多能性幹細胞から特殊な網膜細胞の生産は、網膜疾患の幹細胞を用いた治療法の開発のターニング ポイントです。本稿は、並進、基礎および臨床研究のオルガノイドの網膜と網膜色素上皮の効率的な生成の単純な方法をについて説明します。
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方法論記事
Xeno 無料の定義された、人間の世代の iPSC 由来網膜細胞モデル フィーダー フリー培養条件
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
特殊化した細胞から多能性幹細胞の生産には、再生医療のための新しいアプローチを開発する強力なツールが用意されています。人間誘導された多能性幹細胞 (Ips) の使用は、iPSC 由来網膜細胞モデルが理解し失明を戦う主要な一歩前進をマーク網膜ジストロフィーを含む神経変性疾患研究に特に魅力的です。生成、成熟、および網膜オルガノイドを凍結するシンプルかつスケーラブルなプロトコルについて述べる。媒体を変更するに基づいて、このメソッドの主な利点は複数を避けるために、時間のかかる手順は、Ips の誘導分化で要求される一般的。付着性人間 iPSC 文化に定義されているメディアの継時的変化による網膜の開発の初期の段階を模倣、このプロトコルにより上方構造と網膜色素上皮 (RPE) 細胞を自己形成の同時発生、4 週間で再現性のある、効果的な方法。これらの構造体を含む網膜前駆細胞 (Rpc) は、Rpc の大人の人間の網膜内にある 7 網膜細胞型への分化を有効に浮遊培養条件でさらに成熟簡単に分離できます。また、網膜オルガノイドの凍結保存法と長期保存のための網膜色素上皮細胞について述べる。一緒に組み合わせることで、ここで説明する方法は、銀行の iPSC 由来網膜細胞または基礎・臨床研究のためのティッシュを制作し役に立つでしょう。
概要
網膜は中枢神経系 (CNS) の不可欠な部分で、自発的に次の外傷性の傷害または病気を再生する限られた容量。したがって、糖尿病網膜症、緑内障、網膜色素変性症 (RP) 加齢に伴う黄斑変性症 (AMD) などの決定的な網膜細胞の損失を引き起こす退行性の病態は、通常、不可逆的な失明に します。変性網膜を救出、破損したまたは失われた細胞を置き換えることを目指して幹細胞ベースの治療が最も有望なアプローチ1,2,3の 1 つで、主要な課題です。ヒト胚性幹細胞 (Esc) 細胞と多能性幹細胞または人間誘導された多能性幹細胞 (Ips) は、文化では、無限に拡張する能力を持っているし、任意のセルの種類を生成する可能性があります。網膜の開発の私達の理解と体外の改善の進歩人間 iPSC 分化がにより網膜 organoids7,8,9の生成のためのプロトコルします。 10、11,
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プロトコル
このペーパーで説明したプロトコルの Institut de la ビジョンの研究倫理委員会のガイドラインに従います。Institut de la ビジョンは、現在のフランス語の規則に従って人間の標本の操作を許可されています。検体の取り扱い"Comité デ保護デ Personnes (CPP) イル V"の倫理的な承認後にヘルシンキの教義に従って患者データ保護と国民の規則に従います。
1. 文化メディアと料理の準備
-
文化メディア
- IPSC 媒体、専用のフィーダー無料条件16多能性幹細胞の培養に化学的に培地を使用します。製造元のプロトコルに従って媒体の 500 mL を準備します。
- 使用基底 iPSC (Bi) 媒体 iPSC は化学的に線維芽細胞成長因子 2 (FGF2) や変形の成長要因ベータ (β) なし媒体を定義されています。
- 500 ml 1 %n2 サプリメント (BiN2 中)、Bi 培の 10 単位/ml、ペニシリンとストレプトマイシンの 10 mg/mL。
- 視覚 N2 ベース (ProN2 中) からなる媒質の DMEM:Nutrient 混合 F-12 (DMEM/f12 キーを 1:1、L グルタミン)、1% メモリ必須でないアミノ酸、1 %n2 サプリメント、10 単....
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結果
フィーダー無料条件16で培った人間 iPSC の差別化のための最初のステップです (図 1 a) の分化を促進する双方向の媒体を使用して自己複製機械をシャット ダウンします。双方向メディアを補完する D2 での Ips 細胞神経および網膜の系統へのガイドに N2 サプリメントで。この過程は D28 の周りで上方芽の外観につながります (図 1 - 1E)。自己形成の上方の構造は図 1Eに示すように針を使用して分離することができます、ProB27 媒体 (図 1 f) を使用して浮動小数点の培養条件で網膜オルガノイドの成熟を許可する培養皿に転送。成長と神経網膜の開発を支持するには、FGF2 は 1 週間 (図 1 a.......
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ディスカッション
このプロトコルでは、網膜色素上皮細胞と網膜 Rgc と xeno、フィーダー フリー条件のひと多能性幹細胞から視細胞を含む網膜のオルガノイドを生成する方法について説明します。ここに示すよい製造業練習 (GMP) プロセス、栽培法との互換性により、RPE 細胞、Rgc、幹細胞ベースの治療法や薬の開発のための視細胞と iPSC 由来の網膜細胞の大規模な生産網膜変性疾患の将来の治療発見アプローチ。網膜全体 organoids または hiRPE 細胞の凍結保存は、中間細胞銀行を確立するの主な利点は、幹細胞ベースの治療で将来使用するための重要なステップを提供します。
分化の特定のステージで特定の網膜細胞型の大型株の生産は、今後臨床的翻訳の必要があります。この点で、CD73 正視細胞前駆体の 3ヶ月で世代が移植-互換性のある細胞人口18, と凍結融解の網膜からこれらの未熟な光受容体を生成する可能性として記述organoids15強化治療目的のためのこれらの細胞を使用するために希望します。網膜の色素.......
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開示事項
サシャ ライヒマン、オリヴィエ ・ Goureau、ホセ ・ アラン ・ サヘルひと多能性幹細胞からの網膜細胞の生成に関連する特許発明に。
謝辞
著者は、彼らの重要な読書のため、ここで説明する方法と G. ガリアルディ M. Garita の設定時に、入力のための Goureau のチームのメンバーに感謝したいと思います。この作品は、ANR からの補助金によって支えられた (GPiPS: ANR-2010-RFCS005;SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02)、網膜フランス協会との技術移転会社船型研究 Lutech。それはまた Investissements d'Avenir プログラム (ANR-11-アイデックス-0004-02) 内で ANR 支え LABEX LIFESENSES (ANR-10-LABX-65) のフレームで行われました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ビトロネクチン(VTN-N)組換えヒトタンパク質、切頭 | 型サーモフィッシャーサイエンティフィック | A14700 | コーティング |
| CTSビトロネクチン(VTN-N)組換えヒトタンパク質、切頭型 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A27940 | コーティング |
| エッセンシャル8培地 | モフィッシャーサイエンティフィック | A1517001 | メディウム |
| エッセンシャル6培地 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A1516401 | 中型 |
| CTS(Cell Therapy Systems) N-2 Supplement | ThermoFisher Scientific | A1370701 | supplement CTS |
| N-2 Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| supplement B-27 Supplement (50X)、無血清 | ThermoFisher Scientific | 17504044 | Supplement |
| CTS B-27 Supplement、XenoFree | ThermoFisher Scientific | A1486701 | サプリメント CTS |
| DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | medium |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | supplement |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | antibiotic |
| CellStart CTS | ThermoFisher Scientific | A1014201 | MatrixCTS |
| Geltrex hESC認定、すぐに使用できる、低成長因子 基底膜マトリックス | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A1569601 | マトリックス |
| 穏やかな細胞解離試薬 | Stemcell Technologies | 7174 | 解離溶液 |
| クライオステム凍結培地 | clinisciences | 05-710-1D | 凍結保存培地 |
| 線維芽細胞成長因子2(FGF2) | Preprotech | 100-18B | FGF2 |
| 線維芽細胞成長因子 2 (FGF2) アニマルフリー | Preprotech | AF-100-18B | FGF2 Xeno free |
| AGANI ニードル 23G | テルモ | AN*2332R1 | ニードル |
| フラスコ 25 cm²組織培養処理 | されたファルコン | 353109 | T-25 cm² |
| 24ウェルプレート 組織培養処理済み | Costar | 3526 | 24ウェルプレート |
| 6ウェルプレート 組織培養処理済み | Costar | 3516 | 6ウェルプレート |
参考文献
- Zhao, C., Wang, Q., Temple, S. Stem cell therapies for retinal diseases: recapitulating development to replace degenerated cells. Development. 144, 1368-1381 (2017).
- Dalkara, D., Goureau, O., Marazova, K., Sahel, J. -A. Let There Be Light: Gene and Cell Th....
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再版と許可
