小規模な比色試金の細胞内乳酸と線虫の線虫のピルビン酸

サマリー

変更された小規模な抽出と乳酸と線虫のピルビン酸の比色定量法について述べる線虫。商業アッセイ キットを利用するときの感度と精度の技術の開発が重要です。抽出の蛋白質の沈殿物は、細胞内の代謝物の定量法の最も重要なステップです。

要約

乳酸とピルビン酸は、細胞内のエネルギー代謝の鍵中間体です。細胞における乳酸/ピルビン酸比の変化は、ミトコンドリアの酸化的リン酸化と好気性解糖作用の間の加齢に伴うエネルギー代謝に不均衡があるかどうかを判断するのに役立ちます。ここでは、線虫モデル有機体の乳酸とピルビン酸の商業の比色アッセイ キットの使用率を表示します。最近、感度と比色/蛍光アッセイ キットの精度が大幅に改善されました研究試薬メーカーによる開発によって。改良された試薬は、線虫の 96 ウェル プレートでの小規模な試金の使用を有効にしています。一般的に、蛍光アッセイは感度よりも優れて比色試金;ただし、比色定量のアプローチは一般的な研究室での使用に適した。定量のためのこれらの試金のもう一つの重要な問題は、均質化のc. の elegansの蛋白質の沈殿物のサンプル。私たちのタンパク質の沈殿法、一般的な沈殿の (e.g。、トリクロロ酢酸、過塩素酸およびメタリン酸) サンプル調製に使用。無料の蛋白質の試金のサンプルは、均質化の中に直接冷たい鉛塩法 (最終濃度 5%) を追加することによって準備されます。

概要

乳酸とピルビン酸の濃度は、エネルギー代謝の中間体として広くみなされ、解糖作用、トリカルボン酸 (TCA) サイクル、および好気性生物の細胞における電子輸送チェーンの状態に関連しています。一連の解糖系の反応は、グルコース代謝の岐路にあると糖新生、脂肪酸、アセチル coa、を介してエネルギー代謝を炭水化物とアミノ酸のアラニンに変換できるピルビン酸に酸化します。TCA サイクルは、糖のエネルギーへの変換のために基本的十分な溶存酸素の存在下で発生します。特に、二次代謝の変化は、エネルギー生産のため主に解糖系が使用されている興味深い現象と TCA サイクルと電子輸送鎖を含む、好気性のミトコンドリア呼吸はダウンレギュ レート哺乳類の癌細胞の^1,2を実行します。我々 は最近モデル有機体線虫(C. elegans) の時効中における血中乳酸値とそれに伴う乳酸/ピルビン酸 (L/P) 比が減少したことを示した。同様に、 c. の elegansの哺乳類腫瘍のサプレッサー p53 オーソログ CEP 1 では、その転写制御ターゲット³の活性化を介してエネルギー代謝の加齢に伴う変化の重要な役割がわかった。

細胞の乳酸とピルビン酸濃度の測定などの生物学的アッセイでは、感度、精度、サンプル サイズ、および比色/蛍光アッセイ キットのインキュベーション時間が劇的に改善されています。技術革新のおかげで、我々 はその小さなサイズを与えられた困難であるさまざまな代謝産物や線虫の大規模な文化なし中間代謝物を分析することができるされます。一般に、比色定量法の感度は蛍光アッセイ; より小さい大きさの順序ただし、比色方法は、一般的な実験室の設定でより適しています。この線虫が外骨格に囲まれているのでさらに、均質化および蛋白質の沈殿物を含む抽出法は線虫の細胞に乳酸とピルビン酸濃度の定量のために重要哺乳類培養細胞ライン^4、5とは異なり、キューティクルと呼ばれます。ここでは、線虫からサンプル抽出のためのヒントを含む商業比色アッセイ キットを使用して乳酸とピルビン酸の濃度を分析するプロトコルについて述べる。

プロトコル

1. 同期c. の elegans文化

1. 播種前、に文化エシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌) 一晩 300 mL ルリア ベルターニカミラ (LB) スープ液体培地で 37 ° C で OP50 を歪します。-4 ° C で培養 OP50 ストア
   1. LB スープ液体培地を作るため、1 N NaOH の 1.5 mL の塩化ナトリウム 10 g、酵母エキス 5 g トリプトン 10 g を使用して脱イオン水で 1 L に追加。オートクレーブ。
      注: OP50 と線虫の系統、線虫の遺伝学センター (ミネソタ大学、セントポール、ミネソタ州、米国) から。
2. 線虫の成長媒体 (NGM) 寒天培地をするためには、塩化ナトリウム 3 g、ペプトンの 2.5 g、17 g の寒天を 975 mL の脱イオン水を使用します。オートクレーブ。55 ° C にし、薬液をクールな追加、順序、1 M MgSO₄の 1 mL、1 mL の 1 M CaCl₂、1 mL のエタノールと 1 M カリウム リン酸塩 pH 6.0 の 90 の 25 mL で 5 mg/mL コレステロール-mm シャーレ。
   1. 1 M のリン酸のカリウム pH 6.0、KH₂PO₄ 108.3 g と K₂HPO₄、46.6 g を使用し、脱イオン水を 1 l. オートクレーブ⁶に追加します。
3. 1-2 mL の培養 OP50 NGM 寒天プレート上を します。OP50 の薄層をするためには、すべての線虫を追加する前に室温で一晩版を孵化させなさい。
   注: NGM 寒天接種 OP50 は、2-3 週間室温で保管することができます。
4. 大人の段階まで、20 ° C で OP50 と文化 NGM 寒天プレート上に少なくとも 100 ワームを追加します。少なくとも 3 つのプレートが必要です。
5. 子宮内で卵を収集、3 NGM 寒天培地の版から各 5 mL の 15 mL の円錐管に S バッファーと妊娠の両性具有を転送し、15 mL の 30 300 × gで遠心分離を用いた S バッファーで 3 回ワームを洗って室温で s。
   1. S バッファーを NaCl の 5.9 g と 50 mL 1 M カリウム リン酸塩 pH 6.0 の使用をするためには、脱イオン水で 1 L に追加します。オートクレーブ⁶。
6. Axenization のアルカリ性の次亜塩素酸溶液中ワームを溶解し、卵分離を一括 (新鮮な漂白剤またはそれと同等の 0.5 mL: 5 ~ 6% ナトリウム次亜塩素酸 10 M NaOH、S バッファーの約 4.5 mL の 0.1 mL)⁶、そしてソリューションの略で 10-15 分反転による混合常温。
   注: 15 分以内で成虫を解散すべき、(解放された卵は、実体顕微鏡を使用して確認する必要があります) その死体から解放された卵のぼんやりとしたソリューションを残してします。10 N NaOH の 0.1 mL のではなく、5 N NaOH の 0.2 mL を使用もできます。
7. 次亜塩素酸治療後 S バッファーの 15 mL で 3 回卵ペレットを洗浄し、5-6 mL の S バッファーで再懸濁します。L1 期幼虫時代同期の文化のためのエシェリヒア属大腸菌なし S バッファーに 20 ° C で一晩培養中にリリースされた卵を孵化します。
8. L1 期幼虫のおおよその数を調べるには、3 回以上の幼虫を再後 S バッファーの 10 μ L の実体顕微鏡を使用してワームをカウントし、平均を計算します。その後、転送 L1 期幼虫で OP50 (1,500-3,000 ワームは 1 皿 90 mm シャーレを使用して)、NGM 寒天プレートに 5 と、自家受精を開始、いくつかの卵は (通常 3 d の後置かれるとき、彼らは若い大人の段階に成長しているまで、20 ° C で培養ays)。

線虫の細胞画分の抽出

1. 若い大人の段階 (5 日古い動物) S バッファー (図 1 a) と 5 NGM 寒天からワームを収集します。
   1. 30% (w/v) ショ糖に浮選のショ糖方法⁶を使用して生きているワームのみを選択すると、15 mL の円錐管に冷たい 60% (w/v) ショ糖の等量と S バッファーの 3-4 mL に懸ワームを混ぜます。スピンで 1,500 × g 15 管パスツール ピペット管の壁の外に移動によって新鮮なチューブにワーム、4 ° C および浮動削除で s。
2. 30 1,500 × gで遠心分離によって S バッファーで 3 回ワームを洗って 4 ° C で s1,000 μ L ピペット チップ (図 1 b) を使用して遠心分離後洗浄ワームのウェットのボリュームを確認します。
3. 蛋白質の沈殿物 (図 1) の氷冷 10% (w/v) トリクロロ酢酸 (TCA; 5% の最終的な集中) の等量を洗浄のワームを追加します。TCA、代わりに、過塩素酸 (PCA) やメタリン酸を使用できます。
4. テフロン ホモジナイザー (ポッター エルベジェム組織グラインダー) で杵の 40 ストロークを使用して鉛塩法でワームを均質化、氷の上まで 1,300 rpm で回転。
5. 磨砕液をパスツール ピペットで新鮮な 1.5 mL のマイクロ チューブに転送し、氷の上 20% のデューティ サイクル (1 分) に 3 回 3 分間超音波ホモジナイザーを用いた超音波照射します。
6. 磨砕液を 4 ° C で 10 分間 8,000 × gで遠心分離によって明らかにします。4 つの m 島清を中和する (0.25 ボリューム 10 %tca) 氷と 8,000 の x gで 4 ° C で 10 分間遠心する上で 20 分間(テスト サンプル) として清次アッセイまで-80 ° C で保存できます。

3. 乳酸比色アッセイ キットを使用して試金

1. 乳酸比色アッセイ キット (資材表) を使用して試料の濃度を測定します。テスト サンプルの二重検査を実施します。96 ウェル プレートにテスト サンプルの 5 または 10 μ L を追加し、キットに付属の乳酸アッセイ バッファーのウェルあたり 50 μ L にボリュームを調整します。
2. 乳酸標準曲線の希釈 100 mM L (+)-乳酸標準 1 mm 乳酸アッセイバッファーで。追加 0、2、4、6、8、および 10 の μ L 1 mM L (+)-標準乳酸、井戸のシリーズにキットで提供されています。
3. 各ウェルに反応混合物 (乳酸アッセイバッファー、DMSO、無水; すべての試薬はキットに付属のプローブ乳酸乳酸酵素ミックスの 46:2:2 を含む) またはバック グラウンド コントロール ミックス (アッセイバッファーの乳酸し、乳酸プローブの 48:2 を含む) の 50 μ L を追加します。サンプルは、光から保護されている間、30-60 分間室温でインキュベートします。
4. 570 で各ウェルの吸光度を測定 nm マイクロ プレート リーダーを使用し、反応混合物の吸光度からバック グラウンド コントロール ミックスの吸光度を差し引きます。
5. 乳酸標準曲線をプロットします。乳酸標準曲線から試料の乳酸濃度を計算します。

4. ピルビン酸アッセイ比色アッセイ キットを使用して

1. 培養上清 (テスト サンプル) 比色アッセイ キット (資材表) を使用してのピルビン酸の濃度を測定します。テスト サンプルの二重検査を実施します。96 ウェル プレートにテスト サンプルの 10 μ L と作業試薬 (酵素ミックスと色素試薬、キットに付属の 94:1 を含む) の 90 μ L を追加し、サンプルは、光から保護されている間、30 分間室温でインキュベートします。
2. 570 で各ウェルの吸光度を測定マイクロ プレート リーダーを使用して nm。
3. ピルビン酸の標準曲線をプロットします。ピルビン酸標準曲線から試料のピルビン酸濃度を計算します。

5 蛋白質の試金蛋白質含有量の正規化のため

1. 培養上清 (テスト サンプル) 比色アッセイ キット (資材表) を使用しての蛋白濃度を測定します。しかし、この手順、アッセイ キットに限定されない、タンパク質濃度を測定する他の方法を利用できます。
2. 各総蛋白濃度を使用して試料の中で乳酸やピルビン酸濃度の値を正規化します。
   注: テスト サンプルの蛋白質の集中が十分に蛋白質の沈殿物の後でさえも検出され、サンプル間の正規化ステップに利用されます。

結果

乳酸とピルビン酸濃度の定量比色試金を使用して、これらの試金はc. の elegans^7,8以前のレポートと比較して精度を示した。ここでは、サンプル抽出中に蛋白質の沈殿物のプロセスは、正確な値を生成する最も重要なステップだった。蛋白質の沈殿物、一般的な沈殿のため (e.g。、TCA、PCA やメタリン酸) テスト サンプル (図 1) を準備する使用ことができます。ただし、線虫、ワーム (表 1) の均一化処理中の蛋白質の沈殿物を行うことが必要でした。精度に加えてこれらの試は小規模なサンプルの乳酸とピルビン酸の濃度を測定するため十分に敏感だったし、(両方のアッセイの反応インキュベーション時間は少なくとも 30 分間) の時間の短い期間でそれらを検出することができた (

ディスカッション

これらの比色アッセイ キットを利用して、細胞の乳酸を検出するサンプル抽出の最も重要なステップと正確にc. の elegansのピルビン酸は均質化 (図 1) の間に蛋白質の沈殿物の処理にです。厳密に他ホモジナイザーとしてテフロン ホモジナイザーを使用する必要はありません (e.g。、Dounce 組織グラインダー、またはビード ミルズをテーパーと) ワームの小規模の抽出にも適しています。ない蛋白質の沈殿物前にホモジナイザーを使用して抽出した試料で細胞の乳酸とピルビン酸を検出我々 でした。さらに、乳酸とピルビン酸のレベルは蛋白質の沈殿物 (表 1) ではなく超遠心法を用いて分離細胞質画分に大幅に減少しました。これらは、サンプル抽出が線虫C. elegansを用いた生化学的手法で細胞の代謝物を検出する重要な示唆されました。蛋白質の沈殿物のためだけでなく、TCA、またいくつかの沈殿 (PCA やメタリン酸) 生化学的方法論^7,<...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
乳酸比色/蛍光アッセイキット	BioVision	#K607-100	比色/蛍光 100 アッセイ;-20°Cで保存
EnzyChrom ピルビン酸 アッセイキット	BioAssay Systems	#EPYR-100	colorimetric/fluorometric 100アッセイ;-20oC
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	#23225	colorimetric assay; 保管場所  室温
トリクロロ酢酸	和光ピュアケミカル	#207-04955	常温
テフロンホモジナイザーで保存	Iwaki/Pyrex	#358034 (Wheaton)	代わりに、Wheatonが利用できる