織から切り離すことです。
  3. EC お風呂に 2% 寒天橋を介して接地電極を配置します。
  4. 40 × 対物を使用して健康な細胞を探します。
    注: 健康な細胞しっかり組織スライスに接続されているとない切り上げ、スライスから切り離されました。
  5. 電圧クランプ (VC; でアンプをセットします。図 4 aのポイント 1) モード。オープン シール テスト ウィンドウを押しお風呂の構成 (図 4 bポイント 1 と 2。5 mV のパルスを使用して、ピペット抵抗 (図 4 bポイント 3) を監視します。
  6. バックフィル アムホテリシン B マイクロ フィラー注射器を使用しての IC ソリューションを追加する前に抗真菌無料 IC ソリューション パッチ ピペットの先端 (図 3参照)。
  7. 1 mL の注射器を使用してパッチ ピペットに少し肯定的な空気圧を追加します。
    注: これは先端の汚染を避けるためパッチ ピペットから液体小流量になります。
  8. 一度風呂にパッチ ピペット抵抗を評価し、ピペット (図 4) の先端に粒子が付いていないことを確認します。
    注: テープの小さい部分はビデオ録画フォーム ビューのフィールドを表示するモニター取り付けです。これは位置のセルを基準にしてパッチ ピペットの容易に目的のセルにピントが合わないときになります。
  9. マニピュレーターを用いたセルまでパッチ ピペットをご案内します。
    注: ピペット、ピペットの先端に付けたことがあります小さな粒子を捜すことによってクリーンであることを確認します。抵抗の急激な変化は、ピペット チップで立ち往生粒子の結果もあります。
  10. ときにいくつかのピペットを再調整セルの上ミクロン、ピペットの先端は、図 5に示すように、セル、セルの中央から 1/3 が触れます。セルに触れて、圧力を解放、シールを作成する穏やかな吸引を適用されます。
    注: パッチ ピペットから時間成功にお風呂に入るシールは、可能な限り短くおく必要があります。以上 1-1.5 分間お風呂にリーク、ピペットの先端を到達アムホテリシン B を避けるために。
  11. すぐにパッチ ・ クランプ ソフトウェア (図 4 Dポイント 1) でパッチウィンドウに切り替えるし、-50 と-60 mV (図 4点 2) 間保持可能性があります。ゼロ アウト高速容量ガラス製ピペット (図 4点 3) によるもの。
  12. ソフトウェア パッチ クランプ (図 4Eポイント 1 と 2) でセルのウィンドウに切り替えるし、抵抗、 Raウィンドウに表示の監視を開始します。十分なアクセス権後アンプ ソフトウェア (図 4Eポイント 3) 膜容量をゼロに。
    注: 十分なアクセスは、10 〜 30 分 (図 4Eポイント 2) をかかることがあります。現在のクランプ録音の良いアクセスは、20 M 以下でなければなりません。
  13. 現在のクランプ、 ICアンプ ソフトウェア ウィンドウ (図 4 階ポイント 1) に切り替えます。3.12 のように同じ値にアンプ ソフトウェア (図 4 階ポイント 2 と 3) の- クランプウィンドウで高速容量性電流を調整します。膜電位 (図 4 階ポイント 1) を確認してください。
    注: 重要なは、膜電位が浅い場合 (-35 上典型的な mV) セルが破損する可能性があります。録画をキャンセルし、新しいセルを見つけます。
  14. 健康な細胞を発見した後 (-40 以下潜在的な膜組織にしっかりと接続されている mV)、製造元のプロトコル33,34の詳細として、実験的なレコーディングを開始。

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結果

このプロトコルはターゲット細胞の (Lh 生産アクチビン) めだか形質転換線 [Tg (1塩基変異hrGfpII)] を使用して、下垂体 (gonadotrope) セルから信頼性の高い記録を達成する方法のステップ バイ ステップ プロトコルを示します緑色蛍光タンパク質 (GFP) が付いています。

当初は、全細胞の構成を使用して電気生理学的調査を行った。しかし、任意調査細胞ので自発的な活動電位は見られなかった。セルのサブセットで-50 と-60 mV (図 6) の間の静止電位から小さな現在注射 (5-9 pA) を使用して活動電位をトリガー可能性があります。これらの活動電位が高速ランダウンと誘発電位が可能であったもはや約 4-6 分後。観測された特に高速ランダウンは、小さいセルのサイズによって説明されるかもしれない。一般に、下垂体細胞、ニューロン

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ディスカッション

脳下垂体スライスのパッチ ・ クランプの技術を使用して電気生理学的記録は、慎重に最適化を必要とします。特に硬骨魚類における生細胞調査のためよく最適化されたプロトコルは哺乳類システムに基づくプロトコルを使用して、文書の大半と限られます。この点で、それは重要な pH および浸透圧のようないくつかの生理学的パラメーターの事実を知っている種だけでなく扶養家族、しかしまた非常に土地や水の問題の生物が住んでいるかどうかに依存します。魚、海洋または淡水環境で暮らす場合にも、考慮に入れる、必要です。たとえば、CO2分圧は魚まで 1.7-3.4 mmHg pCO2魚と哺乳類の36の 40-46 mmHg pCO2哺乳類に比べてはるかに低い。これに基づいて、我々 は 7.75 · 37,·38,39,4...

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開示事項

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謝辞

LourdesCarreon G タンさんのめだかの施設を維持する助けと例示図のアンソニー ・ ペルチェに感謝しますこの作品は、NMBU、許可番号 244461 (養殖プログラム) と 248828 (デジタル ライフ ノルウェー プログラム)、ノルウェーの研究協議会に賄われていた。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ビブラトームライカVT1000 S
Chirurgical glueWPIVETBOND3M Vetbond ティッシュ接着剤
ステンレス製ブレードカムデンインスツルメンツ752-1-SS
金型さくら4122
スチールハープワーナーインスツルメンツ64-1417
PBSシグマD8537
超高純度LMPアガロースinvitrogen166520-100
パッチピペットサッター機器BF150-110-10HPフィラメント付きホウケイ酸 O.D.:1.5 mm, I.D.:1.10 mm
顕微鏡 Slicescope Scientificapro6000
P-Clamp10Molecular Devices#1-2500-0180ソフトウェア
デジタイザー Digidata 1550A1Molecular DevicesDD1550
Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7BMolecular Devices1-CV-7B
GnRHBachem4108604H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH トリフルオロ酢酸塩 
ピペットプーラーSutter InstrumentP-1000
amphotericin BSIGMAA9528細孔形成抗生物質
ポリエチレン SIGMAP314350% PEI solution
microfiler syringeWPIMF28/g67-5
ガラス 寒天ブリッジ用サッター機器BF200-116-15ホウケイ酸フィラメント付き O.D.:2.0 mm, I.D.:1.16 mm Fire polished
Micro-Manager softwareOpen Source Microscopy Software
optiMOS sCMOS cameraQimaging 01-OPTIMOS-R-M-16-C
超音波処理器エルマD-7700シンゲン
NaClSiGMAS3014
KClSiGMAP9541
MgCl<サブ>2>SiGMAM8266
D-グルコースSiGMAG5400
プスSiGMAH4034
CaCl2SiGMAC8106
ショ糖SiGMA84097
D-マンニトールSiGMA63565
MES酸SIGMA M0895
BSASIGMAA2153
ヘ

参考文献

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