10-11 転流 2 5-メチルシトシン ジオキシゲナーゼの LC MS/MS による分析法の開発や効率的に精製

Summary

ここで、紹介タグの付いていない人間の活動の効率的な単一ステップ浄化のためのプロトコル 10 11 転流 2 (TET2) イオン交換クロマトグラフィーと液体クロマトグラフィー-タンデム質量を使用しての試金を使用して 5-メチルシトシン ジオキシゲナーゼ分析 (クロマトグラフィー-タンデム質量)-ベースのアプローチ。

Abstract

5-メチルシトシン (5mC) を介したエピジェネティックな発現制御は、真核生物の開発で重要な役割を果たしてきました。10-11 転流 dioxygenases (TET1-3)、チミン DNA グリコシラーゼ依存塩基除去修復に続いて連続酸化これらのエピゲノムの脱メチル化を実現します。TET2 遺伝子遺伝子の突然変異によりまたは他のエピジェネティックなメカニズムの不活化は多様な癌、特に造血器腫瘍患者の予後に関連付けられます。ここでは、酵素によって実行中の陽イオン交換クロマトグラフィーを用いたタグなしの人間型 TET2 ジオキシゲナーゼの効率的な単一ステップ浄化について述べる。さらに別のおよび 4 つの変更されたシトシン塩基 (5-メチル 5-ヒドロキシメチル、5-ホルミルと 5 カルボキシル基) だけでなく、通常の 4 つの DNA 塩基 (A、T、G および C) を定量化できる液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法 (MS/LCMS) アプローチをいたします。この試金は、野生型と変異型 TET2 dioxygenases の活性を評価する使用できます。

Introduction

CpG のジヌクレオチドのシトシン塩基の C5 の位置は、哺乳類のゲノムの¹で優勢なメチル化サイト (5mCpG) です。さらに、多くの最近の研究は広範な C5 シトシンのメチル化 (5mC) 非 CpG サイトを発見した (5mCpH、ところ H = A、T、または C)^2,3。5mC 変更は、内在性レトロトランスポゾン遺伝子プロモーター^3,4,5で転写サイレンサーとして機能します。5mC のメチル化は、X 染色体不活性化、遺伝子刷り込みや核リプログラミング ティッシュ特定の遺伝子表現^5,6,7で重要な役割を果たしています。C5 の位置にシトシンのメチル化は、DNA メチル化酵素により行われ、これらの酵素の突然変異を引き起こす重要な発達の欠陥⁸。5mC マークの除去は、TET1 3 5mC オキシダーゼ^9,10によって開始されます。これらのテト家族 dioxygenases 連続酸化ステップ^11,12,13によって 5-ヒドロキシメチルシトシン (5hmC)、5 formylcytosine (5 fC) および 5-carboxylcytosine (5caC) 5mC に変換します。最後に、チミン DNA グリコシラーゼは 5 fC または未変更のシトシン塩基除去修復経路¹¹を使用する 5caC を置き換えます。

人間型 TET2遺伝子は骨髄異形成症候群 (MDS)^14,15,16、MDS 骨髄増殖性腫瘍 (を含む多様な造血器腫瘍における頻繁変異遺伝子として同定されました。MDS-MPN)、およびデータシートとデータシート MPN¹⁶由来急性骨髄性白血病 (AML)。5hmC 骨髄 DNA 修飾のレベルは TET2 の突然変異で野生型 (wt) と比較した患者の下に-TET2¹⁴。グループの数は、その正常造血と骨髄性変換^17,18,19,20における役割を明らかにする TET2 ノックアウト マウス モデルを開発しています。TET2 遺伝子に変異を持つマウスが最初通常で実行可能な明らかに多様な造血器腫瘍、高齢、早期死亡の原因が。これらの研究は、正常な造血分化に wt 型 TET2 演じる重要な役割を示した。これらマウス モデル、(TET2^± HSCs) ヘテロ接合体の造血幹細胞およびホモ型 TET2^-/-の HSCs が両方 TET2^+/-として造血系統の再作成でホモ wt TET2 HSCs 上の優位性TET2^-/- HSCs は多様な造血器腫瘍^17,18を開発しました。これらの研究は、そのハプロ TET2 ジオキシゲナーゼ HSCs の開発を変更し、造血器腫瘍における結果を示しています。

TET2 遺伝子の変異を持つマウスと同様に、ほとんどの白血病患者マニフェスト型 TET2 ジオキシゲナーゼ活性のハプロ。これらの主にヘテロ接合体の体細胞突然変異は、ナンセンス、フレーム シフト突然変異のほとんどがミスセンス突然変異型 TET2 遺伝子体全体に分散ジオキシゲナーゼ ドメイン¹²でクラスター化します。日には、少し評価 wt と変異 TET2 は TET2 ジオキシゲナーゼとその分析²¹の生産の難しさによる主に文学で報告されます。ここで、単純なシングル ステップ精製イオン交換クロマトグラフィーを用いたネイティブ型 TET2 ジオキシゲナーゼを報告します。さらに、定量的なクロマトグラフィー-タンデム質量分析は最適化され、ネイティブ型 TET2 ジオキシゲナーゼの酵素活性を測定するために使用されました。

Protocol

1. クローン作成およびタグなし人間型 TET2 ジオキシゲナーゼの浄化

1. 上記²²として部位特異的組換え技術を用いた pDEST14 キャスト先のベクトルに人間型 TET2 ジオキシゲナーゼ (TET2 1129-1936 年、Δ1481-1843) を複製します。
   注: 以前の研究は最小限の触媒活性ドメイン^21,23である C ターミナル型 TET2 ジオキシゲナーゼ (TET2 1129-1936 年、Δ1481-1843) ドメインを実証しています。PDONR221 ベクトルを使用して、タグなし TET2 ジオキシゲナーゼ ドメインを表現するためにシャイン ・ ダルガーノとコザック配列は前方のプライマーで PCR (表 1) の間に組み込まれました。
2. 細菌の変形のため、タグなし人間型 TET2 ジオキシゲナーゼ (TET2 1129-1936 年、Δ1481-1843) に化学的に有能なエシェリヒア属大腸菌の 100 μ L を含む組換え pDEST14 発現ベクターの 1 μ L を追加 BL21 1.7 mL チューブ (DE3) 細胞。30 42 ° C で熱ショックに続いて、少なくとも 15 分間氷の上の混合物を保つ水お風呂で s。
   1. ヒート ショックの直後に 2 分の最小値のための氷に細胞を保ちます。次に、セルに超最適スープ カタボライト抑制 (S.O.C メディア) の 250 μ L を追加します。シェーカーで 37 ° C で 1 時間の細菌細胞を孵化させなさい。
   2. インキュベーション後、ピペッティングにより 1 分破棄 70% 培養上清の 9,000 の x g でチューブを遠心分離によって細胞をスピンダウンし、メディアの経過とともに左にペレットを解消します。
   3. 100 μ g/mL アンピシリンを含むルリヤ (LB) のスープ寒天プレートに細胞懸濁液を広げます。37 ° C で 16 時間プレートを孵化させなさい
3. 1 つの隔離されたコロニーを選択し、50 mL のチューブで LB アンピシリン メディアの 10 mL に接種します。シェーカーで 37 ° C でチューブを一晩インキュベートします。この後、100 mL の LB アンピシリン培地に接種するのに文化 50 mL のチューブからの 100 μ L を使用します。180 rpm でシェーカーの 37 ° C でフラスコをインキュベートし、初代培養として使用します。次の日は、接種 15 フラスコ、各 600 mL LB アンピシリン メディアを含んだ初代培養の 6 mL を使用します。今、180 rpm でシェーカーの 37 ° C で 15 フラスコを孵化させなさい。
   注: 変換されたクローンを確認するには、孤立したプラスミド DNA と DNA シーケンス情報や制限消化を実行します。
4. 細菌文化の密度をチェックするには、分光光度計を使用してその外径₆₀₀を測定します。各フラスコに 1 の M (600 の mL に 0.5 mM の最終的な集中) IPTG の 300 μ L と TET2 タンパク質の発現を誘導する、17 ° C で 16 時間の文化をさらに拡大する文化では、外径₆₀₀0.8 の密度に達すると、
5. 16 時間後に、遠心ボトルに細菌培養を転送します。5,250 x g で 45 分間の使用で TET2 酵素を表現する細菌培養型 TET2 浄化細菌のペレットを遠心分離機します。
   注: すべての残りのタンパク質精製手順を実行は、氷の上または 4 ° C で
6. 50 mM MES の 100 mL の細菌のペレットを再懸濁します (2-(N morpholino) ethanesulfonic 酸) バッファー、pH 6 と 60 s 冷却間隔で電源 20 5 × 30 秒の超音波。
7. スピン 5,250 x g で 45 分間でライセート可溶性型 TET2 酵素を含む上清を収集し、0.45 μ m 通過は、FPLC システムにロードする前にフィルター処理します。
   注: これらの実験型 TET2 酵素は非常に安定して、細胞にライセートを - フェナントロリンを追加できますプロテアーゼ阻害剤カクテル含む 1 mM benzamidine-塩酸、1 mM phenylmethylsulphonyl フッ化物 (PMSF) と 0.5 mM 1, 10-oを必要な場合TET2 酵素の低下を防ぐ。これらは次の陽イオン交換クロマトグラフィーを妨げる可能性がある抑制剤のカクテルで EDTA またはグリコールエーテルジアミン四酢酸を使用しないでください。
8. FPLC 列に強陽イオン交換樹脂パック 30 mL。10 ベッドの量を 0.3 mL/min FPLC システムを使用して一定の流量での洗浄バッファー (50 mM MES バッファー、pH 6) とコラムを平衡させ。
9. 明らかにしロード ライセート事前釣合い列、洗浄バッファー内の流れが明確になるまでの ∼10 ベッド ボリュームで洗う。
10. 溶出型 TET2 0-100 を使用して 15 ベッド ボリュームで溶出バッファー (50 mM MES バッファー、pH 6、1 M 塩化ナトリウム) に洗浄バッファーから % の勾配に続いて 2 ベッド ・ ボリュームの 100% 溶出バッファーで保持します。
    注: 細胞ライセート列と共にすべての溶出画分の読み込み前後のサンプル (各 100 μ L) を収集し、10 %sds ページの解決に分析します。
11. TET2 蛋白質を含む画分をプール、凍結乾燥、水 10 mL、-80 ° C の店で酵素パレットをディゾルブ

2. 5mC TET2 ジオキシゲナーゼによって酸化

1. 基板 (25 mer 二本鎖 DNA,表 2) 3 μ g と 3 通すべて脱メチル化反応を行います。
   1. 50 mM HEPES (pH 8.0)、200 μ M FeSO₄、2 mM 2OG を含む全反応バッファーの 50 μ L 加えて精製 TET2 酵素の 100 μ g (2-オキソグルタル酸/α-ケトグルタル酸) と 2 mM アスコルビン酸 1 h²¹の 37 ° C で孵化させなさいと。
   2. 500 ミリメートルの EDTA の 5 μ L 型 TET2 触媒酸化反応を抑制します。
2. TET2 反応を焼入れ後オリゴ浄化列を使用して型 TET2 反応混合物から DNA を分離することでクロマトグラフィー-タンデム質量分析のためのサンプルを準備します。
   1. 急冷反応の 55 μ L にオリゴ結合バッファーの 100 μ L を追加します。
   2. この後、100% エタノールの 400 μ L を混合物に追加します。オリゴ バインド] 列この混合物を渡します。
   3. 750 μ L 洗浄バッファーにバインドされた DNA を洗浄し、20 μ L の水に溶出します。
3. DNase の 2 ユニットと分離された DNA を消化私と 12 h 37 ° C で S1 ヌクレアーゼの 60 単位個々 のヌクレオシド monophosphates を生成します。
4. 次の消化、サンプルでふくらはぎ小腸アルカリホスファターゼ (CIAP) の 2 台を追加し、またヌクレオシドを取得するヌクレオシド monophosphates からターミナル隣酸塩グループを削除する 37 ° C で 12 時間インキュベートします。
5. すべてヌクレオシド、以下 LC ・ MS/MS メソッドを使用して、特に変更されたシトシンを定量化します。

3. 定量的 LC MS/MS による分析法の開発

1. すべての変更されたシトシン ヌクレオシド [5-メチル-2-デオキシシチジン (5mdC)、5-ヒドロキシメチル-2 '-デオキシシチジン (5hmdC)、5-ホルミル-2'-デオキシシチジン (5fdC)、および 5-カルボキシメチル-2 '-デオキシシチジン (5cadC)] の 100 μ M 原液を準備し、正常な DNA 塩基 (アデニン、チミン、シトシン、グアニン ・ LC ・ MS/MS 法の開発のための HPLC 級水で。
2. 1 つずつ原液を注入してヌクレオシドに依存する MS/MS パラメーターを最適化し、EMS で 10 μ L/分の流量で質量分析計のスキャン モード。次のパラメーターを最適化: 定量の最適化を自動化された各 DNA ヌクレオシドを用いた衝突セル出口潜在的な (CXP)、衝突エネルギー (CE) 衝突携帯入り口潜在的な (CEP) (EP) 入り口潜在的なポテンシャル (DP) ・ デクラスタ リングソフトウェアの特徴です。
3. グラデーションを用いた溶媒は 10 mM 酢酸アンモニウム (pH 4.0)、溶剤 B が 20% アセトニ トリルと 10 mM 酢酸アンモニウム (pH 4.0) の 0.3 mL/min の流量で 25% 溶剤 B 原液の 10 μ L 注入してソース依存 MS/MS パラメーターを最適化します。次のパラメーターを最適化: カーテン ガス (CUR): 10-50、温度: 0-600 ° C、ガス流 1 (GS1): 0-50、ガス流 2 ([gs2]): 0-50, 活性化解離 (CAD): 低、中、高、イオン スプレー電圧 (IS): マニュアルを使用して各 DNA ヌクレオシドの 4000 5500FIA (流れ分析) モードでソフトウェアの定量的な最適化機能。
4. すべて 8 DNA 核酸を分離する実行次のグラデーションを用いた液体クロマトグラフィー: 0% 溶剤 B (0-2 分)、0 20% 溶剤 B (2-5 分)、20-60% 溶剤 B (5-9 分)、60-0% 溶剤 B (9 ~ 10 分)、溶媒 0.3 の流量で 5 分間の平衡とC18 カラム mL/分 (粒径: 5 μ m、細孔のサイズ: 120 Å)。
5. 応答の直線性、検出 (LOD) の制限と定量化 (LLOQ) を使用しての下限を決定するパラメーターを使用して、最適な MS/MS (ステップ) 上記の液体クロマトグラフィー グラデーション (ステップ 3.4) と相まって、すべての 8 つのヌクレオシドを含む 100 μ M 標準混合物のシリアル希薄を 2 倍。すべて 8 DNA ヌクレオシドの標準曲線を描画します。
6. 検出し、すべてヌクレオシド、特に変更されたシトシンステップ 2.4 LC MS/MS 法と標準曲線を使用して生産を定量化します。

Results

テト家族 dioxygenases による DNA の 5mC の動的な変更は、エピジェネティックな転写で重要な役割を果たしています。TET2 ジオキシゲナーゼ頻繁様々 な造血器腫瘍¹²で変異します。正常な発達と病気 TET2 酵素の役割を調べるためには、pDEST14 ベクトル²²に任意の親和性タグなしその最小限の触媒活性ドメインをクローンします。タグの付いていない型 TET2 ジオキシゲナーゼは細菌の SDS-PAGE 解析による全可溶性タンパクの ∼5% で生産されたエシェリヒア属大腸菌BL21 (DE3) 細胞。TET2 の触媒ドメインはほとんどの先住民族大腸菌タンパク質^24,25,26, 陽イオンを利用した効率的な精製プロセスと比較して比較的高い等...

Discussion

TET2 遺伝子の変異は、多様な造血器悪性腫瘍患者で最も頻繁に検出された遺伝子の変化の一部です。異なる型 TET2 の変異があり、ナンセンス、フレーム シフト、ミスセンス変異が含まれ、数百日に患者¹²で識別されています。TET2遺伝子変異を有する患者は、wt 型 TET2¹⁴とのそれらと比較して骨髄でゲノム 5hmC の低レベルを示します。変異型 TET2ノックアウトの実験が transfected セル¹⁴5hmC 濃度に対するこれらの突然変異の効果を締めくくっています。TET2 ノックアウト マウス モデルから型 TET2 酵素のレベルが造血器腫瘍^17,18,19,20の進行に反比例することを示した。一...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPES	カルボシンス	鉄FH31182
(II)硫酸塩七水和物	Sigma-Aldrich	F8633
&α;-ケトグルタル酸(2-オキソグルタル酸)	Sigma-Aldrich	K1750
L-アスコルビン酸	Sigma-Aldrich	A4544
チレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物	Sigma-Aldrich	E5134
酢酸アンモニウム	Sigma-Aldrich	A1542
アセトニトリル	フィッシャー・サイエンティフィック	75-05-8
HPLC グレード水	フィッシャー・サイエンティフィック	7732-18-5
オリゴ・クリーン・コンセントレーター	ザイモ・リサーチ	D4061
DNAse I	ニューイングランド・バイオラボ	M0303S
S1 ヌクレアーゼ	Thermo Scientific	ENO321
CIAP(子牛腸内アルカリホスファターゼ)	New England Biolabs	M0290S
LB Media	Affymetrix	J75852
IPTG	Carbosynth	EI05931
MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate]	Carbosynth	FM37015
Nadium chloride	Fisher科学	7647-14-5
のグリセロール	ΣAldrich	G7893
SPのセファロー	ス フィッシャー科学的な	45-002-934
2'-デオキシ-5-メチルシチジン	TCI	D3610
2'-デオキシ-5-ヒドロキシメチアルシチジン	TCI	D4220
2'-デオキシシチジン-5-カルボン酸、ナトリウム塩	ベリーアンプ;アソシエイツ	PY 7593
5-ホルミル-2'-デオキシシチジン	ベリー &アソシエイツPY	7589
2'-デオキシシチジン	ベリー&アソシエイツ	PY 7216
2'-デオキシアデノシン	カルボシンス	ND04011
2'-デオキシグアノシン	カルボシンス	ND06306
2'-デオキシチミジン	VWR ライフサイエンス	97061-764
ゲートウェイ技術	サーモフィッシャー	11801016
ベックマン アレグラ X-15R 遠心分離機	ベックマン・コールター	392932
ソニック・ディメンブレーター550	フィッシャー・サイエンティフィック	XL2020
ÄKTA FPLCシステム	Pharmacia (GE Healthcare)	18116468
FreeZone 4.5凍結乾燥システム	Labconco	7750020
Zymo Oligo精製カラム	Zymo Research	D4061
BDS Hypersil C18 カラム	Keystone Scientific, INC	105-46-3
3200 Q-Trap 質量分析計	AB Sciex
HPLC	島津製作所HPLC
XK16/20 FPLCカラム	ファルマシア(GEヘルスケア)	28988937