生体内で肝細胞癌の開発の間葉系幹細胞シートの可能性を探る

サマリー

ここでは、細胞シート技術を用いた生体内で癌モデルを開発するためのプロトコルを提案する.このようなモデルは、抗癌剤治療の評価のため非常に役に立つかもしれない。

要約

ひと癌を模倣した生体内で動物モデルは、重要な臨床情報を提供するさまざまなアプリケーション可能性があります。生体内で癌モデルの開発に現在使用されている技法には、かなり制限があります。したがって、本研究では生体内で癌モデルを開発する細胞シート技術の実装を目指します。肝細胞癌 (HCC) は肝細胞から作成した細胞シートを用いた裸のラットの開発に成功。細胞接着、細胞外マトリックスによって制御される、層状構造の形成を介して癌細胞シートが生成されます。HCC シート移植肝臓に月内担癌動物モデルの作成が可能になります。さらに、この癌モデルの開発の間葉系幹細胞 (MSC) の役割を検討しました。肝細胞癌細胞ライン シートに加えて別の 2 つの細胞シートを作成: 肝細胞癌細胞、骨髄 MSCs (BMMSCs)、肝細胞と臍帯 MSCs (UCMSCs) のシートのシート。肝細胞癌細胞と MSCs の両方の組み合わせを持つシートは、担癌動物を作り出すことができます。MSCs を追加形成された腫瘍のサイズが減少し、この腫瘍の開発に悪影響を与える使用の MSCs のソースによって異なります。これは腫瘍の管理とコントロールの特定の MSC のサブタイプの細胞シートを利用できることを示します。

概要

肝細胞癌は予後に有意関連付けられている肝臓の癌です。毎年、ほぼ 50万人新規患者は、肝細胞癌、肝細胞癌患者世界¹の 85% を表すと診断されます。発癌ではない単一フォーム病気;むしろ、それはコレクションに加え別の病理組織学的特徴と遺伝子およびゲノム変動している病気の予後の結果¹を様々 なです。したがって、肝細胞癌に対する有効な治療戦略の開発の主な課題は、肝細胞癌の生物学の限られた知識とこの複雑な病気の理解を助けることができる適切な実験動物モデルの欠如です。ひと癌を模倣した生体内で動物モデルは候補者の遺伝子を選択し、関与する癌の応答に影響を及ぼすさまざまな要因を調査するためだけでなく、癌を誘発、予後/予測マーカーを識別するために必要です治療上のエージェント。

In vitro癌研究はまだ主要な制限に関連付けられます。これは、がん細胞は文化で維持されるとき体内の機能の多くを失うためにです。前のヴィヴォ設定全体組織生理学の不在から細胞培養結果に発生する変更。がん細胞間相互作用(上皮間質、免疫、血管系等)内腫瘍微小環境はがん細胞の特性²に大きく反映されます。がん微小環境はがん細胞遺伝子・ タンパク質発現と血管新生に対する抑制と転移ポテンシャルに加えての表現型特性を変えることができます。文化システムの in vitro二次元 (2 D) は、腫瘍の進行を調節するために必要な適切な組織のマトリックスを欠いています。したがって、これらの制限のためは、 in vitroモデルの予備調査結果をサポートする体内モデルを利用する必要がありますは常にあります。この研究では、細胞シート技術を使用して、HCC の基になる完全な生物学的プロセスを解明する生体内で動物モデルを開発します。

10 年以上前、岡野の研究所は、細胞シート技術³に基づく組織工学の手法を設立しました。この手法は、表層の疎水性を制御することにより可逆的な細胞接着/脱着できるように熱応答性培養プラスチックを採用しています。このメソッドでは、手入れの行き届いた細胞外マトリックス (ECM) と細胞間相互作用に、そのまま立体 (3 D) 形式 (i.e.,cell 枚)、培養細胞の穏やかな収穫ができます。細胞シート技術は、商業的に使用可能である (ピパよ)、温度応答性高分子 poly(N-isopropylacrylamide) の培養皿のプレコートを必要があります。20 ° C の下の温度、ピパよポリマー水和し、高い温度 (37 ° C) でポリマーが脱水状態になるし、濁水沈殿物に変換に対し、水溶液に溶解します。ポリマーは親水性のアミド チェーンと疎水性側鎖 (イソプロピル グループ) に含まれます。一方、水和構造の内訳のイソプロピル グループと疎水性イソプロピルのグループを囲む水の分子を集約低温で高温で水の分子のブラウン運動が激化は疎水性相互作用のためしたがって、ポリマーの全体の鎖は集計し、⁴を析出します。

本研究では 3 つの異なる細胞シートを用いた肝細胞癌の動物モデルの開発にこの手法を採用します。採用されている最初のシートから成って肝細胞のみ、他の 2 つのシートから成っている肝細胞と 2 種類のソースからの MSCs の組み合わせに対し: 骨髄 MSCs (BMMSCs) と臍帯 MSCs (UCMSCs)。MSCs は、非造血細胞脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋⁵を含む、間葉系の系統の intocell 誘導体を区別することができます。これらの細胞を用いてがん細胞シートを作成するときの理由は、癌に及ぼす MSCs 矛盾したレポートです。MSCs が 2 つの異なる表現型を持つことが示唆されている:"MSC1"、炎症性表現型と「MSC2」、免疫表現型⁶。MSCs は、toll 様受容体 (Tlr) を表現します。MSCs の TLR4 プライミングは、TLR3 プライミング⁶免疫抑制因子の分泌を増加させるに対し、炎症性因子の分泌を増加します。これらの 2 つの表現型の体外研究報告 MSC2 共同文化があった反対の効果⁷MSC1 の癌細胞との共培養減衰、がん細胞の成長であること。これは、MSCs はプロがんや抗がん剤、その表現型によってできることを関係づけます。したがって、細胞シート技術を用いた肝細胞癌の動物モデルの開発に加えたい MSC 移植の腫瘍の開発に及ぼす影響を探索するかどうかこれらの細胞を使用して高めるか、または減らすこのモデルの開発と。

プロトコル

プロトコルは、キング サウド大学倫理委員会の動物のケアのガイドラインに従います。動物で使用される他の薬、麻酔薬、外科的処置は、キング サウド大学倫理委員会で承認されます。すべての作品は、適切に訓練された人員によって実行されます。

1. 細胞シート工法

1. 原液ウシ胎児血清 (FBS) で培養皿 (3.5 cm 温度応答性培養皿) をコートし、料理のすべての面をカバーすることを確認します。
   注: この手順は、単層の細胞の成長をサポートし、細胞凝集を防ぐことができますので細胞シートの剥離のために重要です。
2. 5% CO₂と 95% 空気の入った加湿雰囲気で 37 ° C で 24 時間の料理を孵化させなさい。
3. コーティングの料理から余分な FBS を削除し、少なくとも 1 時間 (RT) 室温で乾燥する料理を許可します。
4. 3 つの細胞懸濁液を準備: 1 x 10⁶ HepG2 細胞、BMMSCs、1 x 10⁶ HepG2 細胞および UCMSCs (BMMSCs と UCMSCs の両方の 4:1 の比率) で 1 × 10⁶ HepG2 細胞。
5. それぞれのラベルの付いた皿に適切な細胞懸濁液をシードします。
6. 10 %fbs と 1% ペニシリン/ストレプトマイシン添加 DMEM 培養液中のすべてのセルを停止します。
7. 37 ° c 5% CO₂と 95% 空気の入った加湿雰囲気でセルを孵化させなさい。

2. 細胞シートの剥離

1. 100% セル合流、37 ° C の定温器から料理を取る。
2. HepG2/BMMSC と 5% CO₂と 95% 空気の入った加湿雰囲気で 20 ° C で 30 ~ 40 分の HepG2/UCMSC 細胞シート料理を抱卵中の常温では、1 h の HepG2 細胞シート皿を孵化させなさい。
   注: hepg2 細胞のみから作った細胞シートは壊れやすいです。シートの構造への損傷を引き起こす 20 ° C に温度を下げます。

3. 手術の手順のパフォーマンス

注: 細胞シートの剥離の培養時間の間に、動物のプロシージャを開始します。

1. 外科領域の準備について
   1. フード、キャビネット、層流無菌手術室など、研究室内滅菌の別の領域ですべての手術を行います。外科領域のすべてのサーフェスが非多孔性、密封された、耐久、そして墨であることを確認します。
   2. ボディス クラブ、手袋、マスクをつけた、頭と靴カバーなど、適切な保護具を着用します。
   3. 手術使用ツールは清潔で滅菌 (オートクレーブ経由; 高圧飽和幹) 初めに手術。
   4. ラット間の手袋を変更します。
2. 動物の手術のための準備
   1. 8-12 週齢裸ラットを使用します。
   2. 注射麻酔ラットを作成します。
      1. 麻酔ソリューションを準備するには、ケタミン ・ キシラジン、ケタミンの 2 mL、キシラジン (20 mg/mL の濃度) での 1 mL、1 mL の滅菌生理食塩水 (例えば0.9% 塩化ナトリウム) 滅菌 10 mL の血清コレクション バイアルをミックスし、前によく振って使用します。
      2. 麻酔を適用するには、ラットの体重 100 g 当たりケタミン ・ キシラジン溶液 0.2 mL を腹腔内注入します。
         注: ソリューションの総投与量は 100 mg/kg のケタミン ・ キシラジンの 10 mg/kg です。
   3. 手術部位から目に見える汚れやごみを削除します。
   4. ペダルの逃避反射 (両方の後部のフィートの足パッドのピンチ) をテストすることによって麻酔の深さを確認します。
      注: 足パッドのピンチには、応答が発生した場合 0.05 mL/100 g (約は 30 分毎)、用量で繰り返し、麻酔の深さを再確認します。
   5. ポビドン ヨード/イソプロパノールして 2 段スクラブで切開部を消毒します。
   6. 切開の汚染を避けるために滅菌ドレープでラットをカバーします。
   7. ブプレノルフィン (0.01 - 0.05 mg/kg) とラットの皮下挿入⁸切開をする前に。
   8. 生殖不能のメスを使用して、7-に 10 センチ皮と肝を公開するための基礎となる筋肉のカットを作る。
      1. メスのフラット バックの端と皮膚から腹部の筋肉を分離します。
      2. 慎重に刺して、 linea albaメスを使用して鋭いハサミでカットを拡張します。

4. 細胞シート移植

メモ: 肝臓の細胞シート移植は実行されます。

1. 培養皿の細胞シートを収集します。
   1. その面からシートをデタッチするベンチの上培養皿を軽くたたきます。
   2. 滅菌ピペット チップを使用して半円形でシートの端を削って、料理の面から細胞シートを区切ります。
   3. 優しく培養皿からすべてのメディアを削除します。
   4. シートが損傷; せずそのままを確認します。そうでなければ、することはできません (図 1) を使用します。
      注: 結果のシートは、目で直接検出できます。
2. お皿から細胞シートを収穫する無菌膜 (ろ紙) を準備します。
   1. まず、通常の生理食塩水を膜を浸します。滅菌綿パッドで過剰な生理食塩水を削除します。
   2. 細胞シートにシワや膜と細胞シートの間の空気の泡を回避しながらウェット膜を置きます。
   3. 膜とそれらを簡単に収集する細胞シートを食塩の数滴を追加します。
      注: 細胞シートを破損しないよう、冷たい生理食塩水を使用し、ない鉗子で膜と細胞シートを持ち上げます。
   4. 細胞シートは、膜に正しく接続されていることを確認するため、数秒間の膜を残すし、それを収集します。
3. 細胞シート移植肝を準備します。
   1. 滅菌コットンでやさしくタッピングによって肝臓の表面が乾燥していることを確認します。
   2. 滅菌鉗子を使用すると、細胞シートの膜をラットの肝の 1 つの葉にかぶせます。
   3. 滅菌生理食塩水を数滴を追加し、そこから細胞シートをデタッチする膜に穏やかな圧力を適用します。
   4. 慎重に膜を削除する前に 5 分待ちます。
      注: 細胞シートは肝臓に正しく接続されていることを確認するこれは。
   5. 最後に、基になる筋肉を閉じるし、5-0 ナイロン縫合糸で切開を皮膚します。
   6. ポビドン ヨードと手術領域を消毒します。
      注:図 2は裸のラットの肝臓細胞シート移植手順の図を示します。

5. 手術後のケア

1. 手術後すぐに共食いしたり、窒息を避けるために個別にラットの家し、それが定期的に (少なくとも 15 分) を監視する意識であり、完全に外来まで。
2. その後、合併症がないことを確認する, 5-14 d、5 d、少なくとも毎日のラットを評価します。毎日の評価中に、次のことを確認します。
   1. 傷口が閉じていると、縫合糸がきつすぎることがなく、そのまま。
   2. 過剰な熱などの切開部位に感染の兆候がない、腫れや膿の排出。
   3. 食料や水の消費を落ち込ませる、体重減少、脱水、皮膚テンティング、迅速かつ開いて口呼吸などの痛みに関連付けられている兆候はありません。手術後疼痛に適度な制御にあれば、注入ラット皮下ブプレノルフィン (0.01 - 0.05 mg/kg) と 48-72 時間の最小値のためのすべての 6-8 h⁹術後。

6. 移植領域の解析

1. Scarifice ラット移植後 1 ヶ月の移植領域を収集し、組織学的および免疫組織化学的解析。

結果

ラット移植細胞シートの腫瘍:

、移植後 1 ヶ月ラットの肝臓のすべての移植細胞シートは、腫瘍 (図 3) を開発しました。Hepg2 細胞 HepG2/BMMSC、UCMSC/HepG2 細胞シートから発達した腫瘍の平均のサイズは 4.5 cm、4 cm と 2.5 cm でそれぞれ¹⁰.

肝組織の組織学的解析:

ヘマトキシリンとエオシン (H & E) 染色非移植ラット肝細胞と肝が互いに吻合するプレートに配置され、核が 1 つまた...

ディスカッション

研究の豊富な量は、モデルの開発生体内で十分な前臨床動物人間癌のように取り組んでいます。現在、癌の動物モデルを作成するために使用の主要なアプローチは、遺伝子工学や細胞移植¹¹を含みます。遺伝子組み換え動物モデルは、同定と薬剤誘発性毒性発現の分子機構を理解することと同様、ターゲット遺伝子の検証のための良いツールです。しかし、このモデルはいくつかの制限に関連付けられて例えば、ある特定の遺伝子の変更行われないことで予想される表現型¹²。動物では、がんを誘発する細胞移植アプローチを使用してより一般的と癌細胞懸濁液の注入が含まれます。しかし、このシンプルで便利な方法も欠点があります。細胞懸濁液を生成するには、酵素消化手順は癌細胞を収穫する使用されます。移植細胞の生着効率を削減する接着性蛋白のいくつかの損失でこの結果します。したがって、移植した癌細胞が、腫瘍のサイズの制御の難しさはもちろんのこと、がん組織を構成し、保証はありません。さらに、このアプローチは、血液の循環や非標的臓器¹³に細胞の...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
<強い>試薬
FBS	Gibco/Invitrogen	10270106
DMEM高グルコース	シグマ	D5671-500ML
ペニシリン/ストレプトマイシン	ライフテクノロジー	15070063
無菌生理食塩水	Sigma	S0817-1GA
ヒト HepG2 細胞株	ATCC 米国	HB-8065
ヒト骨髄 MSC 細胞株	PromoCell、米国	C-12974
ヒト臍帯組織 MSCs	PromoCell、米国	C-12971
ケタミン 50%	ロンプン、バイエル
キシラジン 2%	ロンプン	23076-35-9
アルファジン® 解決。	リヤド・ファーマ	LBL0816
Disposables:
15mLポリプロピレン高クラリティPP遠心チューブ	ファルコン
3.5 cm 滅菌 UpCell 培養皿 フィルターペーパー (メンブレン)	グマ	174904-1CS
100-1000 & マイクロ;l  ピペットのヒント	シグマ	CLS4868-1000EA
ドレープ	サーモフィッシャー	PMD5293.0
備品
Plusピペット、可変容量	Eppendorf® 研究内容®	Z683779-1EA
組織培養インキュベーター 37 °C、5%CO2	任意のブランド
生物学的安全キャビネット	任意のブランド
組織培養インキュベーター20°C;C、5%CO2	任意のブランド
滅菌手術器具とヌードラット:
鉗子
はさみ
メス
ナイロン縫合糸 5-0	Accutome	AB-3854S	Monofilament, Lancet
1 ml Tuberculin Syringes	Fisher Scientific	14-826-88
ヌードラット	チャールズ川