方法論記事

細胞膜の末梢関連タンパク質の分割の決定

DOI：

10.3791/57837

⸱

2018年6月15日

 ,  , 
1Department of Experimental Plant Biology, Faculty of Science, Charles University

この記事について

訂正のお知らせ

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、末梢関連タンパク質の蛍光タグ付きのプラズマ膜協会のレベルの定量的分析を実行するためのプロトコルを提案する.メソッドは、膜の計算の分解、細胞膜蛍光マーカーの付いた信号の細胞質成分に基づいています。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このメソッドは、あらゆる蛍光タグ末梢に関連付けられている蛋白質の膜間での蛍光強度のプロファイルを使用してパーティション分割膜による高速アプローチを提供します。測定された蛍光プロファイルは、細胞周囲に対して垂直線に沿って膜と細胞質の蛍光分布モデルによる取り付けられています。このモデルは、FM 4-64-ラベルの付いた原形質膜と細胞質の蛍光タグのマーカーを発現する参照細胞の蛍光強度の値から構成されます。さまざまなセルタイプおよび生物に応用することができます。ただし、非近隣の細胞の細胞膜だけを評価できます。この顕微鏡を用いた高速メソッドは実験、細胞膜関連マーカーの微妙な動的変更が予想されるとを定量化する必要があります、例えば、阻害剤治療、蛋白質の突然変異体バージョンの分析に適して信号伝達の観察。メソッドは、ユーザーフレンドリーなインターフェイスとして機能する ImageJ マクロと結合されたマルチプラット フォーム R パッケージに実装されます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

末梢に関連付けられている膜蛋白質は、細胞シグナル伝達経路の主要なコンポーネントです。過渡膜協会そして解離細胞膜と細胞質の間のシグナル伝達のために重要である彼らの基本的な役割の一つであります。脂質アンカー (N-ミリストイル化、アシル化、S またはプレニル化) または脂質結合ドメイン ( 、ホスファチジン酸ホスファチジルイノシトール隣酸塩との相互作用によって、細胞膜の末梢関連プラズマ膜タンパク質を取り付けることがなど)。

これらの蛋白質の特性は、プラズマ膜結合検査生体内で、例えば、蛍光タグ付きタンパク質が主要アミノ酸のサイト指示された突然変異誘発によって変更されたとき、または影響を与える様々 な阻害剤と扱われる脂質シグナリング。周辺膜蛋白質の分布主評価されている質的に、特に場合は、蛋白質の再分布が明らかなとき。提案手法は、蛋白質の再配布、部分的にしかと定量的評価が必要な状況に最適です。膜協会は共焦点から推定したときの頻繁に使用されるアプローチ レーザー走査型顕微鏡画像のない細胞膜と細胞質の1、2、蛍光強度の比が簡単なと正確になります。細胞膜での蛍光強度は、特定の蛍光顕微鏡法および光学素子の使用3の光回折特性による原形質膜と細胞質の信号の重ね合わせを反映しています....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 生物学的材料の調製

  1. 興味として細胞質マーカーの蛍光タグ蛋白を発現する生物学的材料を準備します。導入に記載されている手順に従います。

2. 共焦点レーザ走査型顕微鏡

  1. 準備セクション 1 fm 4-64 染料7素材を染色。
    1. 研究材料に適している汚損のプロトコルを適用します。タバコ細胞のジメチルスルホキシド溶液 4 64 10 ミリメートル FM の 0.2 μ L の細胞懸濁液 200 μ L を染色します。
      注: FM の典型的な染色濃度 4 64 染料ジメチルスルホキシドで 10 mM 原液を使用して 10 μ M についてです。FM 4-64 の可能な最低の濃度を使用して、適切な染色と氷 (FM 4-64 でき、低温プラズマ膜特性に影響を与える) のセルを孵化しないで。すぐに共焦点顕微鏡を用いた観測を続行します。染色と画像集録間隔は 10 分; より長くなりません。それ以外の場合、染料のエンドサイトーシス影響を及ぼします FM 4-64 の染色します。
    2. 複数サンプルを連続処理し、実験の先頭にすべてのサンプルは染色されません。
  2. 1 つのセルあたり 1 つの赤道共焦点セクションをキャプチャします。
    1. FM 4-64 (2 番目のチャンネルである必要が....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

N-ミリストイルおよびホスファチジルイノシトール リン酸11,と静電相互作用を介して細胞膜に関連付けられている植物固有の末梢に関連付けられている膜タンパク質である DREPP10 12です。 DREPP 植物細胞内カルシウム シグナル伝達機械のコンポーネントとして記述され、骨格13,14ともやり取りします。提示実験で野生型タバコ DREPP2 における非突然変異体バージョン (Gly2 アラで代用) GFP 付けられた6とタバコによる 2 懸濁液細胞15 CaMV 35S プロモーター16の下で表されます。3 日齢 (希釈後 3 日) で測定したこれら.......

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここで説明する方法は、膜が末梢関連タンパク質に蛍光強度5の測定に基づく他のアプローチに比べて分割のより正確な推定を生成します。このメソッドの主要な改善は、光の回折と原形質膜と細胞質の信号の重ね合わせ、考慮します。ただし、これらのメソッドの結果は、平均細胞質膜位置に蛍光強度の比較に基づく簡単な法の結果との相関 (6図以前) のような信号、この手法の主な利点特に、膜信号が細胞質の信号よりも低い結果の関連性の推定を可能にする (信号分解による原因不明) の残留可変性の決定であります。タンパク質の分配の計算は 1 ポイントだけに基づいていないために、この方法は信号ノイズをより堅牢なも。

分析には、共焦点画像のみ 1 つ 2 つのチャネルが必要です。高速画像取得が重要な要件 ( FRAP アプローチ18長いタイム ・ ウィンドウのタンパク質拡散現象の測定に基づくと対照をなして説明メソッドはよりダイナミックな生体内でのアプロー.......

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者が明らかに何もありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロジェクトは、当社でサポートされていた私は、LO1417 (文部省、青少年、チェコ共和国のスポーツ)。

....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
FM 4-64サーモフィッシャーサイエンティフィックT13320原形質膜染料
ジメチルスルホキシSigma-AldrichD4540 シグマ染料 溶剤
通常の機器(顕微鏡スライド、ピペット、チップ、チューブ)細胞標識および顕微鏡用機器
共焦点レーザー走査顕微鏡
通常のコンピュータ
ド

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barbosa, I. C. R., Shikata, H., Zourelidou, M., Heilmann, M., Heilmann, I., Schwechheimer, C. Phospholipid composition and a polybasic motif determine D6 PROTEIN KINASE polar association with the plasma membrane and tropic responses. Development. 143 (24), 4687-4700 (2016).
  2. Kato, M., Aoyama, T., Maeshima, M. The Ca2+-binding ....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

訂正

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins
Posted by JoVE Editors on 11/02/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins. The Affiliations section was updated.

One of the affiliations was updated from:

Department of Experimental Plant Biology, University of Science, Charles University

to:

Department of Experimental Plant Biology, Faculty of Science, Charles University

タグ

Plasma Membrane PartitioningPeripherally associated ProteinsFluorescence Intensity ProfilesConfocal MicroscopyFM 4 64 StainingImageJ MacroR Package AnalysisProtein Cytoplasm DistributionMembrane Cytoplasm ModelFluorescence Profile Fitting

関連記事