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方法論記事

無菌状態で小さな分子に対する植物の反応を評価するための柔軟な低コスト化の養液栽培システム

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DOI：

10.3791/57800

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2018年8月25日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Brazilian Bioethanol Science and Technology Laboratory (CTBE), Brazilian Center for Research in energy and materials (CNPEM), 2University of Campinas (UNICAMP), 3University of Viçosa (UFV), 4CTBE, CNPEM, 5Brazilian Bioethanol Science and Technology Laboratory (CTBE/CNPEM), Max Planck Partner Group

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

単純な汎用性、および低コストの in vitro水耕システムが正常に最適化されて、無菌条件下で大規模な実験を有効にします。このシステム ソリューションと分子、生化学的、生理学的研究のための根の効率的な吸収に化学物質のアプリケーションが容易になります。

要約

プラント生物学の研究の広い範囲は、養液栽培のカルチャを使用して実行されます。この作品は、化学薬品および興味の他の物質に対する植物の反応を評価するために設計された体外水耕成長システムが表示されます。このシステムは、それぞれ C3および C4モデル種シロイヌナズナとエノコログサ、均質な苗を得ることに非常に効率的です。無菌栽培は、水耕栽培で植物通常成長のための制限要因が知られている藻類や微生物汚染を回避できます。さらに、このシステムは拡張性が高く、必要な場合、マイナーの機械的損傷と大規模な植物材料の収穫として植物の個々 の部分の収穫を有効にします。植物の成長のための主要なプラットフォームとしてピペット ラックを使用して、このシステムが簡単で低コストのアセンブリをしているを示す詳細なプロトコルを提供しています。このシステムの有効性は、薬 AZD-8055、ラパマイシン (TOR) キナーゼ ターゲットの化学阻害剤の効果を評価するためにシロイヌナズナ実生植物を使用して検証されました。効率的に、根およびシュートの AZD 8055 治療後 30 分も早く TOR 阻害が検出されました。さらに、AZD 8055 扱われる植物には、予想される澱粉過剰表現型が表示されます。一般に、高価な使用を必要とする同位体標識化合物を用いた代謝フラックスの評価として植物の研究者の植物誘導や阻害剤、同様の行動を監視することを目指しての理想的な方法としてこの養液栽培システムを提案試薬。

概要

水耕栽培を使用して成長する植物の利点は、再現実験1,2,3を有効にして制服の植物の生産に広く認識されています。このシステムで養液の組成が正しく制御して、植物の成長と開発のすべての段階に沿ったリサイクルします。さらに、根が栄養飢餓と水欠乏4などの土壌で栽培した植物で起こることができるよう、非生物的ストレスにさらされない。栽培土壌で培養したものにかなり似ている水耕存在形態および生理的特性、としてこのシステム広くで採用されている研究ルート/生長と収穫なしの監視できるので怪我2,5。

水耕条件を用いた研究のほとんどはマイクロ ・栄養素1,3 の機能を特徴づける行った組成と栄養液の濃度を変更する可能性があるため、6,7,8。ただし、このシステムは、植物生物学、ホルモンと植物の化学物質の機能を解明するようなアプリケーションの広い範囲に非常に有用であること証明しています。例えば、水耕栽培条件下でホルモン9とブラシノステロイド アプリケーション10によって引き起こされる加速成長表現型の新しいクラスとしてのストリゴラクトンの探索を行った。さらに、このシステムによりラベル付けされた同位体を用いた実験 (例えば、 14N/15N、 13CO2)11,12蛋白質および代謝物質の混入を評価するにはによって質量分析法。

、植物の研究にこのシステムの重要性を考慮した養液栽培文化の数が多いは、水耕容器3,プレートから苗の転移を使用して (i) システムを含む、ここ数年で設計されている13;(ii) ロックウール ルート開発2,14,15; の初期段階へのアクセスを制限します。(iii) ポリエチレン顆粒小分子/治療困難な16の同種のアプリケーションとなる浮体としてまたは植物9,17の (iv) 短縮番号です。これらのプロトコルの多くに記載されている水耕タンクのボリュームは通常大きい (最大 32 L 1-5 L に至る小さなボリューム)18、化学物質のアプリケーションを非常に高価になります。いくつかの研究を行う無菌条件8,の下での水耕栽培を記述する19システムの組み立てはかなり骨の折れる、プラスチックやガラスにナイロン メッシュの完璧な調整から成る、通常コンテナー5,8,17,20。

モデル植物シロイヌナズナの重要性、による水耕栽培システムの大部分この種1,2,8,14,18,用に設計されました。19,20. それにもかかわらず、他の植物種の種子の発芽を改善するために前処理の水耕成長機能を報告するいくつかの研究がある、同期率の in vitro8,16.大規模なために、シロイヌナズナや草猫じゃらしなどの他の種を含む植物の成長のための滅菌条件を可能にするシンプルで低コストのメンテナンスの養液栽培システムを設定するためのプロトコルを開発しました。viridis。ここで説明する方法は、苗の生長は最大化、同期、および簡単に監視、別の実験に適しています。さらに、このシステムとして多くの利点: (i) そのアセンブリは簡単で、そのコンポーネントを再利用できます。(ii) 異なる化学物質を液体培地に簡単に適用を可能します。(iii) 苗発芽し、水耕栽培システムに転移を必要とせず培養培地で直接育つ(iv) のシュートと根発達・発育を密接に監督することができ、損害なく苗を収穫しています。(v) それを行うと大きなスケールで動作する生理学的な条件を維持します。

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プロトコル

1. 液体と固体培養基の準備

  1. ビタミン [コバルト (ii) 塩化物五水和物の 0.0125 mg/L, 銅 (ii) の硫酸塩五水和物の 0.0125 mg/L, 18.35 mg/L エチレンジアミン四酢酸鉄ナトリウム、3.10 mg/L の半分強さ培地、培 (MS) 媒体を用いた液体培地を準備します。ホウ酸、ヨウ化カリウム、マンガンの 8.45 mg/L の 0.415 mg/L 硫酸塩一水和物、ナトリウム モリブデン酸二水和物、硫酸亜鉛七水和物、塩化カルシウム、950 mg/L のリン酸二水素カリウム 85 mg/L の 166.01 mg/L の 4.30 mg/L の 0.125 mg/L0.25 g/L を添加した硝酸カリウム、90.27 mg/L 硫酸マグネシウムの 825 mg/L 硝酸アンモニウムのグリシンの 1 mg/L、ミオ-イノシトール 50 mg/L、0.25 mg/L のニコチン酸、ピリドキシン塩酸塩 0.25 mg/L とチアミン塩酸塩 0.05 mg/L]MES の 10 M コで 5.8 に pH を調整します。
  2. 10 g/L の半分強 MS 固体培地に寒天を追加します。オートクレーブを使用する前に 20 分の 121 ° C で媒体。

2 組立養液栽培システム

注: これらの手順は、養液栽培システムを構築する綿密従ってください。

  1. 材料の殺菌
    1. オートクレーブ バッグにピペット チップ minitanks として使用されます (カバー) なしでラックをパックします。オートクレーブで 121 ° C、20 分、15 psi ラック。
      注: を用いてポリプロピレン ピペット チップ ラックがあった次の寸法: 120 mm (長さ) × 89 mm (幅) × 55 mm (高さ)。ピペット先端平面培地添加のための領域が必要です。その他のヒントのラックに対応できる (材料の表を参照してください)。
      注: 養液栽培システムの組み立て手順、全体必要があるきれいにおよび使用する前に 70% エタノールで消毒が必要な層流フードを使用して実験者が実験用の上着を着用、手を洗う必要があり、公開、皮膚、70% エタノールで消毒します。手袋は、新薬承認申請以外は、省略可能です。
    2. 上記 (使い捨てのプラスチックの箱、粘着テープ、ピペット、はさみ、ピンセット) 70% エタノール層流フードに入る前にすべての付属品をきれいに。フードを許可する場合は、除染作業領域を維持するために養液栽培システムの組み立て前に 10 分間 UV ライトを点灯します。
  2. Minitank 組立
    1. 粘着テープ (図 1 b) とフラット ピペット チップの上面をシールします。可能であれば、それを残す UV の下で 10 分間光。
    2. まあマルチ チャンネル ピペット (図 1) を使用してそれぞれに溶けた固体 MS 培養液 (やや暑い) 180 μ L を追加します。
      注: 多くのタンクを準備するときは、MS 培地が凝固するを防ぐためにホット プレートを使用します。
    3. 完全に (約 30 分) の固化に許可します。
      注: 凝固期間 UV 光オンにできます。
    4. 液体 MS 培 (図 1) と完全にピペット チップ ラックをいっぱいにし、固体と液体のメディアと密接な接触があることを確認します。
    5. フラット ピペット チップの上面の粘着テープを外し、慎重にラックに収まるように。養液栽培システムは、滅菌の種子を受信する準備ができました。

3. 種子殺菌

  1. 1.5 mL マイクロ チューブに 500 のシロイヌナズナ種子を配置します。実験に必要な植物の数に応じて必要な多くのチューブを使用します。
  2. 穏やかな攪拌と 2 分のための 70% のエタノールで種子を洗浄します。種子は、落ち着くし、エタノールを慎重に削除しましょう。
  3. 10% 次亜塩素酸ナトリウム溶液 2 μ L ポリソルベート 20 洗剤の 1 つの mL を追加します。慎重に 5 分削除ソリューション ソリューションを扇動します。
  4. すべての漂白剤残留物は完全に削除 (約 5 倍) までの種子を滅菌蒸留水をすすいでください。
    注: 表面滅菌後種子滅菌蒸留水に浸漬され、発芽を同期に 5 d のため暗闇の中で 4 ° C で成層します。
    注:エノコログサ(加盟 A10.1) の種子エレクトロポレーション (物理の休眠状態を壊す) に 15 分間、濃硫酸、滅菌蒸留水で洗浄され、5% 次亜塩素酸ナトリウム溶液と disinfested穏やかな攪拌21分 0.1% ポリソルベート 20 を含みます。残りの滅菌手順シロイヌナズナ種子の説明したものと同一であった。

4. seed アプリケーション

  1. 生殖不能のメスの助けを借りて 200 μ L チップの先端を少しカットします。
  2. フラット ピペット チップの上面に固体培養基にシロイヌナズナ種子をピペットします。世話を媒体がフラット; から緩和しませんそれ以外の場合、種子が日陰になるし、苗はきちんと育たない (図 1E)。
    注: は、(上向きに配置されている胚) とセタリア種の滅菌ピンセットを使用します。
  3. できるだけ高い湿度を維持し、環境微生物 (図 1 階) から自由に使い捨てのプラスチック製のボックスの内部に多くの minitanks を格納します。
  4. 汚染を避けるため、粘着テープを使用して徹底的に使い捨てのプラスチック製のボックスを封印します。
  5. 興味の植物の適切な成長条件で生育室に水耕システムを配置します。
    注: この作業で次の条件を用いて: 湿度 75% と 150 µmol m-2の-1の照度と彼岸条件 12 h 光 (21 ° C)/12 h 暗い (19 ° C)シロイヌナズナ、または 300 µmol m-2の-1の放射照度と 12 h 光 (28 ° C)/12 h 暗い (25 ° C)セタリア(図 1と1 H)。

5. ラパマイシン標的キナーゼ ターゲットを抑制するこの養液栽培システムの使用を検証します。

注: この養液栽培システムに一般に、大規模な実験に適用される非常に高価な植物化学物質の管理を容易にするために開発されました。シロイヌナズナコロンビア 0 (苗の TOR 活動の抑圧に採用された ATP 競合阻害 AZD-805522TOR 蛋白質キナーゼの ATP 結合部位を標的に知られている概念の証拠としてノッティンガム シロイヌナズナ ストック センター、NASC ID: N22681)。ここでは、使用するプロトコルを概説する.

  1. 種子の成長水耕、BBCH に従ってステージ 1.04 スケール (約 11 d) の23まで上記の気候条件の下で。新鮮な媒体含む 0.05 %dmso (コントロール)、2 μ M のいずれか栄養ソリューションを置き換える AZD-8055 (TOR 阻害剤) 夜 (EN) の終わりに、DMSO にまたは治療 (もどき) なしを希釈します。
  2. 治療後異なる時点でいくつかの苗を収穫し、根と芽を区切ります。液体窒素でサンプルを凍結、ロボットのグラインダーで粉に挽く (材料の表を参照)、使用まで-80 ° C で粉体を保存します。
  3. リン酸化及び非リン酸化のフォームに対して 40 代リボソームタンパク質 S6 (RPS6) Dobrenelらによるとイムノブロット24。
  4. サンプル脱色のためそのまま苗を漂白剤、蒸留水で洗って、5 分で25、ヨウ素溶液に浸って、実体顕微鏡 (目的、20 x の近似、および x マグニチュード 7.5 X 0.63) 苗写真、澱粉含量の定性的な評価。
  5. 次リリースのグルコースの測定と酵素分解のオンカラム NADPH26,27に NADP+の減少にそれを結合することによって澱粉を定量化します。
  6. 総 RNA の抽出、cDNA 合成を行い、定量的 PCR の試金の Caldanaらによる記述で28応力の種類に関連する遺伝子の発現レベルを評価します。
  7. 必要に応じて、[湿度 60%、150 µmol m-2の-1 、放射照度と同様の気候条件の彼岸 12 h 暗い (19 ° C/12 h 光 (21 ° C) の下で 0.1 L の容量を持つプラスチックの鉢園芸基板上苗を育てる)] 水耕栽培実生植物とそれらを比較するために。
    注: ターゲット遺伝子の遺伝子発現アッセイに使用されたABF3 (At4g34000)、 ASN1 (At3g47340) とTPS5 (At4g17770) とその表現のレベルを使用してデルタ Ct 法29を用いた正規化されました。ACT2 (At3g18780) またはPDF2 (At4g04890) として内部参照の遺伝子のすべてのサンプルの PCR 増幅効率 100% と仮定すると。量的な PCR 用オリゴヌクレオチド ペアだった: ABF3 (GTTCTCAACCTGCAACACAGTGC;TCCAGGAGATACTGCTGCAACC)、 ASN1 (AGGTGCGGACGAGATCTTTG;GTGAAGAGCCTTGATCTTGC)、 TPS5 (CTGCTCTGATGCTCCTTCTTCC;AAGCTGGTTTCCAACGATGATG)、 ACT2 (CGTACAACCGGTATTGTGCTGG;CTCTCTCTGTAAGGATCTTCATG) とPDF2 (TAACGTGGCCAAAATGATGC;GTTCTCCACAACCGCTTGGT)。

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結果

TOR キナーゼは、栄養素と細胞増殖とすべての真核生物の成長を促進するシグナル伝達のエネルギーを統合する主要なレギュレータです。植物の TOR の機能を解明する努力にはシロイヌナズナ形質転換行 TOR によって RNA 干渉または人工マイクロ Rna28,30,31, 条件付き抑圧の世代が含まれてTOR ノックアウト植物32,33,34,35の胚致死表現型を与えられました。エストラジ オール-制御の下で条件付きの形質転換線のほとんどは、この養液栽培システムの使用するデキサメタゾンまたはエタノール誘導性プロモーター、ま...

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ディスカッション

この最適化された水耕構造により、植物の培養成功文化です。ピペットの先端フラット面に固体媒体、種子の培養液に浸したシステムと比較するとかなり利得にも種子が発芽します。このシステムの大きな利点は、実生植物の開発の間に根が転移を必要とせず液体培地と接触して直接得ることです。さらに、減らされた容積の液体媒体の化学治療を簡単に適用できます。湿度が高く、栄養解決とその補充の蒸発を避けるが保たれます。また、均質な成長と発展、苗の中には簡単に得ることが、この発達段階1,10,18 で小型タンク、苗を操作するとき、通気は必要ありません。.システムが汚染物質から完全に自由であることを保証するために重要なステップは、そのアセンブリの中に使用されるすべての材料の滅菌と集中ケアです。オートクレーブ (例えば、使い捨てのプラスチックの箱) のいくつかのコンポーネントを殺菌する不可能性のためは、最初 70% エタノールをオフにし、使用する前に紫外...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この仕事に支えられ、サンパウロ研究財団 (FAPESP;12/19561-0 を付与) とマックス ・ プランク。エリアス F. · アラウージョ (FAPEMIG 14/30594) カロライナ C. モンテ ・ ベロ (FAPESP;グラント 14/10407-3) ヴァレリアネーダー マフラ (FAPESP;グラント 14/07918-6)、ヴィヴィアン C. H. ダ ・ シルバ (岬/CNPEM 24/2013) フェローシップを感謝しています。著者は、RPS6 に対する抗体を気前よく提供するため Institut ジャン ・ ピエール Bourgin (INRA, ヴェルサイユ, フランス) からクリスチャン ・ マイヤーをありがとうございます。著者に感謝 RTV UNICAMP、Ed サンパウロ Aparecido デ · ソウザ マノエル オーディオ中にテクニカル サポートのための記録。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
エタノールメルク100983
次亜塩素酸ナトリウム溶液Sigma-Aldrich425044
ポリソルベート 20  Sigma-AldrichP2287
Murashige and Skoog (MS) medium including vitamins Duchefa BiochemieM0222
2-(N-morpholino)エタンスルホン酸(MES)一水和物Duchefa BiochemieM1503
寒天 Sigma-AldrichA7921
水酸化カリウムSigma-Aldrich484016
層流フードTelstarBH-100
ホットプレートARECF20510011
成長チャンバーWeiss TechnikHGC 1514
ガラスシャーレ (150 mm x 25 mm)Uniglass189.006
200 &ミュー;Lピペットチップラック カスヴィK8-200-5 ※
300 &LマルチチャンネルピペットEppendorf3122000060
300 μLピペットチップEppendorf30073088
200 μLピペット エッペンドルフ3120000054
200 μLピペットチップエッペンドルフ30000870
ハサミTramontina25912/108
ピンセットABC Instrumentos702915
メスブレードSigma-AldrichS2771
粘着透明テープ (45mm x 50m)スコッチ 3M5803
使い捨てプラスチックボックス、外形寸法:353 mm (L) x 178 mm (W) x 121mm (H)マキシパック32771

参考文献

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