方法論記事

レプリカの設定方法: 定量的測定線虫の寿命を高スループット方法

DOI：

10.3791/57819

⸱

2018年6月29日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Genetics, University of Rochester Medical Center, 2Department of Biostatistics and Computational Biology, University of Rochester Medical Center, 3Non-Clinical Statistics, Bristol-Myers Squibb, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester Medical Center

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここで述べるレプリカ セットのメソッド、定量的測定線虫の寿命/生存へのアプローチ、healthspan 高スループットかつ堅牢な方法でデータの品質を損なうことがなく多くの条件の審査をできるようにこのプロトコルは、戦略の詳細し、レプリカ セットのデータの解析のためのソフトウェア ツールを提供します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

レプリカ セットのメソッドですので、同じ量をより多くの治療法や条件を画面に単一の調査官、高スループット方法で寿命や線虫寄生線虫の生存率を定量的測定の試み時間データの品質の損失なし。メソッドc. の elegansの使用ほとんどの実験室は、一般的な機器を必要とする、従って採用する簡単です。アプローチは、従来の縦断的方法として時間をかけて 1 つのサンプルではなく、各観測点での人口の独立したサンプルの試金に集中します。ウェル プレートの井戸への液体の追加が伴いますを得点、線虫の移動を刺激して healthspan で定量化の変更が容易になります。レプリカ セットのメソッドの他の主な利点は、寒天表面 (例えばカビや菌類)、空輸の汚染物の減らされた露出、動物と散発的なミス (それはまだ、死んだ動物の呼び出しなど得点に堅牢性の処理が最小限生きている)。適切に分析し、レプリカ セット スタイル実験からのデータを表示する、カスタムのソフトウェア ツールも開発されました。ソフトウェアの現在の機能は、レプリカ セットのレプリカ セットし伝統的な (カプラン-マイヤー) 実験と同様両方統計分析の生存曲線のプロットがあります。ここで提供されるプロトコルは、従来の実験的アプローチ、レプリカ セットのメソッドと対応するデータ解析の概要について説明します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

高齢化の遺伝的基盤の理解に向けて最もトランスフォーマティブ技術の進歩の 1 つだった供給ベース RNAi線虫1の開発RNAi の実験的使用、する前に老化の多くの表現型は遺伝的扱いでした。RNAi の供給ベース、エシェリヒア属大腸菌の一致する内 dsRNA の生産によって達成される、内因性線虫mRNA: IPTG どちらかc. の elegansの cDNA を挿入またはの部分間で双方向の転写を誘導する、プラスミド2内で開いたリーディング ・ フレーム。C. の elegansをそのまま食らうとき細菌エシェリヒア属大腸菌、 dsRNA は内腔から SID 2 膜貫通型蛋白3、腸細胞に運ばれ、SID 14を介して動物の残りの部分を通して配布されます。各セル内外因性 dsRNA によって処理される複雑なダイサー、siRNA に新しいを作成する基本の相補的なペアリングを介して成熟した mRNA と関わりを持つ siRNA mRNA 二重。この二重が RISC の複合体によって認識され、切断され、それにより内在性 mRNA5を分解します。したがって、プラスミッド挿入を変更しただけ、線虫ゲノム内のほぼすべての遺伝子の機能を非アクティブ化することができます 1 つ。ライブラリ-コレクションの変換大腸菌株の約 86% のカバレッジを達成するために組み合わせることのできるいくつかの大規模な供給ベースの RNAi の作成をもたらしたこの発見にc. の elegans遺伝子6,が知られています。7。

我々 参照してくださいときに (WormBase のキュレーション RNAi 表現型の関連付けによって証明される) ように不活化、寿命を変える以上 900 の遺伝子の発見につながっている線虫の包括的なスクリーン供給ベースの RNAi の進歩により、以来gerogenes として。長寿コントロールの gerogenes の大半のための役割はちょうど少数の精液レポートでの RNAi の供給ベースを介して発見された (詳細については図 1Aと補足ファイル 1を参照)。いくつかの場合、これらの gerogenes は、RNAi 治療と寿命の変化の定量化が可能な測定を提供するために失敗する 1 つまたはいくつかの時点での生存率の測定に基づく同定されています。他のケースでこれらの遺伝子は寿命だけでなく、追加の加齢に伴う表現型の変化の定量的評価されている.例えば、我々 は以前通常と増加寿命減少インスリン/IGF-1 伝達を持つ動物のために必要な healthspan の変化を定量化 159 の遺伝子を識別しました。損失老化8の 1 つ以上の兆候として、これらの 103 の遺伝子不活 progeric 表現型の結果します。

いくつかの gerogenes は、100 以上の研究 (daf 16、daf 2、サー 2.1 など) と関連付けられている、以上 400 gerogenes 10 個以下の引用 (図 1 b、および補足のファイル 2) あります。したがって、包括的な供給ベース RNAi 画面が発見し、cursorily 推定 gerogenes の何百もの特徴、どのように寿命コントロールでこれらの遺伝子の機能とそれらの遺伝子産物の遺伝的相互関係まま悪い勉強しました。加齢に伴う表現型に対する完全縦断的分析 gerogenes (例えば間相互作用、asynthetic 相互作用など)の間の遺伝子相互作用を識別するための前提条件です。Gerogenes 間の遺伝的相互関係をより深く洞察を得ても RNAi の供給ベースの利点を活用して高スループットの量的な方法が必要です。

高齢化の最も一般的な代理メジャーは、寿命です。線虫 c. エレガンスの死亡率を測定するための従来のアプローチは、小さい人口サンプル内で時間をかけて個々 の動物の死を追跡します。動物の数が比較的少ない時間以上続いているし、定期的に白金線または生存率 (図 2 a) の指標として運動とまつげが猛烈優しく。このメソッドは簡単な直接測定の平均と最大の寿命を提供するので広く使用されています。しかし、この従来の方法は時間がかかり、比較的低スループット、動物および制御された方法で同時に測定できる条件の数を制限します。最近のシミュレーション研究が見つかりました多くの線虫の寿命の研究を行う条件9間の小さな変化を確実に検出できるように動物の十分に大きい数を分析していません。さらに、この従来の方法は、時系列、順番汚染をもたらすとすることができます破損したりますます壊れやすい、高齢の動物を殺す動物の同じコホートを繰り返し処理含まれます。

線虫の寿命を測定するための代替「Replica Set」手法を開発しました。このため、年齢同期、同質の動物の大規模な人口は小さい人口 (またはレプリカ) の数に分かれています。計画の実験の各時間のポイントをカバーする十分なレプリカ サンプルが生成されます。各観察時間時点でのレプリカのいずれかのリビングデッド、数のスコアは、修正動物、その複製の中で動物が破棄されます。したがって、独立した集団のシリーズ、全体として人口の期待寿命は、定期的にオーバー サンプリング (図 2 b) です。レプリカ セットの使用には動物や潜在的な環境汚染への繰り返された露出無しの繰り返し催促はありません。一時点で観測された生存率はすべて他の観察、処理を最小限に抑え、少なくとも桁違いでスループットが向上するから完全に独立。これは RNAi の何百もの同時に8,10クローンの寿命の変化量的に表わすことができました。

レプリカ セット、線虫の寿命をスコアリングのための伝統的な方法を介して線虫の寿命を実施するための詳細なプロトコルをご紹介します。方法と同様の結果が得られることを示す.我々 は自由に GPL V3 ライセンス (材料の表を参照) の下で提供するいずれかのアプローチを通じて生成された寿命データのグラフィカルな分析を支援するために開発されたソフトウェアがあります。"WormLife"は R11で書かれているし、Mac OS と Linux でテスト済みのデータのプロットのグラフィカル ユーザー インターフェイス (GUI) が含まれています。最後に、我々 は比較コントラストの各メソッドの制限、線虫の寿命の量的変化を測定するためのアプローチを選択する際の他の考慮事項を強調表示。

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プロトコル

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1. 従来法スコアリングが線虫の寿命

  1. 試薬の調製
    1. RNAi の供給ベースを介して不活化される遺伝子を識別します。HT115大腸菌2興味の RNAi のクローンを含む変換された株式を購入します。また、興味の遺伝子の cDNA を subclone L4440 プラスミドの multicloning サイトに。
      注: HT115 は、IPTG 誘導 T7 ポリメラーゼ活性細菌内の dsRNA の劣化を防ぐために使用されると RNase III 欠損大腸菌株です。RNAi の供給ベースを使用しない寿命研究、HT115 または標準 NGM プレートで OP50エシェリヒア属大腸菌に使用されるです。がすることができます。
    2. 3-6 (またはより多く) 6 cm 1 つのテスト条件 (レシピの補足ファイル 3 ) RNAi プレートを準備します。数ヶ月までの細菌を播種する前に 4 ° C で RNAi プレートを格納します。
    3. 変換されたエシェリヒア属大腸菌一夜 (16-20 h、37 ° C 180-220 RPM でインキュベーターを揺れ) を育てます。
      注: HT115大腸菌はアンピシリン (50 mg/mL) とポンドで育ちます。標準 OP50エシェリヒア属大腸菌の抗生物質耐性ではないとアンピシリンなし栽培されています。文化ボリューム プレート、数によって異なりますが、実験的なデザインによって、ポンドの 8 と 100 mL の間は、通常。
      1. ベンチトップ遠心分離機で 15-20 分間 3,000 × gで遠心分離によって細菌を集中します。、上清を吸引し、1 で餌を再停止/10 開始量 (すなわち10 x) HT115 (または標準 OP50 のアンピシリンなし) アンピシリンと LB の。
      2. 200 μ L 分注には、それぞれ 6 cm プレートに 10 x 細菌が集中しています。2 余分なバックアップ プレート、汚染の場合に使用すると、テスト条件あたり 3-4 複製を準備します。プレートを準備しているときラベルを貼って色コードまたは類似の符号化方式を使用してアッセイを得点実験者は実験条件に盲目。コードが記録されていることを確認します。
      3. すべての液体を吸収するまで層流ベンチなどクリーンな環境で乾燥またはベンチに一晩乾燥してカバー プレートを許可する開いているプレートを許可します。過剰乾燥させず、寒天を乾燥されるように乾燥しながら板を監視します。
        注: プレートを過剰乾燥寒天寒天に穴を掘るにc. の elegansを引き起こすの割れに繋がりますウェットは、寒天培地の表面はまた、穴を掘るを促進します。
    4. DsRNA 生産の誘導できるように室温で一晩 (最大 24 時間) ワーム ボックス内乾燥プレートを格納します。常温 1 日後 (プレートは、乾燥を防ぐ) に密封ジッパー ロック袋に最大 2 週間までの 4 ° C でプレートを格納します。使用する前に、板を導入の浮遊真菌汚染物質から結露を防ぐためにジップロックの袋の中で常温に戻ります。
  2. 次亜塩素酸治療と線虫の同期
    注: は、M9 と次亜塩素酸のソリューション レシピの補足のファイル 3を参照してください。
    1. M9 と妊娠の大人動物を収集します。外れてガラス ピペットを使用すると、2 × 15 mL チューブに移動します。
    2. 30"~ 2,000 rpm でチューブをスピンします。チューブの下部に線虫でのプールをチェックします。上清を吸引します。M9 ソリューション、スピンと吸引を繰り返し 2 回洗います。
    3. 再 M9 の 4 mL にc. の elegansを中断します。次亜塩素酸溶液 2 mL を追加します。すぐに定期的な活発な動揺と 〜 3 分のための渦。3 分後に解剖顕微鏡下で卵の雲を探します。渦追加 10-20 s 3 分後卵が解放されていない場合。
      注: 次亜塩素酸治療のタイミングが欠かせません。治療を生き残るものが妊娠の大人の卵です。〜 3 分後妊娠の大人がこじ開けるし、卵が流出します。ただし、卵が次亜塩素酸の場合リリース後も長い彼らは死んでしまいます。逆に、妊娠大人が次亜塩素酸のソリューションが十分な長さでない場合、卵はリリースされません。
    4. ステップ 2.1.2 のように 2 回 M9 ソリューションですぐに洗ってください。
    5. 再線虫卵ペレット 3 mL M9 と新しい 15 mL チューブへの転送を中断します。20 ° C で回転と M9 溶液 3 mL で夜通し孵化胚をように
    6. L1 解決策 3 の 10 μ L をさけた μ L あたり L1 動物 (または胚) の密度の計算 x 6 cm プレート、L1 l1/μ L の平均数を計算する動物の数。
      注: L1 動物は、時間をかけて解決します。したがって、L1 ソリューションを定期的に混合する必要があります。
    7. プレートごと種子 50 L1 動物。板を反転し、ゴムバンドでシールします。プラスチック製のワーム ボックスに板を配置します。大きなジップロックの袋にシール ボックス。20 の ° C の定温器に移動します。
  3. 5-フルオロ-2'-デオキシウリジン (FUdR) の添加による子孫の生産を防止します。
    1. 20 ° C で L4 段階まで動物を育てる動物を L4 に開発した同期するかどうかを確認して (手順 2.1.7) を播種後約 40 時間。
      注:線虫発生時間は料金が特徴づけられていない変異動物の12成長率は経験的にテストする必要があります異なる温度で異なります。
      1. 50 160 μ L を追加 L4 動物と各 6 cm プレートに x FUdR。
        注: L4 段階で FUdR を追加するが重要です。便宜上、1 g FUdR 10 mL に溶解 0.2 μ m フィルターと 10 cc の注射器で純水の H2o. フィルター滅菌株式 FUdR FUdR の 1,000 x 株を作る。在庫滅菌 1.5 mL チューブに分注 〜 1 mL。凍結し、-20 ° C で保存
    2. 男性の存在のためのプレートを調べて線虫。すべての男性を削除します。
      注:寿命は測定通常両性具有、男性ではありません。チームメイトの両性具有ライブ FUdR13の存在下でも、つがいでない動物よりも短い。男性はより小さく、薄く、両性具有、独特のかぎ尻尾14で容易に識別することができます。
    3. ボックスをジップロックの袋に戻します。20 ° C の定温器に戻ります。
  4. 生存率をスコアリング
    1. 毎日優しく白金細線やまつげで頭に動物に触れることにより生存率をスコアします。スコア死者を移動し、(図 2 a) プレートからそれらを削除に失敗する動物。観測時間ポイントごとにそれぞれの条件のために死んだ観察数を記録します。
      注: 得点バイアスのリスクを減らすためには、実験者実験条件は盲目のままする必要があります、同様にする必要があります参照しない結果前の時点から得点中。
    2. 破裂、検閲動物が他の明白な開発上の欠陥、またはクロールまで料理の側に死ぬ: これらの動物とそれぞれで数時間の観測記録ポイント統計分析検討のため削除。さらに、男性が見つかった場合は、それらを削除し、観測数を記録します。
    3. 生きている動物がなくなるまで、手順 1.4.1 から毎日を繰り返します。
      注:エシェリヒア属大腸菌の芝生で大幅減少するまたは菌がプレートに成長、残りのすべての動物を適切な RNAi と FUdR 新鮮なプレートに転送を開始します。
  5. データ分析 - プロットと統計
    1. 入力または非パラメトリック カプラン-マイヤー推定15ログ ランクと生存解析支援ソフトで開いている記録された観測データは、16 (を参照してください補足ファイル 3) をテストします。修正動物を必ず入れてください。場合は、認められた男性は含めないでください。
      注:ソフトウェアとの間のデータ形式が異なる場合がありますが、一般的な形式は、別々 の行にそれぞれの個々 の動物を記録するは。死者として認められた動物で実験的 timepoint は、「イベント」時間です。検閲された場合、「イベント」時間は動物の修正で timepoint です。通常、フィールドまたは修正観測を示すチェック ボックスがあります。
    2. カプラン ・ マイヤー生存曲線をプロットします。多くの条件は、読みやすさを改善するために測定した場合は、単一のプロットのためのより少ない六つの条件を選択します。
      1. データの問題を視覚的に感じ取る-欠測値、予期しない結果、等をチェックします。-統計解析の前にこれらのアドレスと。
    3. ペアを実行するソフトウェアのログランク検定関数を使用して統計上の比較。右側センサード データ修正結果の治療のための任意の使用可能なオプションが適切に設定されていることを確認します。

2 得点が線虫の寿命のレプリカのセット方法

注: 3-6 枚条件に伝統的な方法の必要がありますが (1.1.2 を参照してください。 上)、レプリカ セットのメソッド (手順 2.2.2 下記参照) より多くが必要です。従来実験 (図 2 a) を通して同じ板の動物が発生します。対照的に、レプリカ セットと動物のみを獲得している一度: 多くの同一の複製は、1 つの複製の (試験) ごとのそれぞれの時点でスコアに実験の先頭に設定されて (図 2 b)。

  1. ライブラリのセットアップ。
    注: RNAi のクローンを配ってに関する追加詳細をレプリカ セットのプロトコルは RNAi の多くのクローンの同時の得点に影響を受けやすい、ここで覆われている、一度に 100 以上ものクローンをスケールできます。RNAi のクローンのコレクションは、グリセロール 96-well プレートで維持として保持されます。レプリカ セットの実験は、24 ウェル プレートを使用します。それぞれはよく RNAi クローン、さまざまな化学治療法、動物系統などのコレクションに対応する別のテストの状態です。
    1. 次の条件が満たされているなど、RNAi クローンのコレクションに対するプロジェクトサブ ライブラリのレイアウトを組み立てます。
      1. 96 ウェル コレクション内でも A1 は空のベクター ネガティブ コントロールを確認します。
      2. すべての 24 のウエル内でランダムに追加の空のベクター コントロールを挿入します。
      3. など各 24 ウェル プレートが 1 つにランダムに挿入される、ネガティブ コントロール (図 2)、96 ウェル プレートを 24 ウェルのブロックに分割します。
      4. 24 井戸 (図 2) のすべてのグループ内でランダムにポジティブ コントロールを挿入します。
        注: 肯定的な制御は実験の質問に依存しています。たとえばときに、その増加寿命をクローン RNAi のコレクションを見て、 daf-2(RNAi)は頻繁に含まれています。逆に、短くされた寿命を見て、 daf-16(RNAi)がよく使用されます。
  2. レプリカ セットの準備
    注:必要な複製の数時間ポイント (図 2 b) の最小数と同じです。1 つは事後周波数 (例えばすべて他の日得点の 40 日間を実行してレプリカ セット実験 20 レプリカ セットのための最低限の準備が必要ですを得点し同様、実験の開始前に寿命を測定するためにどのくらい知っている必要があります。各は、実験の開始時に条件になります)。〜 5 余分なバックアップ セット (2.2.2 と 2.2.2.3 下記参照) をすることをお勧めします。
    1. RNAi プロジェクトサブ ライブラリの新鮮なスタンプを作成するには、200 μ L LB + アンプ/96 ピン板レプリケーターを使用して次の手順で 96-well フォーマット (600 μ L プレート) のウェルに予防接種します。
      1. 96 ピン板レプリケーターを滅菌するには、順番に 50% の漂白剤、超純水の H2O およびエタノールのピンを浸漬します。少なくとも 30 の浸漬ピンを保つため漂白剤とエタノールの手順の s。 エタノールに浸漬後のヒントを簡単に炎します。手順を繰り返します。
        注:すべての漂白剤を洗い流すさい、漂白剤はステンレス製ピンを腐食することができます漂白剤を長期間にわたって公開されるピンを放置しないでください。
      2. 慎重に接着ホイル カバー冷凍 96 ウェル グリセロール ストック ライブラリ プレートからとそっとを削除が、まだ冷凍グリセロールの井戸にしっかりと滅菌プレート レプリケーターのヒントを挽きます。200 μ L LB + アンプ文化を接種して、透過性膜で接種プレート シールします。ベンチトップ一晩培養する文化を許可します。
      3. ステップ 2.1.1 のようにプレートのレプリケーターを滅菌、慎重に一晩成長後液体培養プレートからシールを削除、レプリケーターのピンの先端を浸します。隣接する観光スポットの間残っている十分なスペースを確保する、小さな円運動で軽くプレートにピンから長方形の LB アンプ + テト寒天培地、および転送細菌にも圧力とヒントを適用します。37 ° C で寒天プレートに一晩成長するコロニーを許可します。補足ファイル 3 LB + アンプ/テトの準備のために参照してくださいプレート。
      4. 使用前にパラフィン フィルムで包まれる寒天培地 4 ° c 反転 (下蓋側) を格納します。
        注: 植民地蓋側を格納する RNAi クローンが交差汚染の結露になります!RNAi クローン保持時間の長さが可変の IPTG 誘導後 dsRNA を誘導の効果として、特定の RNAi のクローンによって、4 ° C で 2-8 週間のエシェリヒア属大腸菌のコロニーを格納できます。RNAi のクローンの小さなコレクションは、RNAi 効率経験的決定する RT qPCR によるノックダウンを確認します。
    2. 24 ウェル プレートの実験の一つの試験に必要な最小数を計算する: (# レプリカ セット枚) x (予想される # 時間ポイント)。いくつかの余分なレプリカ セットが (図 2 b) 汚染などの問題を処理するために含まれていることを確認します。
      注: RNAi クローンの総数は、各時間ポイント (図 2) のレプリカの 1 つのセットを作る 24 ウェル プレート数を決定します。
      1. 1.1.2 (レシピの補足ファイル 3 ) のステップとしては、24 ウェルのプレートを準備します。色コードまたは類似の符号化方式を使用してアッセイを得点実験者ブラインド実験条件になりますので、それらを準備する際は、プレートをラベルします。
      2. 1 セット 1.5 mL LB + アンプ文化 (2.2.2 を参照) すべての 10 のレプリカを接種します。96 よくディープ ウェル プレート (2.1.3) のようにプレート レプリケーターと 2.1.4 (図 2左) から細菌のコロニーを使用して文化を接種します。通気性のある膜で封印、揺れで 20 h (37 ° C) を育てます。
      3. 調節可能な先端の間隔 (図 2右) で 6 もマルチ チャンネル ピペットを使用して各プレートに一晩かけて培養の 120 μ L をシードします。層流フードで発見されるまで、すべての液体を吸収プレートを乾燥させます。過剰乾燥しないでください。プレートは室温で一晩を格納します。
  3. 次亜塩素酸処理による線虫の同期
    1. 動物実験に必要な最小数を計算: 最小数必要な l1 = (15-20 動物/ウェル) (24 ウェル/プレート) (プレート/レプリカ セット X)(Y replica sets)。
      注:レプリカ セットの方法は、従来の方法よりもより多くの動物を必要があります。10 cm ワンプレート妊娠ワームがいっぱい妊娠大人の密度によって 20,000-50,000 L1 動物を提供できます。同様に、20 の 6 cm プレート 〜 30,000 L1 動物の周りをもたらします。必要な動物の最小数を 2 倍にする卵の準備を準備する予定です。場合に備えて人口は飢えている、再フィードまたは新しいプレートにチャンクし、進む17,18前に食糧の少なくとも 3 つの世代を許可します。必ず戻って残り l1 を凍結してください。
    2. 手順 1.2 を 1.2.6 を取得する従来の方法のように同期 L1 動物です。各もため池を利用した、6 も調整可能な間隔ピペットと試薬、1.2.7 のように 15-20 L1 動物をシードします。定期的にソリューションを防ぐ動物のセトリング L1 をミックスします。
  4. 5-フルオロ-2'-デオキシウリジン (FUdR) の添加による子孫の生産の防止
    1. 1.3.1 の手順に従ってください。 滅菌 50 x FUdR ストックを準備 (1.3.1.1 の手順を参照してください)。
    2. 動物に達する L4、追加 50 の 25 μ L と 24 ウェルのウェルに x FUDR プレート 6 チャネル間隔可変ピペットを使用しています。
  5. スコアの生存率
    1. レプリケート プレートの 1 つのセットを削除して M9 ソリューション、好評につき、記録合計動物と井戸を洪水動かない動物ワーム ピック (図 2 b) を使って頭の上をそっと触れます。動物の移動に失敗して死んでいると獲得しています。得点板を破棄します。レコードの生存率は毎日。
      注: 動物ショー総形態異常、破壊の開発に失敗または井戸の側に這い、死んだと合計値の両方からそれらを除外することによって検閲されるように。
      1. 他の値から個別に各時点での各ウェル内で検閲される動物の数を記録します。
      2. 食品がないか、汚染された井戸を獲得していない (例えば菌やスライム);このような井戸は、修正と見なされます。すべての動物は形態学的または発達の欠陥を表示する場合また、井戸を検閲します。この時点でクローン/よくこの RNAi のため検閲のイベントを記録します。
      3. レプリケート プレートを獲得した後に、それを破棄します。すべての井戸の間ですべての動物が死んでいるまで毎日新しい複製を得点設定を続行します。得点バイアスのリスクを減らすためには、実験者実験条件は盲目のままする必要があります、同様にする必要があります参照しない結果前の時点から得点中。
      4. 井戸の中ですべての動物が与えられた時点で死亡し、その日の得点後、調べる場合すべての動物は、2 つの連続した時間のポイントの死者として得点しているかどうか、よく考える。もしそうなら、以降の時点でよくこれの生存率をスコアリングは必要ありません。
      5. その他の独立実験試験を実施します。メモ試用版の番号で前の試験で別々 に連続した試験の結果を追跡します。

3. グラフ データ

注: レプリカ セットをカーブ フィット法はおおよその平均と最大の寿命に適用されます。線虫 c. エレガンスの死亡率を評価するためのパラメーターは、ロジット曲線19 をフィットします。 新しいプログラムを (レプリカ セット); のロジット曲線をプロットの開発したほとんど生存のツールは、ロジット ・ カーブ ・ フィッティングをサポートしていないと(従来の方法) の Kaplan-meier 曲線にも対応します。

  1. ソフトウェアを使い始めます。(材料のセクションを参照) の現在のバージョンのリリースの zip ファイルをダウンロードします。フォルダーに zip ファイルを抽出します。追加のインストール手順については解凍したフォルダーの「readme」ファイルを参照してください。
  1. プロット インターフェイスを起動します。"Code"ディレクトリの場所は、zip ファイルから抽出したフォルダー (など 「/ユーザ/ユーザ名/Desktop/WormLife/コード」)。
    1. 識別フォルダーのパスの代わりに R コンソールに次のコマンドを入力します。報道機関来光オペレーションズリサーチ後各入力行を返す: setwd("/Users/UserName/Desktop/WormLife/code") 1), source("plotGUI.R") 2), 3) openMain()。
    2. 図 3Aに示すように、デフォルト画面を立ち上げて新しいウィンドウにロードするためのインターフェイスのための時間を許可します。R をバック グラウンドで実行できます。
  2. コンマ区切り値 (CSV) またはタブ区切り値 (TSV) ファイルとしてデータをフォーマットします。列および解析のタイプに依存して、名前を指定します。データの書式設定済みの例の補足ファイル 4 (レプリカ セット) および補足のファイル 5 (伝統的な/カプラン-マイヤー) を参照してください。
    注:データは、トライアル 1 時間ポイントごとのひずみ/トリートメントごとに 1 行すなわち、「長い」の形式で指定する必要があります。CSV ファイルは、プラットフォーム間の互換性に適しています。
    1. スキップまたは修正された観察に対応する行を削除します。データをインポートするときエラーにつながる可能性があるために、行方不明または数値以外の値の有無を確認します。
    2. 従来のカプラン ・ マイヤー スタイル分析の独立した試験区からデータはプールはそれら別々 に。レプリカ セットの分析、複数の試験からのデータをプールし、"TrialView"機能を使用して調査 (6.3.3.4 を参照)。
  3. プロットのインターフェイスを使用してください。
    1. データ ファイル (「ファイル」メニューの下の「インポート」) をロード] ダイアログ ボックスを使用します。「.Csv」ファイルを開くに変更するドロップダウンを「.csv」ファイルの種類 (既定では".txt/.tsv")、データ ファイルを持つフォルダーに移動します。ここでファイルはレプリカ セットのサンプル データ (補足ファイル 4) です。
      メモ: データセットが既に開いているときにファイルをインポートする、現在のデータセットに置き換わります。
    2. 選択したファイル (レプリカ セットの図 S1A ) の列を識別する順を追ってのインポート ウィザードを開始するインポートするファイルを選択します。入力データは、レプリカ セットの実験に対応している場合は、スタディ タイプの「ロジット」を選択します。
      注: ワークフローのインポートはレプリカ セット (図 S1A) と伝統 (カプラン-マイヤー) (図 S1B) の間で異なる。
    3. 「データをのプロット」。データのプロットを開始する「行の追加」を選択します。(行は条件の 1 セットに対応します。機能があります実験を支援するための多くの条件がテストされた)。
      1. プロット制御条件 - 例データ L4440 と N2 (WT) の場合 (空のベクター) RNAi が適切。線の追加ウィザードを開始する「グラフ」メニューの下の「追加ライン」の選択: の行を表すためのプロットとグラフィカルなパラメーターは、条件を選択します。
        1. 3.3.3.1 の手順を繰り返して別の条件のカーブを手動で追加するには
        2. 色を変更またはプロット ラインのための記号、「グラフ メニュー」の下で「行の変更」を選択します。
        3. すべての行をクリアすることがなく、行を削除するには、「グラフ メニュー」の下で「行の削除」を選択します。
        4. 現在のプロットのすべての行をクリアするには、「グラフ メニュー」の下「オフ ライン」を選択します。
        5. 自動的に選択した最大 x 軸 (時間) の値をオーバーライドするには、「セット X スケール」「グラフ メニュー」の下を使用。
          注: y 軸 (生存率) を 20% の増分で 0% (下) 100% (上) を常に表示されます。X 軸は 5 単位で常に表示されます。プロット イメージを保存した後のラベル付けに柔軟性を有効にするのには、軸ラベルは印刷されません。
      2. 現在表示されているプロットの JPEG 形式の画像を保存すると、「ファイル メニュー」に「プロットの保存」オプションを使用します。現在の印刷のみが保存されます。
      3. 1 つの実験で多くの異なる条件の個々 のプロットを作成する、ソフトウェアは、「シリーズ」のプロットの定義とをことができます。
        注: 大規模な実験を操作するとき、シリーズのコンセプトの実装により効率が向上します。
        1. 空白プロット ワークスペースから開始する場合は、すべてのプロット (3.3.3.1 参照) シリーズで一貫しているは、制御条件に対応する行を追加します。
        2. [グラフ] メニューで「定義シリーズ」のシリーズをを定義します。シリーズで最初に表示する行に対応する条件を選択します。1 つだけを選択することができます。3.3.3.1 のように、行のグラフィカルなパラメーター (ライン色とのプロット記号) を選択します。
        3. 異なったテスト条件のためのプロットを確認します。両側、トップ メニュー バーの (図 3 a-C) と同様、メイン プロット ウィンドウの左/右矢印ボタンを使用して、条件間」シリーズのライン"の表示を切り替えます。
          注: 選択した系列線が以前に追加したコントロール/参照線の一つとして同じ条件の場合新しい線が重ねて表示されます。
        4. その他の機能利用可能 (時系列プロットの保存と Trialview「3.3.3.4 を後者のため) シリーズを定義します。シリーズを定義すると、新しいフォルダーにシリーズの各プロットの個々 のプロット イメージ ファイルを保存するのに「ファイル」メニューから「シリーズのプロットを保存する」オプションを使用します。
      4. Trialview-は、レプリカ セットの実験の独立した試験の結果を可視化。サンプル グループの 1 つ以上の複数の試験を行う場合は、個々 の試験からのデータと別々 に独立試行 (参照してください図 3 D) 間の一貫性を評価するすべての試験からプールされたデータをプロットします。
        1. 3.3.3.3 で説明されているようにシリーズを設定します。別の試験は、指定された参照/コントロール サンプルのそれぞれの試験を巡るそれぞれの別の画像で「さまざまな」サンプルのプロットされます。
        2. TrialView 画像を保存、データ メニューに「印刷 TrialViews」に行くJPEG 画像は、シリーズの各プロットの出力になります。
          注: 3 D 図で例の結果、2 つの試験とケースです。
    4. レプリカ セットのデータの平均寿命一覧の表。視覚的に、データの妥当性を確保するため曲線を検査し、 "概要テーブルを選択".種類ごとのサンプルの平均寿命値 (ロジット曲線上 50% 生存時) のテーブルを保存する [データ] メニューのオプション
  4. レプリカ セットのメソッドを介して生成されたデータの統計的評価
    1. レプリカ セットの実験から 2 つのグループ間の統計解析、変更およびリリースの zip ファイルで提供される R スクリプトを実行する (参照してください"WormLife 統計解析テンプレート スクリプトです。R")。
      注意: R の能力は、スクリプトを実行する必要はありません。その他のドキュメントは、ファイル内のコメントです。このスクリプトは、例のレプリカ セットのデータの分析の準備ができてです。適切な形式でユーザーが生成するデータ (補足ファイル 4を参照) も分析できます。
      1. R (R GUI または RStudio) スクリプト ファイルを開きます。
        注: これはそれを実行せず、スクリプトが表示されます。
      2. お使いのコンピューター上の場所に合わせて必要なファイルの場所を変更します。
        注: これらのファイルのパスが「完全修飾」する必要があります (つまりフォルダーを含むファイルの完全な場所を含める必要があります)。
        1. "WlDir"(ディレクトリの場所)、「データファイル」(レプリカ セットのデータ ファイルを分析する)、"compFile"(該当する場合、実行する比較の仕様)、「outputPath」(結果ファイルが書き込まれる場所のパス (ファイル/フォルダーの場所) を変更)。
      3. 分析するファイルの列名がファイルの例と異なる場合は、「データ ファイルの列を指定する」のセクションで列名を設定します。各パラメーターに対する列を指定します。研究には複数の系統がない RNAi (またはその他の治療) (例: "no_treatment"等)のすべての行の空白のエントリまたは同じデータ ファイル列を含めます。
      4. "CompFile"パラメーターを設定します。NA に"compFile"パラメーターを設定すると、グループのすべての可能な一対比較が実行されます。
        注: グループは、ひずみ/遺伝子型と連結され、"strain_treatment"として表示されます、治療の組み合わせによって定義されます。多くのグループの大きい研究の比較を指定する CSV ファイルを指定できます。"Comps_rsm_example.csv"ファイルの例を参照してください。
      5. モンテカルロの再サンプリング回数を設定 ("k.resamp"、既定値は 1,000 です)。
        注: ときもいくつかのイテレーションが実行されます; P-値が 0 に返されるこのような場合は、レポートを適切な"p < 0.01"(場合 k.resamp = 100)、または」p < 0.001"(場合 k.resamp = 1,000)、等
      6. スクリプトを実行: RStudio で「ソース」ボタン (編集ウィンドウの右上) または R GUI の"編集"メニューの"ソース文書"。(実行いくつかの時間がかかることがあります)。
      7. R「忙しい」インジケーターが表示されなくとき開いて出力ディレクトリが (生存期間中央値、p 値、平均寿命が前年) 各比較の結果テーブルになります。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

任意の新しい方法論の開発、新しいメソッドは従来から認められた結果を繰り返すし、フィールド内で基準を満たしていることが不可欠です。我々 は以前に経験的、レプリカ セットと線虫の寿命を試金するための従来の方法と同様の結果20を生成します。野生型線虫(N2) 通常 20 ° C で維持は、我々 は伝統的な (図 4 a、黒線) とレプリカ セット アプローチ (図 4 b黒) の両方で観察 20、25 日間住んでいます。したがって、両方の方法は合理的に野生型寿命を概算します。また、新しいメソッドがテスト条件と大幅な変更を検出するための統計的検出力の間の変更を正確に定量化する解像度を持つことが不可欠です。私たちの以前の研究では、線虫の寿命の決定因子である転写因子の Myc 家族を発見しました。mml 1 mxl 2エンコード...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

従来およびレプリカ セット メソッドでは、年代順に老化させた動物の同期必要があります。我々 は、妊娠の大人の受精卵のみが治療を生き残るため妊娠大人の次亜塩素酸処理を使用して動物を同期するメソッドを含めます。これらの胚は液体懸濁液で孵化し、幼生期 (L1) で逮捕発達。食糧 (例えば大腸菌発現に dsRNA 興味の遺伝子) に L1 動物, 播種後の動物は開発を再開します。残りのシードされていない L1 動物を凍結および液体窒素または-80 ° C のフリーザーに無期限に保存できる利点がある妊娠大人の次亜塩素酸処理による L1 動物の同期します。このように、将来の研究のための貴重なリソースを作成して再現性の向上、実験のセットアップの時に各菌株のサンプルが保持されます。しかし、妊娠の大人動物の次亜塩素酸治療老化研究22同期の動物を取得する一般的な方法ですが、L1 の逮捕は飢餓応答。したがって、いくつかの研究所は、プレート上で発生する次亜塩素酸治療を全体で断念し、(すなわち卵を産む) いくつかの時間のため卵を産む数妊娠大人孵化できるようにいず...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本稿で説明するこの作業によって提供された資金: ロチェスター大学事務所の学長、医学部と歯学研究科長のオフィスで健康科学センターの計算技術革新 (HSCCI);エリソン医療財団新しい学者エージング フェローシップ (AG-NS-0681-10) の資金提供者に役割研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備したないです。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
IPTG (イソプロピルベータ-D-1-チガラクトピラノシド)Gold Bio12481C100
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine)Alfa AesarL16497
24 well culture platesGreiner Bio-One#662102
Retangular non-treated single-well plate, 128x86mmThermo-Fisher242811
600 µL 96ウェルプレートGreiner Bio-One#786261
2mL 96ウェルプレートGreiner Bio-One#780286
通気性プレートシールVWR60941-086
96ピンプレートリプリケーターNunc250520
バクトペプトンVWR90000-368
細菌寒天Affymetrix/USB10906
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- AhringerSource BioscienceC. elegans RNAi Collection (Ahringer)Kamath et al, Nature 2003も参照。
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- VidalSource BioscienceC. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)Rual et al, Genome Research 2004.このライブラリはDharmaconからも入手できます。
WormLife- レプリカセット生存分析用ソフトウェアSamuelson LabN/Ahttps://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife
L4440 Empty Vector PlasmidAddgene1654
https://www.addgene.org/1654/ Wormbasehttp://www.wormbase.org/ 
オアシスhttps://sbi.postech.ac.kr/oasis2/ 
グラフパッドプリズムhttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ 

参考文献

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