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方法論記事

「マウス卵巣における現象を可視化する卵巣の組織培養

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DOI:

10.3791/57794

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2018年6月19日

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Aichi Medical University, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Nagoya University Graduate School of Medicine, 3Department of Maternal and Perinatal Medicine, Nagoya University Hospital

この記事について

サマリー

卵巣の組織培養卵胞開発、排卵や卵胞閉鎖のモデルとして使用することができ、卵巣の動的過程の制御機構を示します。

要約

哺乳類の女性は、各発情周期中に卵母細胞数をほぼ一定を定期的に排卵します。このような規則性と周期性を維持するためには、視床下部-下垂体-性腺軸レベル、卵巣内の卵胞の開発に規制が発生します。アクティブな研究にもかかわらずいくつか手順休眠原始卵胞活性化から排卵して卵胞の各段階で異なる規制の複雑さのため、卵胞の発達メカニズムは明らかありません。卵胞発育のメカニズムと発情サイクルを通して卵胞のダイナミクスを調べるためには、顕微鏡を用いて卵胞の発育を観察するために使用できるマウス卵巣組織培養モデルを開発しました。体系的な卵胞発育、周期的な排卵と卵胞閉鎖すべてで再現できる卵巣培養モデルと培養条件を実験的変調することができます。ここでは、卵胞発育の調節機構とその他卵巣現象における本法の有用性を示す.

概要

雌マウス卵巣いくつか千包1、および周期的な排卵発情サイクルごとに約 10 卵母細胞が成熟します。卵胞は、いくつかの発達段階に分類: 原初、プライマリ、セカンダリ、幽門洞、および各卵子を取り巻く顆粒膜細胞層の形態によって、グラーフ卵胞。ほとんどの原始卵胞が休止状態とそれらのいくつかはアクティブし各発情周期2プライマリ卵胞に成長します。二次濾胞ステージ後卵胞発育は主に性腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン (FSH) と黄体形成ホルモン (LH) によって調整されます。しかし、原始、プライマリ卵胞発育、性腺刺激ホルモンとは無関係です、これらの段階を支配する制御機構のまま悪い inderstood3,4,5。成長因子およびホルモンのほか、原始、プライマリ卵胞は卵胞6,7間の相互作用によって調整されます。したがって、マウス卵巣組織の卵胞動力学の解析を実行し、卵巣の組織培養8,9,10を使用して関連付けられている規制メカニズムを検討しました。

ここで、2 つの卵巣組織培養モデルのメソッドを紹介します。最初、卵胞の測定により卵胞発育を分析するため、2 番目はトランスジェニック マウスとセカンダリ卵胞期に原始から初期の卵胞発育中規制機構の研究使用されます。小胞の開発の分析、主に使用しました 4 週齢の雌マウスの卵巣卵胞を簡単に表示できるため。定期的な排卵とモデル生体内で卵胞発育を誘導するには、培養条件下でのエストラジ オールの分泌卵胞閉鎖と観測された排卵 LH サージが再現されております。培養の卵巣のイメージが捕獲されたと濾胞領域でトレースの変更によって卵胞の開発プロセスを分析しました。ただし、明視野顕微鏡解析で原始と初期プライマリ卵胞の区別は明確です。したがって、小卵胞を検出、原初、プライマリ、区別する手法を開発したし、の二次卵胞培養を用いた卵巣組織Oogenesin1 (Oog1) pro3 。9 と 0 と 4 日誕生11 R26 H2B mCherryトランスジェニック マウスの卵巣。Oog1式減数分裂、参入後は、卵母細胞の検出と原初から培養卵巣組織11 時間経過画像を用いたプライマリ卵胞への移行が観察、卵胞の発育とともに徐々 に増大 ,12。形態学的方法は、休止状態の原始卵胞13,14,15,16を活性化する要因を検討し使用されている、卵巣の生理学的な卵胞発育が観察することは困難、様々 な要因の影響残る例を紹介。本培養法は、ターゲット要素のリアルタイム解析でこの不足に対処するため設計されました。

本研究で我々 はタイムラプス イメージング法による卵胞の発育を追跡され、卵胞発育のプロセスが特徴します。私たちの手法は、卵巣の生理学を調査するための前例のないツールを提供しています。

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プロトコル

マウスは、23 ± 1 ° C 12 h 光/12 h 暗いサイクルで環境制御部屋で収容されました。動物のケアのプロトコルおよび実験愛知医科大学動物実験ガイドラインに従って実施し、現職のケアおよび使用委員会によって承認されました。

1. 培地や料理の準備

  1. 基本的な文化のメディアの準備、ウシ胎児血清 (FBS、5 %v/v)、FSH を追加 (100 Miu/ml) LH (10 mU/mL) とペニシリン-ストレプトマイシン (ペニシリン、100 U/mL; ストレプトマイシン、100 mg/mL) 最小必須培地 α (MEM-α) とミックスは 50 mL の管に。
    注: 合計ボリュームの必要な文化メディア実験の間で変わるが、培養液 1 mL は 3.5 cm ガラス底培養皿だけで十分です。
  2. 3.5 cm ガラス底培養皿に 1 mL 混合培地の因数を注ぐし、料理に場所 30 mm 細胞培養チップを設定します。中古メディアとインキュベーター (5% CO2と 37 ° C) で料理を温めます。

2. 卵巣組織の準備

  1. あらかじめ暖かいリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (−) と MEM-アルファ 5 %fbs、100 U/mL ペニシリン、インキュベーター (5% CO2と 37 ° C) で 100 mg/mL ストレプトマイシンを含みます。
    注: 約 3 mL 卵巣あたり因数 PBS (−) の使用のための十分な卵巣の解剖中に、MEM アルファの 1 mL 因数 3.5 cm 皿で単一の卵巣の一時的なストレージとして十分です。
  2. 4 週間の古い女性 ICR の (がん研究所の後の名前) マウスから卵巣を切除し、はさみと実体顕微鏡下で、ピンセットを使用して卵巣を周囲の組織をトリムします。培地の除去の卵巣をぜひご予約ください (手順 2.1 参照) に使用されるまで。
    1. PBS (−) で加温で湿らせたろ紙上に単一の卵巣の場所 (手順 2.1 参照) と実体顕微鏡下のミクロトーム刃を使用して 4 枚にスライス。
      注: 4 週齢 ICR マウスの卵巣は、直径約 2 mm です。ピースの数によって異なります卵巣サイズ;ただし、約 500 μ m 厚い個できる適切な卵胞観察 (作品は 500 mm よりも厚く、組織透過性が減少; 個 500 ミリメートルよりも薄いの多くから胞状卵胞が壊れており、失われた)。
    2. 郭清後に、予め温めておいた培 (手順 2.1 参照) 3.5 cm 料理にスライスした卵巣片を配置します。

3. 卵巣の組織培養

  1. 卵巣組織がなる細胞文化挿入時の卵巣組織をスライス培養培地ごとの約 0.5 μ L をドロップ マイクロ ピペットを使用して設定します。
  2. ピンセットを使用して細胞培養インサート培のドロップに各スライス標本を配置します。
  3. 37 ° C で 5% CO2の卵巣組織を文化します。
  4. 2 日ごとに予め温めておいた培で培養液を置き換えます。
    注: 4 週齢 ICR マウスから卵巣部文化の媒体の変更のスケジュールは、図 1に提示されます。
    1. LH サージを再現するには、100 mU/mL FSH と LH 12 時間ごとの 4 日 (図 1) を含む培地で培養 4 週齢 ICR マウス卵巣を扱います。

4. 顕微鏡培養卵巣の画像

  1. 組織が細胞培養チップに付着したとき 1 日目後培養の卵巣の画像を開始し、24 h 間隔時間の点の間の十分な卵胞成長を許可する共焦点または倒立顕微鏡解析を実行します。
    注: 共焦点顕微鏡倒立顕微鏡全体培養卵巣内の卵胞を観察するために優れています。

5. タイムラプス イメージング培養卵巣の

  1. レーザー強度とイメージング システム (表 1) のための露出時間などを含む、タイムラプス撮影条件を最適化します。
    1. 処置および制御グループとして使用のための単一のマウスからペア卵巣片を選択します。レーザーの強度と最高の画像 (表 1) を達成するために露光時間を変えます。
    2. 卵胞エリア 24 時間間隔でコントロールのサンプルの画像とタイムラプス イメージング サンプル (手順 6 を参照) を測定することにより各培養条件下で卵胞の成長を比較します。同時に、各卵巣セット排卵卵子の数をカウントし、最適なタイムラプス イメージング条件を選択します。
  2. (表 1) の一定の条件の下でタイムラプス イメージング システムを使用して 30 分間隔で画像をキャプチャします。

6. 卵胞成長解析

  1. 卵胞発育を分析するには、ImageJ ソフトウェア (http://resbweb.nih.gov/ij/) を使用してキャプチャされたイメージに包領域を測定します。
    1. 当初は、ツール ・ バーの「分析」の下で「スケールを設定」をクリックしてイメージ スケールを設定します。それぞれの「知られている距離」と「ピクセルの距離」、空白のフィールドにキャプチャしたイメージとピクセルの対応する番号の側面の長さを入力します。
    2. 「フリーハンド」ツール バーでをクリックし、明るいフィールドから取得されたイメージで卵胞の概要を説明します。
    3. ツール ・ バーの「分析」の下で「測定」をクリックします。
      注: 他の測定データが必要な場合「設定測定」「分析」の下で、ツール ・ バーをクリックし、一覧で該当するボックスをチェックします。

7. トランスジェニック マウスを用いた卵胞発育の解析

  1. 生後 0 および 4 (P0、P4) トランスジェニック マウスを含む挿入遺伝子Oog1pro3.9とR26 H2B mCherr、文化に従って手順 1.1 – 3.2、そうでない点を除いて女性スライス、P0、P4 卵巣から卵巣を収集します。
  2. 含む 5% CO2 37 ° C で 2 日ごとインキュベーターで 3.5 cm 料理で新鮮な予め温めておいた培地で培養液を交換してください。
    注: P0、P4 の卵巣の培地の LH の濃度は、LH サージは P0、P4 のマウスで発生しないために定数残ることができます。
  3. 培養の P4 卵巣 (表 1) でのみ AcGFP1 肯定的なプライマリ卵胞を可視化する顕微鏡を設定します。
    注: のみ原始、プライマリ卵胞 P4 雌マウスの卵巣ではあります。
  4. 培養 P0 Oog1pro3.9の画像をキャプチャ/R26 H2B mCherryトランスジェニック マウス卵巣 30 分間隔で P4 卵巣 (5.2 を参照) に使用される設定を使用しています。
  5. トレースし、AcGFP1 と H2B mCHerry 信号を使用して卵胞の発育を分析します。

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結果

図 1は、卵巣の組織培養中にメディアに変更するためのプロトコルを示します。このプログラム、4 週齢 ICR マウス卵巣培養され、共焦点顕微鏡 (図 2) を使用して 24 h 間隔で撮像されます。3 週間、卵巣組織の培養中最も幽門洞およびセカンダリの卵胞が卵胞閉鎖によって退化したし、いくつかあった排卵 (図 2Dおよび表 2)。ImageJ (図 3) を用いた包地域の分析、いくつかの卵胞は、(図 3Bおよび補足の映画 1) 各 LH サージ サイクル中にグループで開発。また、排卵は別培養卵巣で単一のマウスの右と左の卵巣からほぼ同時に発生しまし...

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ディスカッション

本研究ではマウス卵巣における卵胞発育を研究するための 2 つの新しい方法を開発しました。最初のメソッドは卵胞発育の解析に続いてスライスした卵巣成熟マウス組織の文化を含み、2 番目には段階では、性腺刺激ホルモンに依存しない初期の卵胞発育を視覚化する時間経過イメージ投射の使用が含まれます。以前は、卵胞開発8,9日白血病の抑制的な要因とプロゲステロンの効果を評価するために現在の卵巣組織培養法を用い, 濃度と卵胞の段階でその効果が異なることを示した.本研究では展示した卵巣組織卵胞動態, このモデルを用いて卵胞形成メカニズムの解析をさらに正当化をスライスしました。

以上 5 週齢のマウスの卵巣には、顕微鏡観察を妨げるコーパス黄体が含まれています。したがって、4 週齢マウス卵巣は卵胞発育と排卵の観察に適しているし、以降後半のプライマリ、セカンダリ、および幽門卵胞は、明視野顕微鏡を用いたを区別してより簡単に。私たちの方法は、成長因子および特異的治療卵巣 (

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

我々 は博士直次郎南 (京都大学) がOog1pro3.9マウスを提供することをありがちましょう。本研究は、日本学術振興会 (科研費 # JP15H06275) と日東財団によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ヒト下垂体由来卵胞刺激ホルモンSIGMAF4021
ウマ下垂体由来のルテン化ホルモンSIGMAL9773
ペニシリン・ストレプトマイシン溶液和光純薬工業168-23191
MEM a、GlutaMax、ヌクレオチドなしサーモフィッシャー32561037
ガラス底皿MatTekP35G-0-10-C35mmディッシュ 0号カバースリップ ガラス径10mm
ミリセル細胞培養インサートメルクミリポアPICM0RG50直径:315mm 孔径:0.4mm 素材:親水性PTTE
3.5cm細胞培養ディッシュグライナーバイオワン627160
50ml/トリプルシールキャップ付き遠心チューブIWAKI2345-050
薄型使い捨てブレード 819ライカ14035838925
LSM 710カールツァイス共焦点顕微鏡
CellVoyager, CV1000横河電機株式会社タイムラプスイメージング
BZ-X700キーエンスタイムラプスイメージング

参考文献

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