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方法論記事

ホスホロチオエートを使用して RNA の結合蛋白質の新規飽和突然変異誘発方法: シングル ステップの特性

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DOI:

10.3791/57816

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2018年8月21日

1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of Colorado at Boulder

この記事について

サマリー

特定の RNA シーケンスを結合するタンパク質は、遺伝子発現の重要な役割を果たします。これらの結合部位の詳細な特性解析は遺伝子の規則の私達の理解にとって重要です。ここでは、RNA タンパク質結合部位の飽和突然変異導入のシングル ステップ アプローチを説明しています。このアプローチは、RNA のすべての蛋白質の結合サイトに関するものです。

要約

遺伝子の規則は開発の重要な役割を果たしています。多数の DNA と RNA 結合タンパク質は、遺伝子の発現を制御する高い特異性とそのターゲット シーケンスをバインドします。これらの調節タンパク質 (転写) DNA のレベルでまたは RNA (mRNA スプライシング、起こる、mRNA の輸送、腐食および翻訳) のレベルでの遺伝子発現を制御します。制御配列の同定は、オンまたはオフの遺伝子への切り替えだけでなく、また下流遺伝子の特定規制蛋白質によって規制されているを理解するのに役立ちます。ここでは、RNA でタンパク質結合部位の飽和突然変異導入を可能にするワンステップ アプローチについて述べる。次の潜伏蛋白連結分数の各ホスホロチオエート ヌクレオチドと独立した Rna の合成と分離結合サイト内で非野生型ヌクレオチドと DNA テンプレートをドーピングが含まれます。非野生型ヌクレオチドからの干渉は、蛋白結合率の特恵除外の結果します。これはホスホロチオエート (ホスホロチオエート変異または PTM) を含むリン酸ジエステル結合のヨウ素の化学選択的な胸の谷間、次ゲル電気泳動によって監視されます。このシングル ステップ飽和突然変異誘発方法は、RNA、タンパク質結合部位の評価に適用されます。

概要

遺伝子は、生物学で重要な役割を果たしています。遺伝子の転写、mRNA のスプライシング、3' 端形成、RNA 輸出、翻訳、mRNA の局在、崩壊、翻訳後修飾/安定性など両方の DNA と RNA 結合タンパク質は、遺伝子の重要な役割を再生レベルに調整できます。規制。一方、分子遺伝学的解析では、規制を多くの蛋白質を識別した、それらのごく一部のみが細胞機能の結合サイトの生体内完全に特徴づけられています。系統解析と突然変異は、DNA または RNA 蛋白質の相互作用を特徴付けるに補足のアプローチを提供しています。

RNA 結合蛋白質性分を含む発達のプロセスで重要です。セックス致死 (SXL)ショウジョウバエ蛋白質またはマスター セックス スイッチ蛋白質が存在しない、男性が女性にプレゼント。ウリジン豊富なシーケンスまたは体細胞1,2 の下流 mRNA ターゲット (トランス、セックス致死、男性固有の lethal2) で特定のスプライス部位に隣接するピリミジンの広大を認識します。 ,3,4。さらに、それは起こるサイトの初歩的な増強物(e(r)) 謄本5,6にウリジン リッチ起こるエンハンサー シーケンスに結合して切り替えを調整します。SXL 可能性が調節することを残る女性の生殖で追加のターゲット識別1,7,8,9,10、11,12,13。

通常、結合部位の特性変異原性, たとえば、削除や単一または複数のヌクレオチドの置換します。野生型 RNA 配列を基準にして各変異体の結合サイトが分析され、その結合親和性を決定するタンパク質濃度の一連を使用して (Kdまたは平衡解離定数); 興味の蛋白質のKdは 50 %rna 結合を取得するために必要な蛋白です。詳細な突然変異のこの労働集約的なプロセスを含む多数の突然変異体の生成・解析-3 つの野生型ヌクレオチド結合部位の各位置のため。従って、RNA に蛋白質の結合サイトの高速、簡単、安価な飽和突然変異導入の代替アプローチの必要性があります。

ここでは、RNA でタンパク質結合部位の飽和突然変異導入を可能にするワンステップ アプローチについて述べる。次の潜伏蛋白連結分数の各ホスホロチオエート ヌクレオチドと独立した Rna の合成と分離結合サイト内で非野生型ヌクレオチドと DNA テンプレートをドーピングが含まれます。非野生型ヌクレオチドからの干渉は、蛋白結合率の特恵除外の結果します。これはホスホロチオエート (ホスホロチオエート変異または PTM) を含むリン酸ジエステル結合のヨウ素の化学選択的な胸の谷間、次ゲル電気泳動によって監視されます。このシングル ステップ飽和突然変異誘発方法は、RNA、タンパク質結合部位の評価に適用されます。

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プロトコル

注:図 1ホスホロチオエート変異の概要し、プロセスの主な手順の概要を示します。

1. 突然変異体のライブラリの生成 — 野生型ヌクレオチドと DNA テンプレートをドーピング

  1. T7 プライマーを合成 (5'-GTAATACGACTCACTATAG-3') DNA のシンセサイザーに化学合成によって。
  2. タンパク質の結合部位に対応する DNA シンセサイザーに化学合成によるドープしたオリゴヌクレオチド (相補鎖) を合成します。化学合成の中に野生型ヌクレオチド (この比率の詳細について代表的な結果を参照) としての比 90% は野生型ヌクレオチドと 10 %t のドーピング (以下 X) の各サイトの phosphoramidites の適切な混合物を使用します。
    注: ここでは、ドープされたオリゴヌクレオチドのシーケンスは 5'-GTTCACTACACTXGAXAXAXAXCAXCXAXAXGXTGCCCTATAGTGAGTCGTATTAC-3'。下線付きのシーケンスは SXL タンパク質結合部位、プラスの荷重コントロールがあることと同様、バインド、RNA ではすべての変更に影響を与えることを確認する便利なコントロールを提供するヌクレオチド結合部位外の逆の補数ヌクレオチド結合部位内の正規化と比較。SXL バインド サイト シーケンストランスmRNA14,15,16,17に存在する UUUUUGUUGUUUUUUUU は、提案された方法論を考案する使用されました。イタリック体でシーケンスは T7 プライマー シーケンスに補足で、T7 プロモーターの in vitro転写に。

2. RNA の合成

  1. 上記18としての 20 μ L 転写反応に RNA を合成します。
    1. 1 μ M が 1 mM 10 mM ジチオトレイトール (DTT) 2 mM GTP、オリゴヌクレオチドをドープしたミックス T7 転写バッファーと 1 μ M T7 オリゴヌクレオチド、2 U/μ L T7 RNA ポリメラーゼと UTP (グアノシン、アデノシン、シチジン、ウリジン三リン酸)、CTP、ATP。
    2. 追加には、2 つの独立した遠心管 0.167 mM α チオ ATP または 0.05 mM α-チオ UTP Rna にホスホロチオエート (図 2の回路図を参照してください) を組み込む。
      注: 代わりとなる議定書ドープしたオリゴヌクレオチド ヌクレオチド置換を残りの 2 つのテストを含む適切な転写反応に 0.2 mM α チオ CTP または 0.2 mM α チオ GTP を追加します。
    3. 37 ° C で 2 時間 RNA 合成反応混合物を孵化させなさい
  2. RNA のサンプルに 2.5 μ L, 易熱性アルカリフォスファターゼと 2.5 μ L 10xphosphatase バッファーを追加します。この 25 μ L 反応 5' 隣酸塩を削除する 37 ° C で 10-30 分間インキュベートします。
  3. 2-5 分で 80 ° C に加熱することによりアルカリフォスファターゼ酵素を不活性化します。
  4. 脱燐酸化された RNA の 5' 末端を特に (5 pmole) 1 μ L T4 ポリヌクレオチド キナーゼと 1 μ L γ-32P ATP 10 μ L 反応量を使用しています。37 ° C で 30-60 分のための反作用の組合せを孵化させなさい
  5. 20-30 分の 65 ° C で加熱による T4 ポリヌクレオチド キナーゼ酵素を不活性化します。
  6. ゲルは、10% 変性ポリアクリルアミドゲルの電気泳動によって RNA を浄化します。オートラジオグラフィーによるゲルで RNA を探します。標識 RNA を含むゲルのスライスを消費税、ピペット チップの壁に対して押すことによって微量遠心チューブにつぶす、プロテイナーゼ K (PK) バッファー (100 mM トリス、pH 7.5、12.5 ミリメートルの EDTA、150 mM 1% ドデシル硫酸ナトリウム, 塩化ナトリウム) に浸します。一晩に 2 h から室温でチューブを回転させます。
  7. 遠心分離機のゲル スラリー、ゲルを破棄し、緩衝液を収集します。
  8. フェノール-クロロホルムの等量で二回とクロロホルムのソリューションを展開し、水性相を収集します。
  9. 水相 0.1 容積 3 M 酢酸ナトリウム、pH が 5.2、キャリアに追加 tRNA またはグリコーゲンおよび 2.5 量のエタノール。-80 ° C 1 時間でサンプルをしてください。
  10. 16,873 x gで高速遠心機で 5-10 分のサンプルを遠心します。RNA の餌を乱すことがなくバッファー/エタノール溶液を慎重に削除します。
  11. 70% エタノールでペレットを洗浄し、慎重に 2-5 分削除エタノールの遠心分離機します。空気でペレットを乾燥させます。
  12. 20-50 μ L ジエチルエステル (DEPC) でペレットを再懸濁します-処理水。使用するまで-20 ° C で保存します。
    注: 放射能から保護するために適切な予防措置とプレキシ ガラスの盾を使用して標識 RNA をすべての手順を実行します。現在、スピン列は、RNA のゲルの浄化方法として一般的に使用される、削除するより便利な法人放射能です。

3. 蛋白反応と結合した RNA の分離を結合

  1. 組換え蛋白質の表現そしてエシェリヒア属大腸菌から浄化します。
  2. 吸光光度法または知られていた蛋白質標準、ウシ血清アルブミン (BSA) の横にある SDS ポリアクリルアミドのゲルの分離による組換え蛋白質濃度を推定します。Coomassie ブリリアント ブルー R-250 とゲルの汚損によって興味および標準の BSA の蛋白質を視覚化します。同じゲルで BSA 希釈の知られている量と比較してタンパク質量的に表わします。
    注: 保存組換え蛋白質 - 80 ° C まで使用と希釈で 20 mM の 4-(2-ヒドロキシエチル) ピペラジン-1-ethanesulfonic 酸 (HEPES)、pH 8.0、1 mM ジチオトレイトール (DTT) 0.2 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、0.05% 20% グリセロール、NP 40。使用 0.5-1.0 mM プロテアーゼ阻害剤 phenylmethane フッ素 (PMSF) は省略可能です。
  3. 10 mM トリス-HCl、pH 7.5 に RNA 結合反応 (20-100 μ L) を実行、ウシ血清アルブミン、1 mM EDTA、0.15 μ g/μ L に 0.09 μ g/μ L がアセチル化 50 mM 0.5 単位/μ L RNase 阻害剤、KCl は 1 mM DTT、tRNA、5' 末端標識 RNA および (適切な濃度の 6 μ LRNA の 〜 50% が蛋白質に結合する濃度) 蛋白質の。
    注: この結合バッファーは、3 つの RNA-結合蛋白質 (U2AF65SXL と PTB) が興味の蛋白質のために標準化する必要があります。約 50% を取得するために必要な特定の蛋白質の準備のため様々 な希薄を使用して経験的にタンパク質濃度を推定 RNA 結合。この条件またはKdは、RNA 結合曲線の最も敏感な部分を表します。
  4. 20-30 分 (または氷の上) 25 ° C での蛋白質の結合の反作用を孵化させなさい。
  5. 2 つの方法のいずれかを使用して非連結分数から蛋白結合 RNA 画分を分離します。
    1. 硝酸セルロース フィルター結合
      1. 結合の反作用 (20-100 μ L) を常温で真空マニホールドに接続されている硝酸セルロース フィルターに適用されます。
        注: RNA 蛋白質の複合体だけフィルターに保持され、フィルターを通して RNA フローを連結しました。フィルター結合アプローチ結合した RNA の高い回復できより速く、簡単に、ゲルの移動性シフト試金と比較しています。硝酸セルロース フィルターの下に DEAE 膜を置くことによってまた非連結の RNA の一部分を収集したり、無料の RNA 連結の割合との比較することが可能としてます。
      2. 剰余を含む硝酸セルロース フィルターの部分のカット微量遠心チューブに収まるように小さな断片に放射性 RNA フィルター部分を没頭する十分な PK バッファー (300-500 μ L 含む 10-20 μ g PK) に浸漬し、フィルターから RNA を溶出2-3 時間または一晩。
      3. フェノール-クロロホルム、クロロホルムで抽出し、水性相を収集します。酢酸ナトリウムとエタノールを追加、遠心分離機の冷凍庫に潜伏後、洗って、乾かし、DEPC 処理水に RNA を再懸濁します。この手順では、2.10 に 2.14 上記の手順で説明するようします。
    2. ゲルの移動性シフト
      1. 準備し、5% のネイティブ ポリアクリルアミドゲルの重合 (60: 1 Acrylamide:bis-アクリルアミド) 0.5 でフィルター結合法に代わるものとして結合の反作用を開始する前に x TBE (標準 Tris ホウ酸 EDTA バッファー)。
      2. 中古冷蔵室 (4 ° C) で 250 V で 15 分のためのゲルを実行します。
      3. 上記実行前ゲルの別の井戸に各結合の反作用 (上記) をロードします。
        注: タンパク質ストレージ バッファーは井戸にサンプル読み込みの十分なグリセロールを提供します。
      4. 蛋白結合 RNA を電気泳動に特定の蛋白質と RNA のサイズに応じて、1 ~ 2 時間 250 V で冷蔵室で区切ります。
      5. オートラジオグラフィーによるゲルの RNA 蛋白質の複合体の位置を探します。RNA 蛋白質の複合体を含むゲルのスライスを切除します。ゲルのスライスを粉砕し、PK バッファーに浸漬でゲルのスライスからの RNA を溶出します。
      6. フェノール-クロロホルム、クロロホルムで抽出し、水性相を収集します。酢酸ナトリウムとエタノールを追加、冷凍庫に潜伏後遠心分離、洗浄、乾燥、空気、DEPC 処理水に RNA を再懸濁します。この手順では、2.10 に 2.14 上記の手順で説明するようします。

4. 変異塩基位置の検出のためのヨウ素切断ホスホロチオエート製品の分析

  1. 1 mM ヨウ素を加えて 20 μ L の DEPC 処理水最大 10 μ g のキャリアを含む tRNA Rna (連結および総 Rna) ホスホロチオエート結合部位で切断します。5 分間室温でインキュベートします。
    注: ヨウ素をわずかに異なる条件詳細-7% (v/v) iodoethanol、3 分 95 ° C で加熱、ギッシュ ・ エクスタイン 198819で見つけることができます。
  2. 前述のようにナトリウム酢酸・ エタノールを追加することによって切断 RNA を沈殿させます。変性ゲルのローディングの染料に再懸濁します。15-20% の変性ポリアクリルアミドゲルの電気泳動によって RNA 断片を分離するサンプルを読み込むし、熱します。
  3. X 線フィルムに電気泳動法を公開します。
  4. オートラジオグラフィーを用いた総プールと連結の割合でバンドを検出します。
    注: は、排気フードにヨウ素すべて手順を実行します。ここに示す RNA 分離、くさび状のゲルを採用、ゲルの下部に余分なインチの長さのスペーサーを挿入することによりゲル板の下部に両方のスペーサーの厚さを倍増によって達成され。この図形より均一または近い間隔短い RNA フラグメントことができます。また、検出と放射能の定量分析のため、x 線フィルムではなく、phosphorimager を使用できます。

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結果

ドーピングを使用して飽和突然変異導入の原理:

野生型および他のヌクレオチドの適切なモル比、1 つの位置だけの分析対象とする場合、すべての 4 つのヌクレオチドの等量混合物を使用します。ただし、同時に複数のポジションを分析、野生型のヌクレオチドに非野生型の比率が調整必要があります、すなわち、減少します。そうでなければが必要な単一の置換だけでなくがもあります単一ヌクレオチド置換の効果の解析を排除、分子に複数の野生型ヌクレオチドを含むテンプレート。したがって、親指のルールとして使用率 1/n の野生型ヌクレオチドに非野生型の n は分析する位置の数。ここでは、私たち 10 の位置も同時に解析し、野生型のヌクレオチドの 90% および野生型ヌクレオチド DNA のテンプレートをドーピングのための 10% を含む混合物を使用します。4 ホスホロチオエートのいずれかで各転写反応を実行する別の転写反応が行われます。したがって、各反応は、ドープした位置特定...

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ディスカッション

変異は蛋白質の結合サイトを特徴付けるため長い間使用されています。まず、一連の変異型を構築し、結合の結合親和性に及ぼす影響を分析するアッセイで個別にテストできます。複数のステップ変異体を構築する一連の各変異体の反応をバインディングの実行など、標準的なアプローチに関連するかどうかは面倒で時間がかかるかどうか、およびことができない標準的な突然変異手法では、複数のシーケンスを分析する方法を提供しています、特に長いシーケンスのための飽和突然変異導入を許可します。第二に、シーケンスをランダム化できるし、プールにバインドおよびポリメラーゼの連鎖反応の複数のサイクル (pcr) 使用されます。蛋白質を結合するこれらのシーケンスでお越しの際にも複製し塩基配列を解読し、コンセンサス シーケンスから結合部位を検証します。それにもかかわらず、この反復バインディングと増幅オプションは複数のステップが含まれます、結合部位に重要な残基を識別するに骨の折れる。また、シーケンスの繰り返し増幅 PCR に固有シーケンス バイアスが生じる。第三に、ランダムのプールから選択されたシーケンスは、比較的高価だが高スループットがシーケンス処理の高速化オプションを使用して配置できます...

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開示事項

著者は、競合する金銭的な利益を宣言していません。

謝辞

著者は過去の資金調達のための健康の国民の協会のおかげで、マイケル ・ r. グリーンのオリゴヌクレオチドを合成をありがちましょう。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ウリジン 5' a-チオ三リン酸NEN (マサチューセッツ州ボストン)NLP-017
アデノシン 5' a-チオ三リン酸NEN (マサチューセッツ州ボストン)NLP-016
バキュームマニホールドフィッシャーサイエンティフィXX1002500ミリポア 25 mmガラス微量分析真空フィルター
真空マニホールドミリポアXX2702552 1225サンプリング真空マニ
ホールドニトロセルロースミリポアHAWP
ニトロセルロースシュライヒャー&SchuellPROTRAN
Dephosphorlyation KitNEBM0508
T4 Polynucleotide KinaseNEBM0201S
Proteinase KNEBP8107S
T7 RNA ポリメラーゼNEBM0251S
RNasinPromegaRNase inhibitor
ガラスプレート標準規格
ゲル電気泳動装置標準標準
X線フィルム標準標準
アクリルアミドゲル溶液標準標準
ック ポリ

参考文献

  1. Schutt, C., Nothiger, R. Structure, function and evolution of sex-determining systems in Dipteran insects. Development. 127 (4), 667-677 (2000).
  2. Mahowald, A. P., Wei, G. Sex determination of germ cells in Drosophila. Ciba Found. Symp. 182, 193-202 (1994).
  3. Steinmann-Zwicky, M. How do germ cells choose their sex? Drosophila as a paradigm. Bioessays. 14 (8), 513-518 (1992).
  4. Salz, H. K. Sex, stem cells and tumors in the Drosophila ovary. Fly (Austin). 7 (1), 3-7 (2013).
  5. Gawande, B., Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Drosophila Sex-lethal protein mediates polyadenylation switching in the female germline. Embo J. 25 (6), 1263-1272 (2006).
  6. Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Genome-wide identification of alternatively spliced mRNA targets of specific RNA-binding proteins. PLoS One. 2 (6), e520(2007).
  7. Samuels, M. E., et al. RNA binding by Sxl proteins in vitro and in vivo. Mol. Cell. Biol. 14 (7), 4975-4990 (1994).
  8. Fujii, S., Amrein, H. Genes expressed in the Drosophila head reveal a role for fat cells in sex-specific physiology. EMBO J. 21 (20), 5353-5363 (2002).
  9. Kelley, R. L., et al. Expression of msl-2 causes assembly of dosage compensation regulators on the X chromosomes and female lethality in Drosophila. Cell. 81 (6), 867-877 (1995).
  10. Hager, J., Cline, T. Induction of female Sex-lethal RNA splicing in male germ cells: implications for Drosophila germline sex determination. Development. 124 (24), 5033-5048 (1997).
  11. Vied, C., Halachmi, N., Salzberg, A., Horabin, J. I. Antizyme is a target of sex-lethal in the Drosophila germline and appears to act downstream of hedgehog to regulate sex-lethal and cyclin B. Dev Biol. 253 (2), 214-229 (2003).
  12. Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal facilitates the transition from germline stem cell to committed daughter cell in the Drosophila ovary. Genetics. 182 (1), 121-132 (2009).
  13. Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal enables germline stem cell differentiation by down-regulating Nanos protein levels during Drosophila oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9465-9470 (2012).
  14. Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
  15. Singh, R., Banerjee, H., Green, M. R. Differential recognition of the polypyrimidine-tract by the general splicing factor U2AF65 and the splicing repressor sex-lethal. RNA. 6 (6), 901-911 (2000).
  16. Sakashita, E., Sakamoto, H. Characterization of RNA binding specificity of the Drosophila sex- lethal protein by in vitro ligand selection. Nucleic Acids Res. 22 (20), 4082-4086 (1994).
  17. Kanaar, R., Lee, A. L., Rudner, D. Z., Wemmer, D. E., Rio, D. C. Interaction of the sex-lethal RNA binding domains with RNA. EMBO J. 14 (18), 4530-4539 (1995).
  18. Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods Enzymol. 180, 51-62 (1989).
  19. Gish, G., Eckstein, F. DNA and RNA sequence determination based on phosphorothioate chemistry. Science. 240 (4858), 1520-1522 (1988).

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