細胞膜の末梢関連タンパク質の分割の決定

末梢に関連付けられている膜蛋白質は、細胞シグナル伝達経路の主要なコンポーネントです。過渡膜協会そして解離細胞膜と細胞質の間のシグナル伝達のために重要である彼らの基本的な役割の一つであります。脂質アンカー (N-ミリストイル化、アシル化、S またはプレニル化) または脂質結合ドメイン ( 、ホスファチジン酸ホスファチジルイノシトール隣酸塩との相互作用によって、細胞膜の末梢関連プラズマ膜タンパク質を取り付けることがなど)。

これらの蛋白質の特性は、プラズマ膜結合検査生体内で、例えば、蛍光タグ付きタンパク質が主要アミノ酸のサイト指示された突然変異誘発によって変更されたとき、または影響を与える様々 な阻害剤と扱われる脂質シグナリング。周辺膜蛋白質の分布主評価されている質的に、特に場合は、蛋白質の再分布が明らかなとき。提案手法は、蛋白質の再配布、部分的にしかと定量的評価が必要な状況に最適です。膜協会は共焦点から推定したときの頻繁に使用されるアプローチ レーザー走査型顕微鏡画像のない細胞膜と細胞質の^1、2、蛍光強度の比が簡単なと正確になります。細胞膜での蛍光強度は、特定の蛍光顕微鏡法および光学素子の使用³の光回折特性による原形質膜と細胞質の信号の重ね合わせを反映しています。その結果、細胞内の信号は、膜領域にも含まれています。このため、膜信号選択⁴マスクとして FM 4-64 の染色パターンを使用できません。さらに、FM 4-64 常に体系的に最大の汚損によって定義された位置で膜信号の測定は実際膜信号の重ね合わせによる末梢関連プラズマ膜タンパク質を過大評価、膜と細胞質の化合物。末梢関連タンパク質の蛍光タグの観測信号の最大値も共同膜マーカー (すなわちFM 4-64 の styryl の染料)、最大でローカライズされていないが、細胞質にシフトします。別の制限は、FM 4-64 放出ピークは光回折³の波長依存性により GFP など緑の蛍光蛋白質のための放出のピークと比較してより広いという事実に基づく。

ここで説明したメソッド、タグ付きタンパク質の信号はそれぞれの細胞膜と細胞質シグナル仮説的分布を記述する 2 つの経験的な関数によって装着です。この信号の分解は蛍光付けられた蛋白質を表現する共焦点セクションを定期的に、2 チャンネルのソース画像で膜に垂直に細胞表面に適用される線形蛍光プロファイルに適用します。FM 4-64 染料ラベルの付いたセルです。

継ぎ手に使用される最初の関数では、セルの端に細胞質シグナルの回折について説明します。それは興味の細胞膜の末梢に関連付けられている蛋白質として同じ発色団によって付く細胞質のタンパク質マーカーを発現する細胞で測定した蛍光以前に取得したプロファイルから取得されます。プラズマ膜信号の回折を説明する 2 番目の関数は、FM 4-64 の蛍光から派生されます。この信号は、点光源の光の回折の近似モデリングに使用されているガウス関数で近似はまず。第二に、発光 FM 4-64 の有効なこのモデルは数学的に膜で興味の末梢に関連付けられている蛋白質のタグ付けに使用される色素の発光波長に関連するフォームに変換されます。両方の機能は、それぞれ最大の強度、FM 4-64 と細胞質蛋白質信号の最高値の 10% から平均が正規化されます。この信号の分解 (非線型最小正方形管継手法)、膜の比と検査された蛋白質の細胞質画分を推定できる簡単かつ正確に。膜表面濃度と細胞質の体積濃度を比較するため、分割係数の計算の実際の物理的な寸法はマイクロメータの範囲内。それは細胞膜から膜の周辺のように、同じ量のタンパク質がローカライズされて細胞質までの距離を定義します。この値は、パーティション分割を相当係数K₂導入以前⁵。メソッドは非常に簡単で、ルーチンの共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用して集録した唯一の共焦点セクションを必要として計算上要求されていません。解析コアは、ポータブルの R パッケージに実装されているし、追加の ImageJ マクロは直感的なダイアログから分析を実行するグラフィカル ユーザー インターフェイスを提供するために書かれました。ソフトウェアおよび方法の詳細な説明 (以前公開された⁶) http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/ で見つけることができます。

メソッドは単離細胞、プロトプ ラスト、組織に適した個々 の細胞の細胞膜には明確に区別できる、蛍光タグの構造を表現する末梢関連タンパク質を調べた。発色団 FM 4-64 の染色を使用する必要がありますと互換性があります。FM 4-64 発光赤;したがって、検査されたタンパク質は、青、緑、または黄色の放射 (例えばGFP、CFP、YFP) と蛍光タンパク質によるタグできます。蛋白質の分布の少ない人工より再現可能な観察を可能にするためは、生物材料の安定した変換をお勧めします。検査されたタンパク質が比較的均質な細胞質の分布を持っていることが必要です。小胞体または別の細胞内膜コンパートメントの蛋白質のローカリゼーションは、人工の結果を生成できます。

また、比較のため細胞質マーカーを表現する同じ生物学的材料を使用する必要があります。細胞は、廃止膜結合容量と無料 chomophore (周辺蛋白質、例えば、無料の GFP のタグ付けに使用されると同じ) することによって興味の蛋白質をタグに変換できます。膜結合容量廃止されることが、たとえば、膜結合ドメインのトリミングによってまたは重要なアミノ酸ボッスクカ (例えば N-ミリストイル化、アシル化、S またはプレニル化等のためのサイト) のサイト指示された突然変異誘発によって。

共焦点顕微鏡の細胞は色素 FM 4-64 のような膜マーカーによって表示しなければなりません。場合 FM 4-64 の染色 (蛍光が干渉している、貧しい染料の浸透などにより) 研究材料に適しては、原形質膜ラベル付けできますが、たとえば、適切な chomophore (タグ付き積分膜タンパク質によるmCherry、RFP、等)。マーカーでは、細胞内膜コンパートメント (膜) のごくわずかのローカリゼーションが不可欠です。

固定サンプルや抗体を操作する場合は、修正可能なアナログ FM 4-64FX または適切なターゲットに対する抗体によって分類する膜が使用できます。この場合、固定法は細胞質から細胞膜タンパク質の選択的損失につながることができますので、非常に慎重に結果を評価するために不可欠です。

1. 生物学的材料の調製

1. 興味として細胞質マーカーの蛍光タグ蛋白を発現する生物学的材料を準備します。導入に記載されている手順に従います。

2. 共焦点レーザ走査型顕微鏡

1. 準備セクション 1 fm 4-64 染料⁷素材を染色。
   1. 研究材料に適している汚損のプロトコルを適用します。タバコ細胞のジメチルスルホキシド溶液 4 64 10 ミリメートル FM の 0.2 μ L の細胞懸濁液 200 μ L を染色します。
      注: FM の典型的な染色濃度 4 64 染料ジメチルスルホキシドで 10 mM 原液を使用して 10 μ M についてです。FM 4-64 の可能な最低の濃度を使用して、適切な染色と氷 (FM 4-64 でき、低温プラズマ膜特性に影響を与える) のセルを孵化しないで。すぐに共焦点顕微鏡を用いた観測を続行します。染色と画像集録間隔は 10 分; より長くなりません。それ以外の場合、染料のエンドサイトーシス影響を及ぼします FM 4-64 の染色します。
   2. 複数サンプルを連続処理し、実験の先頭にすべてのサンプルは染色されません。
2. 1 つのセルあたり 1 つの赤道共焦点セクションをキャプチャします。
   1. FM 4-64 (2 番目のチャンネルである必要があります) とタンパク質タグ (最初のチャンネルである必要があります) として使用される発色団の順次 2 チャンネル スキャンを設定します。高い光学解像度 (10-20 px/μ m) を設定します。例のセットアップ: 63 X オイル浸漬目的、NA 1.3 画像サイズ 1,024 x 1,024 px。膜平面が取得した画像のセクション共焦点平面に垂直であることを確認します。
   2. 十分なデータを統計量評価のためのサンプルごとの少なくとも 20 セルをキャプチャ (加工物の信号の変動に依存します)。

3. 必要なソフトウェアのインストール

1. フィジー ImageJ 配布⁸と周辺の必要なマクロをインストールします。
   1. サイト https://fiji.sc/#download からソフトウェアをダウンロードし、解凍してインストールします。
   2. フィジーを解凍した「Fiji.app」ディレクトリの"ImageJ(.exe)"ファイルをダブルクリックして起動います。
   3. 「周辺」マクロを以下のサイトからダウンロードします。
      http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/Peripheral_.ijm。
   4. フィジーでは、のプラグインを選択 |マクロ |インストールする...メイン メニューの"Peripheral_.ijm"ダウンロードしたファイルへのパスを指定し、
      注: インストールされているマクロの「周辺」の 2 つの新しいツールはフィジー ツールバーに表示されます:「をプロファイル ツール」と「周辺蛋白質メニュー」です。
2. R プロジェクト ソフトウェア⁹と必要なパッケージをインストールします。
   1. R プロジェクトのインストールのサイト https://cloud.r-project.org/ の指示に従います。
      注: フィジーの全体的な分析を行います。R ソフトウェアを内部でのみ呼び出されるフィジー マクロ計算中に「周辺機器」による。
   2. R GUI を実行、パッケージを選択 |インストール パッケージ...メイン メニューに最も近いリポジトリとインストール用のパッケージ「ggplot2」を指定します。
      注: また、コマンド ラインの r を入力: install.packages("ggplot2")。
   3. 目的地から周辺 R パッケージをダウンロード: http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz。パッケージを選択してインストールする |ローカル ファイルからパッケージをインストール。
      注: また、コマンド ラインの R にのみコマンドを入力します。
      install.packages ("http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz"、レポ型 NULL を = =「ソース」)。

4 フィジーの画像解析

1. 細胞質マーカーの共焦点画像を処理します。
   1. プラグインを使用してフィジーに画像をインポート |バイオ形式 |バイオ フォーマット インポーターデフォルト設定を持つフィジー メニューから。
   2. バイオ形式のインポーターがイメージ校正を正しく認識されるかどうかチェックしてください。上部左の情報フィールドの画像ウィンドウに表示される画像寸法は元の画像の大きさでなければなりません。
   3. 治療は不適切な不適切な画像をキャリブレーション ダイアログ ウィンドウで分析に適切なパラメーターを設定することによって個別に、例えば、寸法 |スケールを設定する...[フィジー] メニューから:ピクセル単位の距離フィールドに距離を知られているフィールドに適切な長さの単位の実際の幅ピクセル単位で画像の幅を埋める)。
      メモ: ライカ LCS レイ ファイルが校正されて不適切な場合、4.2.1 のステップに従ってください。
2. 解析設定のインポート オプション マクロを実行します。3 つの方法のいずれかによって、マクロをアクティブにする:プラグインを選択 |マクロ |インポート オプション 【 f1 】フィジーのメイン メニュー、[同じ]周辺蛋白質メニューメニューのツールをクリックした後項目またはキーボードを押してショート カット F1。呼び出されたマクロ] ダイアログ ウィンドウで、パラメーターを設定します。
   1. ライカ LCS レイ形式の場合不適切な校正を解決Leica.lei 画像チェック ボックスをオンします。このオプションは正しく「雷」の拡張子を持つファイルから画像サイズをインポートします。
   2. ガウスぼかし半径 (px)フィールドに適切な値を定義します。これは、画像の平滑化とノイズの除去に影響を与えます。低値 (1 px) が十分であり、画像情報の損失は発生しません。
   3. プロファイルの線の幅 (ピクセル)] フィールドに値を設定します。厚いライン高プロファイル曲線の平滑化が発生します。既定値は 10 ピクセルをお勧めします。
   4. 「サンプル区切り記号」と「エクスポートされたアイテム」の定義によって解析画像のタイトルを設定します。
      メモ: イメージのタイトル (ファイル名拡張子、例えばなし:「実験-1_line-02_cell-11」) フィールド「区切り文字サンプル」に記載されているすべての文字の周りが分割されます (例えば:"-_") 項目のセットに (「実験」,「1」"行"、「02」、「電池」、および「11」) の要因をグループ化(サンプル、セル、行、または治療のアイデンティティ) 次の分析として使用できます。下に「項目を輸出」にそのシーケンス番号 (最初の項目「0」) を入力で使用する項目を定義するスペース区切り形式、例えば、「3 5」を使用します。この例では「02」と「11」の項目と呼ばれる"Fac_0"と"Fac_1"という名前の要素をグループ化さらに、"i"の要因としてに各測定の id が参照されます。
   5. また、サンプル区切り文字を空にしておくし、完全なイメージのタイトルが維持されている場合、エクスポートされた項目に 0 を入力します。
   6. Windows のオペレーション システムに R ソフトウェアのパス正しく自動検出になりますフィールドR.exe へのパスを確認します。そうでなければ、(例えば、"C:\Program Files\R\bin\R.exe") システムで R.exe ファイルへの完全パスを指定します。
   7. [Ok]をクリックします。次のダイアログ ウィンドウでの解析タイトルを確認し、[ ok]または戻るをリセットします。
      注: すべての画像が自動的にスムージングし、最終的に再キャリブレーションします。エクスポートしたすべてのグループ化要因のリストは、結果ウィンドウに表示されます。
3. 処理された画像で膜全域リニアガイド選定を行い、蛍光プロファイルを測定します。
   1. フィジー ツールバーから直線フィジー ツールを選択します。画像をクリックし、膜全域に線をドラッグします。ラインは細胞外スペースで開始する必要があります、膜に垂直にする必要があります。表層細胞質のより厚くより均一な層を持つ領域を選択します。線形の選択の最適な長さは 5-10 μ m です。
   2. ステップ 4.2 (ショートカット"x") のように類推的なメソッドまたはプロファイル ツールを取る[フィジー] ツールバーによって、プロファイル マクロを取るを実行します。両方のチャネルに蛍光分布自動測定が実行され、データが [結果] ウィンドウに表示されます。
   3. テキスト エディターでマクロ ソース ファイルPeripheral_.ijmを開く、行に"x"記号を置き換える場合は"x"キーを使用してユーザーに優しくないと見なされ、' マクロ「取るプロフィール [x]」{' より有利な記号 (フィジーの環境で使用されていない、アクティブなキーボード ショート カット) し、ファイルを保存します。マクロ (ステップ 3.1.4) を再インストールし、イメージのインポートから分析を開始します。
   4. 個々 の信号の変動に従って各セルのプロファイルの代表的な数値を取る。
   5. ファイルを使用してデータを保存 |名前を付けて保存。常に"csv"拡張子を使用します。適切なデータ形式のため必要です。
4. プロファイル データ マクロをプロット(ショート カットの f5 キー) の測定分布のグラフィカルな可視化を実行します。呼び出されたマクロ] ダイアログ ウィンドウで、パラメーターを設定します。
   1. チェック ボックスのままデータを入力のフィルターを使用?選択されていません。
   2. 結果表示ウィンドウ、単一の CSV ファイルまたはすべての CSV ファイルから該当するラジオ ボタンをクリックして指定したディレクトリからの最近のデータからプロットを作成するかどうかを指定します。
      注: 最近の結果からプロットを作成すると、データ保存されます最初 (名前を付けて保存] ダイアログは自動的にアクティブに)。
   3. 適切なチェック ボックスを選択することによって印刷に使用するグループ化の要因を指定します。ユニークなプロットですべてのプロファイルを表示する場合は、要因「一郎」を選択します。1 つのプロットのプロットによってべきであるすべてのデータの場合は、チェック ボックスがオフの場合を保ちます。
      注意: プロット作成時に処理された結果の原因エラーが存在しないグループ要因の選択。
   4. 出力ファイルのプレフィックス] フィールドに、プロットを保存するときにファイル名を指定し、高のプロットおよびプロット幅ファイルに印刷イメージのサイズを定義します。
      注: 結果のプロットはソース データ ディレクトリで PNG ファイルとして保存されます。
   5. 選択、 Pdf 出力?追加 PDF 出力生成される場合のチェック ボックスをオンします。
   6. [Ok]をクリックします。結果を保存するためのパスを指定または、最終的にデータの次のダイアログ ウィンドウでインポートします。分析を確認するには、実行の R コードを表示しているダイアログ ウィンドウで[ok]をクリックします。
      注: 新しいイメージ ウィンドウでプロットが開封され、R 分析出力をテキスト ウィンドウに表示されます。
5. (タグ付きタンパク質) の細胞外領域や (FM 4-64 の信号) の細胞内のスペースに、いくつかの印刷のプロファイルが過度信号プロファイル フィルター セットアップ マクロ(ショート カット F2) を実行します。呼び出されたマクロ ダイアログ ウィンドウでパラメーターを設定することに従ってください。
   注: は、指定した x 座標の最大許可された輝度しきい値に従って貧しいプロファイルの削除でフィルタ リングできます。
   1. 各チャネルのためには、過剰な細胞 (細胞内) 信号で測定を削除ファイルの適切な強度のしきい値を設定します。X 座標に低い (より大きい)フィールドで、輝度しきい値が適用される地域を指定します。
   2. 再度チェック ボックスに、プロファイル データ マクロをプロット(ステップ 4.4) を実行データを入力のフィルターを使用?選択;異常のすべてのプロファイルが正常に削除されたことを確認します。それ以外の場合、フィルターのパラメーター (ステップ 4.5.1) を向上させます。
6. 細胞膜とキャリブレーション データに基づく細胞質蛍光分布のモデルを作成する (ショート カット F3)作成モデル マクロを実行します。呼び出されたマクロ ダイアログ ウィンドウでパラメーターを設定することに従ってください。
   1. 入力データを選択するフィルター処理された (ステップ 4.5) あるべきかどうかを指定する、データを入力のフィルターを使用?チェック ボックス。
   2. 4.4.2 のステップのように類推ソース データを指定します。
   3. Μ m の間隔のモデルは、"start"、"end"の定義によって予測され、「ステップ」の値を指定します。
      注: すべてのプロファイル測定は指定された間隔よりも長くする必要があります。
   4. 適切なフィールドで使用される発色団の蛍光の波長励起と発光極大を指定します。GFP の FM 4-64 の組み合わせの既定値を設定します。
      注:"GFP"蛋白質(GFP、CFP、YFP 等)をタグ付けに使用される発色団を表し"FM4"膜 (通常 FM 4-64) を染色に使用される色素です。
   5. 出力ファイルのプレフィックスフィールドを指定します。プレフィックスは、RData ファイルをソース データ ディレクトリとして結果のモデルを保存するために使用されます。
   6. チェック ボックスをオンプロット モデル?場合はグラフィカルな出力が必要です。プロット場合保存されます PNG として、また PDF ファイルとして、 Pdf 出力?チェック ボックスをオンにします。
   7. [Ok]をクリックします。入力を指定または次のダイアログ ウィンドウでパスを出力し、実行の R コードを表示するダイアログ ボックスで[ok]をクリックして分析を確認します。
      注意: プロット、モデルの細胞質と膜末梢関連タンパク質蛍光化合物には新しい画像ウィンドウと R 分析出力をテキスト ウィンドウに表示されます。
7. 興味の蛋白質を発現する細胞の画像を処理します。
   1. 類推手順 4.1 のように画像をインポートします。
   2. 4.2 の手順と類推分析を設定します。平滑化および線幅を同一にする必要があります。
   3. 4.3 のステップのように類推プロファイルを測定します。
   4. (ステップ 4.4) をプロットして、プロファイルの精度を確認し、(手順 4.5) を必要に応じてフィルター処理を設定します。
8. 細胞膜と細胞質のタンパク質の分配の計算の計算分布マクロ(ショート カット F4) を実行します。呼び出されたマクロ ダイアログ ウィンドウでのパラメーターの設定に従います。
   1. 類推と前の手順 (手順 4.4) では、データ ソース、フィルター、およびファイル名のプレフィックスを指定します。
   2. フィジー (選択チェック ボックス最近結果)、「周辺機器」マクロ最近例の最後のモデル計算からまたはRData ファイル(場合タンパク質分布計算用のモデルが読み込まれますを指定"ファイルから"チェック ボックスを選択) します。
   3. 残留変動よりも大きい結果を削除結果のフィルタ リングが必要な場合、アクティブ化チェック ボックスをしてください。個々 のプロファイル測定の信号分解による原因不明のすることができます最大の許容残留変動のしきい値を指定します。たとえば: 0.200 の値は、プロファイルで蛍光強度の全変動の原因不明の変動が 20% 以上ですべて測定に破棄されることを示します。
   4. サンプル化要因、箱ひげ図作成 (手順 4.4) されることがありますを選択します。
   5. チェック ボックスをアクティブにするPdf 出力?箱ひげ図を PDF ファイルとして保存するためです。
   6. [Ok]をクリックして、入力を指定または出力パス、および実行の R コードを表示するダイアログ ボックスで[ok]をクリックして分析を確認します。
      注: 末梢関連タンパク質の細胞膜と細胞質の間分配のボックス プロットは新しいイメージ ウィンドウで表示され、R 分析出力をテキスト ウィンドウに表示されます。
   7. 外部処理の場合ファイル経由で [結果] ウィンドウに表示される結果を保存 |名前を付けてを保存ウィンドウのメニュー。

N-ミリストイルおよびホスファチジルイノシトール リン酸11,と静電相互作用を介して細胞膜に関連付けられている植物固有の末梢に関連付けられている膜タンパク質である DREPP10 12です。 DREPP 植物細胞内カルシウム シグナル伝達機械のコンポーネントとして記述され、骨格13,14ともやり取りします。提示実験で野生型タバコ DREPP2 における非突然変異体バージョン (Gly2 アラで代用) GFP 付けられた6とタバコによる 2 懸濁液細胞15 CaMV 35S プロモーター16の下で表されます。3 日齢 (希釈後 3 日) で測定したこれらの蛋白質の膜分配、FM 4-64-ラベル (8 μ M) のセルの文化6 (図 1 a) と (図 1 b) ホスホイノシチド 3-キナーゼの添加なし阻害剤ワートマンニン (10 μ M)17、上記プロトコルに従って。蛍光分布モデルの構築 (図 1) の細胞質マーカーとして使用されたトリミング バージョン DREPP2(Δ1-23) 結合ドメイン6膜を欠けています。

データが平方根変換を計算 (最小の負の値に対応する正の値が肯定的なデータのみを取得するすべてのデータに追加された) データを R9で双方向の分散分析により調べたと。突然変異と阻害剤の治療の効果が有意 (p < 10-16 x 2.2 * * *)。すべてのグループを比較したテューキー HSD テスト;すべてのグループは、DREPP2 ワートマンニンと非投与 DREPP2(G2A) (図 1) を除いて有意。

これらの結果は、タバコ DREPP2 タンパク質の細胞膜協会が協調性を持って機能している N-ミリストイルと静電相互作用の結果であることを明確に示します。N-ミリストイル サイト突然変異とワートマンニン治療の相互効果だけプラズマ膜から DREPP2 蛋白質の完全解離の原因。これらの結果は、以前に公開されたデータ6準拠しています。

図 1: N-ミリストイル化サイト ・末梢関連プラズマ膜タンパク質カルシウム植物細胞内シグナル伝達に関与する DREPP の膜分配ワートマンニン治療の突然変異の効果。(A) 野生型フォーム DREPP2 GFP および突然変異体を発現するタバコ細胞の内側共焦点セクションを形成する DREPP2 (Gly2Ala)-GFP (グリーン チャンネル)。セル fm 4-64 色素 (マゼンタ チャンネル) を標識した、スケール バー 10 μ m。 同じセル行 (B) は 10 μ m を施したワートマンニン (WM)。(C) 細胞細胞質マーカー DREPP2(Δ1-23) を表現します。(D) すべてのサンプルの推定膜分割します。両方の効果の意義が二元によってテストされた (p < 10-16 x 2.2 * * * 両方の場合元のデータは平方根変換された)。文字は、テューキー HSD テストにより決定される、互いと大幅に異なるではないグループを示します。箱ひげ図のひげは、95% 信頼区間を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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