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方法論記事

細菌の活用頻度の高解像度の比較

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DOI:

10.3791/57812

⸱

2019年1月10日

 ,  , 
1Applied Chemistry and Biochemical Engineering Course, Department of Engineering, Graduate School of Integrated Science and Technology, Shizuoka University, 2Department of Bioscience, Graduated School of Science and Technology, Shizuoka University, 3Japan Collection of Microorganisms, RIKEN BioResource Research Center

この記事について

サマリー

さまざまな条件の下で様々 な細菌クェン DNA 要素の動作を理解することを目的と活用頻度、どのように効率的に推定する、高解像度の差異を検出のためのプロトコルについて述べるドナー菌活用を開始します。

要約

細菌の活用は、クェン DNA 要素を介して抗生物質耐性遺伝子の水平伝播の重要なステップです。異なる条件下での活用頻度の詳細な比較はどのように接合要素が広がる自然の中を理解する必要があります。ただし、活用頻度を比較するための従来の方法は、高いバック グラウンドの選択板追加活用イベントが発生したため詳細な比較に適していません。我々 は正常に最確数 (MPN) 法とさらに選択的液体媒体の活用を防ぐために抗生物質の高濃度導入することによってバック グラウンドを減少しました。また、我々 は蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えによって受信者プールへの単一ドナー細胞の並べ替えによってしばしば方法の確率を推定するためのプロトコルにドナー細胞の開始の活用を開発しました。2 種のプラスミドを使用すると、攪拌率が異なる液体培地で pBP136 と pCAR1、シュードモナスの putida細胞における共役周波数の違いを検出可能性があります。PCAR1 のより pBP136 の活用開始の頻度が高かった。これらの結果を使用して、これらの 2 種のプラスミドの活用機能をよりよく理解できます。

概要

モバイル遺伝的要素、接合性プラスミドと統合・ クェン要素 (Ice) の細菌の活用は、遺伝情報の横方向の広がりに重要です。急速な細菌の進化と適応を促進するため、多剤耐性遺伝子1,2を送信できます。活用頻度は暴徒と MPF タイプ3,4に従って分類される、性線毛を含む DNA (MOB) と嵌合ペア形成 (MPF) の動員のクェン要素に関する蛋白質によって影響を受けます 5。ドナーとレシピエントのペア6セル7,8,9,10、11,12 (の成長条件によって影響されるも成長率、細胞密度、固体表面や液体培地、温度、養分可用性、および陽イオンの存在)。方法接合要素に広がって細菌を理解するには、詳細に共役周波数を比較する必要は。

通り、ドナーと受信者ペア交尾後の活用頻度は従来の方法では推定通常。(i) まず、ドナーとレシピエントのコロニー数がカウントされます。(ii)、(しかしながら =) 接合要素を受信した受信者のコロニーがカウントされます。(iii)、最後に、活用頻度はドナーや受領者13人でコロニー形成単位 (CFU) しかしながらを割ることによって計算されます。ただし、このメソッドを使用すると、背景が細胞密度が高い10のとき、しかしながらを取得するために使用する選択式ナンバー プレートにも発生することができます追加活用イベントのため高い。したがって、(10 倍差) の下の頻度のわずかな違いを検出することは困難です。我々 は最近、抗生物質の高濃度を含む液体培地を用いた最確数 (MPN) 法を導入しました。このメソッドは、さらに選択的な媒体の活用を阻害することによってバック グラウンドを減少したがって、高解像度の活用頻度を推定する可能性があります。

共役は、3 つのステップに分けることができます: (1) ドナーと受信者の添付ファイルのペア、伝達の開始 (2) と (3) のペア14の解離。手順 (1) と (3) の間には、ドナーと受信者セル間の物理的な相互作用です。したがって、細胞密度と環境条件が性線毛の機能も重要な手順に影響することができます。ステップ (2) は、プラスミド、ドナーと受信者のさまざまな機能によって影響を受ける可能性があります、外部の変化に対応した抱合に関与する複数の遺伝子の発現によって調整される可能性が高い。粒子として電池の予測を使用して物理的な添付ファイルやドナーと受信者のペアの剥離を数学的にシミュレートできます、ただし、ステップ (2) の周波数を実験的測定ください。いくつか報告方法の直接観測にしばしばドナーを活用 [ステップ (2)] 蛍光顕微鏡15,16; を使用して開始されています。ただし、これらのメソッドは多数のセルを監視する必要があるために、高スループットではありません。したがって、蛍光性によって作動セル (FACS) を並べ替えを使用して、ステップ (2) の発生の確率を推定する手法を開発しました。本手法は、活用に必須の遺伝子の同一証明なしのすべてのプラスミッドに適用できます。

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プロトコル

1. 緑色蛍光タンパク質 (GFP) とドナーの準備- とカナマイシン耐性遺伝子タグ プラスミド

  1. ターゲット プラスミド pBP136 への遺伝子の導入
    注:このプロトコルの目標は pBP136 を生成する:gfp。菌株と本研究で使用されるプラスミドの表 1のとおりです。
    1. PBP13617を 5 mL 滅菌ルリアスープ (LB)、エシェリヒア属大腸菌S17 1 λpir18 pJBA2819をかくまっているをかくまっているエシェリヒア属大腸菌DH10B の文化を育てる [カナマイシン (Km) を含む-抵抗性遺伝子とgfpmut3 * 遺伝子プロモーターとターミネーター ミニ Tn5] を 5 mL 50 μ g/mL Km 37 ° c 一晩 (O/N、16-24 h) 200 回転/分 (rpm) で振動を含む滅菌の LB の。
    2. 収穫や洗浄
      1. 収穫の各文化の 1 mL、2 mL マイクロ チューブと遠心分離機 (10,000 × g室温、2 分) に入れます。上澄みを廃棄し、2 ml の滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 細胞ペレットを再懸濁します。
      2. (10,000 × g室温、2 分)、遠心分離機をもう一度と滅菌 PBS の 500 μ L で再懸濁します。
    3. 交尾をフィルターします。
      1. (1.6% 寒天) と滅菌の LB の版を準備し、滅菌 0.22 μ m 孔サイズの膜フィルターを配置します。ミックス 500 μ L大腸菌DH10B と大腸菌S17-1 λpir遺伝子 pJBA28 の pBP136 とスポット LB プレートのフィルターでの混合物をかくまっています。プレート O/N 30 ° c. で孵化させなさいLB プレートからフィルターを削除、滅菌 50 mL プラスチック チューブに配置し、1 mL の滅菌 PBS を追加します。
        注: pJBA2818 pir遺伝子によって符号化される Π タンパク質の存在下で複製することができます、S17 1 λpirから DH10B に転送することができます。pBP136 は、マーカー遺伝子17を運ぶし、DH10B から S17 1 λpirに転送することができます。したがって、この段階で pBP136 と DH10B 遺伝子 pBP136 とミニ Tn5 (転置染色体または pBP136) から pJBA28 を抱いて S17 1 λpirない区別できた。その後、後続のステップ (1.1.4.–1.1.5) のドナーとしてそれらの混合物を使用しました。
    4. 揺れで 200 rpm とシュードモナスの putida KT2440 の文化で 37 ° C で 50 μ g/mL Km を含む滅菌の LB の上記の交配混合物の O/N 文化を育てる [Km 感応 (Kms), リファンピシン感受性 (リフs)ゲンタマイシン (Gms) に依存およびテトラサイクリン耐性 (Tcr)] 200 rpm で振とうしながら 30 ° C で 12.5 μ g/mL Tc を含む培地で。
    5. 収穫と 1.1.2 のステップのようにセルを洗浄後、フィルター ステップ 1.1.3 のように (O ・ N、30 ° C) を交配 (交配混合物および KT2440) それらを使用します。
    6. 50 μ g/mL Km と 12.5 μ g/mL Tc を含む滅菌の LB の版を準備 (LB + Km + Tc プレート)。
    7. 希釈滅菌 PBS でメンブラン フィルターの再懸濁液 (10 の1– 105-折る)、各希釈 LB + Km + Tc にプレートし、30 ° c 2-3 d 版を孵化させなさい伝染。
    8. プレートからコロニーを拾う、Km と Tc と同様にPを含む滅菌の LB の O/N 文化を育てます。resinovoransCA10dm4RG (リフrと Gmr)6リフを含む滅菌の LB (25 μ g/mL) と Gm (30 μ g/mL) 30 ° C、200 rpm で。
      注:(1.1.7。) からプレート LB + Km + Tc のコロニー前の注で説明したよう KT2440 遺伝子 pBP136 を運んでいるかもしれないミニ Tn5と KT2440 ミニ Tn5pJBA28 は S17 1 λpirから直接移すことができるのでpBP136 と pJBA28 KT2440 にかくまっています。だからこそ、 P. resinovorans CA10RG 別交配は以下の手順でミニ Tn5ターゲット pBP136 を取得する必要です。
    9. 収穫と 1.1.2 のステップのようにセルを洗浄後、ステップ 1.1.3 のようにフィルター (O ・ N、30 ° C) を交配に使用します。
    10. リフ、Gm、および Km を含む滅菌の LB の版を準備 (Gm Km + リフ LB プレート)。
    11. フィルターの混合物を再懸濁し、それに 10 の1– 105を希釈して-フォールド、Gm Km + リフ LB の上に広がるプレート、および 30 ° C で 2-3 d 版を孵化させなさい
    12. コロニーをピックアップし、プラスミッドのため特異的プライマーを用いた PCR による pBP136 を抱くかどうかを確認します。
  2. ターゲット プラスミド pCAR1 選択マーカー遺伝子の導入
    注: このプロトコルの目標は pCAR1 を生成する:gfp
    1. PCAR1 をかくまっているP. putida KT2440 の O/N 文化を成長 (KmsGmsリフsTcr) で 200 rpm と 30 ° C と 5 ml 滅菌 LB の pJBA28 をかくまっているエシェリヒア属大腸菌S17 1 λpir18 20200 rpm と 37 ° C で 50 μ g/mL Km を含む
    2. 収穫と 1.1.2 のステップのようにセルを洗浄後、ステップ 1.1.3 のようにフィルター (O ・ N、30 ° C) を交配に使用します。
    3. LB プレートからフィルターを削除、滅菌 50 mL プラスチック チューブに配置し、1 mL の滅菌 PBS を追加します。
    4. 希釈滅菌 PBS に再懸濁液 (10 の1– 105-折る)、滅菌選択 LB + Tc + Km に希釈混合気の拡散とプレート。
      注: pCAR1 はエシェリヒア属大腸菌の複製されませんしたがって、 P. putida KT2440 LB + Tc + Km のミニ Tn5遺伝子 pCAR1 を選択できるプレート。
    5. プレートからコロニーをピックアップし、キロ、Tc とPの文化を含む滅菌の LB の O/N 文化を育てます。resinovoransリフと Gm (200 rpm, 30 ° C) を含む滅菌の LB の CA10dm4RG。
    6. 収穫と 1.1.2 のステップと同様に洗浄後、ステップ 1.1.3 のようにフィルター交尾 (O ・ N、30 ° C) のセルを使用します。
    7. フィルターの混合物を再懸濁しますでそれを希釈、プレート、Gm Km + リフ LB に広げるし、30 ° C で 2-3 d 版を孵化させなさい
    8. コロニーをピックアップし、プラスミッドのための特異的プライマーと pcr 法による pCAR1 を抱くかどうかを確認します。
  3. タグ付きのプラスミドの伝達性を確認し、次のステップのドナーを準備
    注: このプロトコルの目標は、上記の構築されたプラスミドの伝達性を確認し、次のステップのドナーを準備します。
    1. PBP136 をかくまっているP. resinovorans CA10dm4RG の O/N 文化を育てる::gfpまたは pCAR1:: Km とP. putida SMDBS [KmsGmsリフrTcr、ラッチの文化を含む滅菌の LB のgfp q、どの PA1/O4/O3-gfpmut3* その染色体ラッチq遺伝子により表現されていない]21 Tc (200 rpm, 30 ° C) を含む LB の 3 mL。
    2. 収穫と 1.1.2 のステップのようにセルを洗浄後、ステップ 1.1.3 のようにフィルター (O ・ N、30 ° C) を交配に使用します。
    3. 滅菌 50 mL プラスチック チューブにフィルターを置き、1 mL の滅菌 PBS に再懸濁します。希釈滅菌 PBS に再懸濁液 (101– 105-折る)、滅菌選択 LB + Tc + Km に希釈混合気の拡散板。
    4. コロニーをピックアップし、各特異的プライマーと pcr 法によるプラスミドを抱くかどうかを確認します。
      注:ミニ Tn5プラスミド抽出後直接配列の挿入位置の確認は、挿入は、プラスミドの伝達関数には影響しませんを確認するオプションです。

2. MPN 法による共役周波数の計算

  1. 滅菌の LB + Km および LB + Gm 準備板。
  2. PBP136 をかくまっているP. putida SMDBS の O/N 文化を育てる::gfpまたは pCAR1:: Km とP. putida KT2440RGD の文化を含む滅菌の LB の 3 mL でgfp (Gmrリフr) Gm (140 rpm, 30 ° C) を含む LB 3 mL に。
  3. 収穫と 1.1.2 のステップのようにセルを洗浄後、フィルター ステップ 1.1.3 のように 45 分の 30 ° C で交尾に使用します。
  4. 連続希薄 Gm (受信者) は (CFU) の単位を形作っているコロニーをカウントする (それぞれ 3 通) をプレート + 上記のドナーと受信者 (101 – 107) を文化し LB + Km (ドナー) または LB の上に 。30 ° c 2 d 版を孵化させなさい。
  5. Km と、Gm を含む滅菌の LB のフィルターに混合物を再懸濁し、連続希釈 (2 から1 224– 107.2) (4 連) で 96 ウェル細胞培養プレートを使用します。
  6. 96 ウェル プレートを適切な時間 (30 ° C で 2 d) にインキュベートします。
  7. ドナーとレシピエント (ステップ 2.4.) のプレートに CFU をカウントし、しかしながらが成長の井戸の数をカウントします。
  8. ジャービスらによって開発された MPN 計算プログラムを使用して MPN との偏差を計算します。22http://www.wiwiss.fu-berlin.de/fachbereich/vwl/iso/ehemalige/professoren/wilrich/MPN_ver5.xls で利用可能です。
    1. 実験 (例、'テスト') の名前 (例: 2018/4/9) 実験、テスト シリーズの数と最大の日付を入力します。ポップExcel の 'プログラム' の行 #7 シートで希釈 ('24' を入力) ファイル ('MPN_ver5.xls')。
    2. 入力 '2-1 (= 0.5) 2-24 (= 5.96 × 10-8)' '希釈係数d'列' 0.01' 'ml または g wのボリューム' 列、および 4 'で' 号管 n の ' '入力データ」の自動的に作り出されたテーブルで。
    3. しかしながら成長各サンプル希釈 (0-4) 井戸の数を入力します。
    4. 上部右 '計算結果' ボタンを押して、(MPN/μ L) の結果とその 95% 信頼限界 (下限と上限) を入手します。
  9. しかしながら (MPN/mL) 数を割ることによってドナーと受信者のセル (CFU/mL) の数によってプラスミッドの活用頻度を計算します。

3. ドナー主導の共役の確率の推定のための準備

  1. PBP136 をかくまっているP. putida SMDBS の O/N 文化を成長::gfpまたは pCAR1:: Km とP. putida KT2440RGD の文化を含む滅菌の LB の 3 mL でgfp (Gmrリフr) 300 mL を使用して Gm を含む滅菌 LB 3 mlフラスコ (140 rpm, 30 ° C) precultures として
  2. Km や 500 mL フラスコで Gm を含む新鮮な滅菌ポンドの 200 mL に、清酒の 200 μ L を転送し、140 rpm で振とうしながら, 30 ° C で。
  3. 600 で濁度を測定 nm (外径600) 紫外可視分光光度計とスポットを使用するカルチャのカルチャ、希釈 LB の (10 の1– 108-倍希釈)、Km を含む LB プレートまたは 30 ° c 1-2 d Gm. 加温これらの LB プレートに、CFU を決定。
  4. 外径600値とドナーとレシピエントの成長曲線を生成するため生育に伴い CFU プロットします。
  5. ドナーとレシピエントのひずみの文化を成長曲線に基づく中間ログ位相に成長します。
  6. 収穫とセルを洗浄後、101– 103 LB と 105– 107 LB の 100 μ L で受信者の CFU の 10 μ L のドナーの CFU を準備します。
  7. ドナーと受信者の文化 (3 通) で 96 ウェル プレートでさまざまな密度での 100 μ L のミックス 10 μ L。たとえば、ミックス 101ドナーの 10 CFU5 CFU 受信者の各 96 ウェルとミックス 101ドナーの CFU と 10 に追加6別の 96 ウェル プレートで受信者の CFU などなど。
  8. 45 分、30 ° C で混合物をインキュベートし、さらに活用を阻害する各ウェルに高濃度の抗生物質 (100 μ g/mL Km と 60 μ g/mL Gm) を追加します。
  9. 2 d のための 30 の ° C でプレートを孵化させなさい。
  10. しかしながらが成長の井戸の数をカウントします。
  11. ドナー主導の活用 (しかしながらは 96 ウェル プレートの少なくとも 1 で発見されるべき) 上記データに基づく確率の推定に適切な受信者の密度を選択します。
    注:しかしながらは、ドナーとレシピエントの細胞の密度が高いと、よく発生します 1 つ以上活用するときすべての井戸に成長します。対照的に、細胞密度が低すぎるとき任意の井戸でしかしながらは発見しません。次のセクションでは、1 つのドナー細胞は井戸の中へ並べ替えられます。したがって、受信者の密度は最大にする必要があります。

4. ドナー主導の共役の確率の推定

  1. PBP136 をかくまっているP. putida SMDBS ドナーの中間ログ相培養の 200 mL を準備::gfpまたは pCAR1::gfpと受信者P. putida KT2440RGD、3.6-3.7 で説明されているとのこと。
  2. 場所 106ポンドの 96 ウェル プレートの各ウェルに 100 μ L の受信者の CFU。
  3. FACS システム (ロボット アーム、488 nm アルゴン レーザー 70 μ m ノズル口径と流れ、フローサイトメトリーおよび細胞ソーター) を設定します。前方散乱 (FSC) 取得トリガーとして 1% のしきい値を設定します。H 利得と FSC のゲイン調整、ネガティブ コントロールとして PBS を使用して偽の肯定的な信号を除外することができます最大感度で側方散乱 (SSC)。FSC と SSC と極大ソート純度の 0.5 ドロップの並べ替えモードに基づく並べ替えゲートを設定します。
  4. LB プレート (384 箇所) の FACS による単一ドナー細胞の並べ替えでは、2 d をクリックし、並べ替えられた細胞からプレートに表示されますどのように多くのコロニー カウント 30 ° C でプレートを孵化させなさい。
    注:この手順は、門の設定を検証するためです。皿の上に 384 コロニーが存在する場合は、並べ替えられた細胞の 100% がコロニーを形作ることができることを意味します。並べ替えの平均の妥当性は常に 90-95% であります。
  5. 並べ替え (4.2) の受信者を 96 ウェル プレートの各ウェルに FACS による単一ドナー細胞。
  6. 30 ° C の 45 分のプレートをインキュベートし、活用をさらに防ぐためにも高濃度の抗生物質 (100 μ g/mL Km と 60 μ g/mL Gm) を追加します。
  7. 2 d のための 30 の ° C でプレートを孵化させなさい。
  8. しかしながらとして成長した井戸の数をカウント肉眼で目視検査によって決まります。
  9. しかしながら、ドナーがソートされた井戸の合計数で井戸の数を割ることによってドナー主導の活用の確率を計算します。

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結果

MPN 法による共役周波数の比較

以前の報告では、pBP136 の活用頻度を比較した::gfpと pCAR1:: 125 mL スピナー フラスコ10を使用して 45 分交尾後攪拌率の異なる 3 倍希釈の LB (1/3 LB) 液体の媒体のgfp 。PBP136 の活用頻度を比較した::gfpと pCAR1::gfp 106 CFU/mL 別撹拌条件下でのドナーとレシピエントの系統 (0-600 rpm)。両方のプラスミドの活用頻度の高い攪拌率増加し、共役周波数の最大の差は < 10 倍 pBP136 の::gfp pCAR1 の間 (0 と 400 rpm) 間::gfpだった 〜 25-fold (0 の間200 rpm;図 1)。

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ディスカッション

ここでは、プロトコルを提案高解像度のさまざまな状況で活用頻度の差異を検出 MPN メソッドを使ってしかしながらの数を推定します。プロトコルの 1 つの重要なステップは、しかしながらが育たないまで交尾後ドナーとレシピエントの混合物を希釈です。高濃度の抗生物質の活用をさらに防ぐために選択の液体培地に別のステップを追加すること。これらのプロシージャは、選択培地での更なる活用によるバック グラウンドを減らすことができます。正常に、ドナーとレシピエントの間の短い交尾期間後も違いを検出我々 でした。このプロトコルによって計算ブラスミドの周波数は、ドナーとレシピエントの株の成長の状態のわずかな違いによって変更できます。したがって、これらの条件を慎重に設計する必要があります。

さらに、単一ドナー細胞選別の FACS を用いた共役の 2 番目のステップを推定するためのプロトコルを提案する.このプロトコルでは最も重要なステップは、並べ替えられた単一ドナー細胞の受信者の細胞の適切な密度を決定です。とき単一ドナー細胞の周囲は受信者の細胞数はドナーとレシピエントの間の十分な大きさ、物理的な接触であります。そ...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

博士 k. 蒲池の国立感染症研究所 (日本) にありがとう pCAR1 を提供するため pBP136 と東京大学 (日本) の野尻浩之教授を提供します。デンマークの技術的な大学の教授 Molin Sølen へ pJBA28 を提供することに感謝しております。この作品は、日本学術振興会科研費によって支えられた (許可番号 15 H 05618 と 15KK0278) ms (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/、https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
MoFlo XDPベックマン・コールターML99030FACS
IsoFlowベックマン・コールター8599600シース溶液
フルオロスフィア (10 μm)ベックマン・コールターFACS
インキュベータヤマトサイエンティフィック株式会社211197-IC802
UV-VIS分光光度計 UV-1800シマズ製作所UV-1800
96ウェルプレートニッポンジェネティクス株式会社TR5003
マイクロプレート型シャーレAXEL1-9668-01選別バリデーション用
ダイヤフラムフィルターADVANTECC045A025Aフィルター嵌合
ピペット日菱工業株式会社00-NPX2-20,
00-NPX2-200,
00-NPX2-1000		0.5-10 μL、20-200 μL、100-1000 μL
マルチチャンネルピペット日菱(株00-NPM-8VP,
00-NPM-8LP		0.5-10 μL、20-200 μL
トリプトンBD Difco211705
酵母エキスBD Difco212750
NaClSigmaS-5886
寒天中来 テスク01162-15
リファンピシン和光185-01003
ゲンタマイシン和光077-02974
カナマイシン和光115-00342
シャーレAXEL3-1491-51JPND90-15
マイクロチューブ深栄製131-815C
500mL ディスポーザブルスピナーフラスココーニングCLS3578
ー設置用ビーズ6605359 用)

参考文献

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