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方法論記事

その場でパラフィン埋め込まれた大人サンゴの標本の交配の技術

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DOI:

10.3791/57853

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2018年8月31日

1Department of Marine Biology and Ecology, University of Miami, Rosenstiel School of Marine and Atmospheric Sciences

この記事について

サマリー

このプロトコルの目標はパラフィンに埋め込まれているされていると、スライド ガラス上に断面採取したサンゴ大人上の in situハイブリダイゼーションを行うことです。これはパラフィン包埋組織の RNA アンチセンス プローブの空間表現を視覚化するために使用する質的研究法です。

要約

サンゴは海の全体的な健康だけでなく、人間の健康に欠かせない重要な海洋無脊椎動物です。海水の温度上昇や海洋酸性化など人間活動の影響、ためサンゴが、ますます脅威にさらされています。これらの課題に取り組む、細胞および分子生物学の進歩は、サンゴの健康を診断するために重要であると証明しています。人間の薬でよく使用される技術のいくつかを変更すると、サンゴを付けて治療する研究者の能力が大幅に向上。これに対処するため人間の医学と進化発生生物学で主に使用されるその場で交配のためのプロトコルは、ストレスの下で大人のサンゴで使用に適応されています。

このメソッドの目的は、パラフィンに埋め込まれているされており、スライド ガラス上に断面を有する成人のサンゴ組織における RNA プローブの空間表現を視覚化することです。このメソッドは、サンプルの退避とパラフィンの除去、サンプル、前ハイブリダイゼーション インキュベーション、RNA プローブの可視化と RNA のプローブの交配の透過性を確保するためのサンプルの前処理について説明します。これは、場所特定の遺伝子の表現し、プロトコルは他の非モデル生物のために容易に適応することができますを発見する非モデル生物を用いた強力な方法です。ただし、メソッドは限られた表現強度可視化ステップとプローブの濃度の間に使用されている時間の量によって異なるため、それが主に質的です。さらに、忍耐が必要、このプロトコルは、最大 5 日 (および多くの場合より長い) によって使用されているプローブを取ることができます。最後に、非特異染色が一般的でが、この制限を克服することができます。

概要

サンゴが重要な生態系のビルダーと海洋と人間の健康1,2,3における生物多様性のために重要です。彼らの気候変動とその他の人為的ストレスの脅威の下で、多くのサンゴ種が絶滅危惧と見なされます。したがって、ストレス下でのサンゴを診断する細胞・分子ツールの重要な必要性があります。また、そこは少しについて理解される大人のサンゴの組織とほとんど理解したがってこれらの遺伝子の機能の内にある遺伝子。この問題を解決するには、我々 はその場で交配 (っぽい)、一般的に使用するプロトコル人間の医学と進化発生生物学、大人のサンゴのパラフィン埋め込まれた組織サンプルでの使用のために適応しています。この手法は、最も強力な熱ストレスへの暴露などのストレスの多いイベントを受けている大人のサンゴで使用した場合です。ただし、この手法は組織やサンゴのライフ ステージの広い範囲で使用することができ、だけ熱重点を置かれたサンゴ4,6,7に制限されていません。また、cDNA シーケンス情報がある限り、この方法を組織または任意の後生動物の細胞に使用できます。

このメソッドの目的と保存にし、パラフィンに埋め込まれたスライド上に断面大人のサンゴの組織内 RNA プローブを視覚化することです。このメソッドは、大人のサンゴの組織内にある核酸を可視化できる強力な診断ツールです。最初このメソッドは、医療診断のため開発された、発生生物学、進化発生生物学8,9,10等の分野で人気のツールとなっています。ISH はまた非モデル システム、ゲノムで特に重要なメソッドとトランスクリプトーム シーケンス データがありますが、空間の遺伝子発現パターンが知られています。それは興味の遺伝子を表現する細胞や組織と詳細ターゲットを絞った治療アプローチ8,9,10につながることができますを示すことができるための非モデル系診断仕事のためこの手法は強力です 11,12。最後に、この手法は定性的および定量的遺伝子発現データ11と組み合わせればより強力です。

ジゴキシゲニン (DIG) を設計しているすでに研究者の関心のこのペーパーで説明するアプローチになります-標識 RNA プローブ (センスとアンチセンス プローブ) とは今その場でサンプルをプローブの交配を実行する準備ができています。このメソッドを実行するには、対象の各プローブ パラフィンティッシュ サンゴの 2 つの連続切片を必要となります。1 つのセクションは、意味プローブとアンチセンス プローブ使用されます。センス プローブは、非特異的結合を示すコントロールになります。染色センス プローブで観察される場合、は、アンチセンス プローブは興味の RNA に固有ではありません。プローブは、任意の遺伝子の表現を設計できます。このプロトコルでは熱ストレス下のサンゴの中に表現される検出された以前のいくつかの例が使用される: FBJ マウス骨肉腫ウイルス遺伝子相同物 B (Fos B)、活性化タンパク質 (AP1) と腫瘍壊死因子受容体 41 (TNFR 41)11。DIG 標識 RNA プローブを用いた ISH は取り扱いが多くのより安全な10 のため放射性プローブの使用より優先されます。さらに、この手法は、機密性が高いと組織と熱ストレス アダルト サンゴ13,14,15,16を超えて胚の広い範囲で実行することができます。

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プロトコル

1. パラフィンの除去

注意: は、ヒューム フードの下で次の手順を実行します。

  1. 100% キシレン 10 分ガラス Coplin jar のボンネットの下に薄切切パラフィン埋め込まれたスライドを dewax します。キシレン溶けるプラスチック プラスチックの Coplin jar ファイルは使用しないでください。Coplin jar ファイルは使用する前にオートクレーブで滅菌します。
  2. 次のように 4 つの滅菌ガラス Coplin jar を準備: エタノール 60%、70% エタノール 80% エタノール 100% エタノール。RNase フリー水とエタノールで希釈します。
    1. 100% エタノールで滅菌ガラス Coplin jar ファイルにスライドをコピーして 10 分間浸します。10 分後ガラス Coplin jar を空にして新しい 100% エタノールに置換します。10 分のために再度スライドを浸します。
    2. 1 分 80% エタノールで滅菌ガラス Coplin jar ファイルにスライドをコピーします。
    3. 1 分の 70% エタノールで滅菌ガラス Coplin jar ファイルにスライドをコピーします。
    4. 1 分 60% エタノールで滅菌ガラス Coplin jar ファイルにスライドをコピーします。

2. RNA プローブの交配の準備のためのスライドの前処理

  1. 指定がなければ、常温で次の洗浄を実行します。低速で軌道シェーカーで常温洗浄を実行します。最大 5 つのスライドのための部屋とスライドの洗浄用滅菌スライド メーラーを使用します。
  2. スライドをリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 の 18 ml 滅菌スライド メーラーに転送します。室温で 5 分間洗浄します。
  3. 1 × PBS を注ぐし、すぐにプロティナーゼ K 組織の浸透をプローブを有効にするとスライド上組織を扱います。プロテイナーゼ K 溶液約 18 mL を加えるスライド メーラー (溶液濃度を操作するためのテーブル 1を参照)。37 ° c 15 分間インキュベートします。手ふれしません。
    1. スライドをインキュベートすると、prehybridization (Prehybe バッファー) を準備します。10 分間、沸騰水浴中 Prehybe バッファーを配置し、5 分の氷浴で冷却します。Prehybe バッファーのレシピ、表 1を参照してください。
    2. プロティナーゼ K ソリューションを注ぐことによってプロティナーゼ K 反応の消化を停止し、すぐにスライド メーラーに 0.2% グリシン PBS 溶液 18 mL を追加します。室温で 5 分間座ってスライド メーラーをしましょう。
    3. 0.2% グリシン PBS 溶液を注ぐ、2 x 生理食塩水クエン酸ナトリウム (SSC) 液 18 mL を各スライドのメーラーに追加します。2 スライドを洗う 100 150 rpm で振とうしながら室温で 10 分間 x SSC。

3. RNA プローブの交配の準備でスライドの prehybridization

  1. 2 スライドを水洗い、x SSC、新しい滅菌スライド メーラーを取得、約 18 mL の Prehybe バッファーを入れてスライド メーラー。交配温ハイブリダイゼーション オーブンにスライド メーラーを配置します。
    注: 通常 50-60 ° c. の範囲が使用されているプローブの交配温度が異なります
  2. 2 × SSC と場所を注ぐ 2 x SSC 洗浄が完了すると、1 h のハイブリダイゼーション オーブンで Prehybe バッファー内スライド メーラー内のスライド。

4. RNA プローブの交配

  1. スライドは、ハイブリダイゼーション オーブンで Prehybe バッファーとインキュベートは、交配のプローブ ソリューションを準備します。
    1. 各プローブの交配バッファー (0.5 μ L プローブの交配バッファーの 24.5 μ L) で希釈します。
      注: 交配バッファーのためのレシピは、表 1にあります。トレーラー ・ ノウルズらのプローブの準備と濃度の例を見つけることができます。11。
    2. 12 分、86-90 ° C 熱ブロックに希薄化後のプローブを配置し、氷の上の 1 分のクールな。
  2. ハイブリダイゼーション オーブンからスライド メーラーを削除し、個別に滅菌ピンセットを使用してスライドのメーラーからスライドを削除します。ペーパー タオルの上に平らのスライドを置き、慎重に組織サンプルの周囲に余分な Prehybe バッファーを拭き取る。サンプルに触れないように気をつけて、ティッシュ サンプルの乾燥を防ぐためにすぐに仕事。
  3. PAP ペンで組織を取り囲みます。ピペット希釈プローブ溶液の 25 μ L を適用し、プラスチック coverslip のサンプルをカバーします。
    1. 4 x SSC + チャンバーの底に 50% ホルムアミド ソリューションとスライドの水分室にサンプルを配置します。
    2. プローブは、すべてのスライドに追加されている、一度交配温度 50-60 ° C で 24 時間少なくともハイブリダイゼーション オーブンにスライドの水分室を配置します。インキュベーション時間プローブの濃度によって異なりますが、24 時間以上にする必要があります。
  4. 希薄化後のプローブで一晩インキュベートした後に、ハイブリダイゼーション オーブンからスライドの水分室を削除します。
    1. それぞれの組織がずれないように注意しながら、スライドから coverslips を削除します。1000 μ L ピペットで 2 x SSC ソリューションの 1000 μ L を追加し、スライドを優しく洗い流してください。
    2. 2 x SSC 溶液室温で 5 分間の 18 ml 滅菌スライド メーラーにスライドを配置します。ソリューションを注ぐし、新鮮な 2 の 18 mL 交換 x SSC。穏やかな揺れで部屋の温度で 5 分間インキュベーションを繰り返します。
    3. 2 x SSC ソリューションを注ぐ。室温で 18 mL 1 x SSC ソリューションと 5 分間洗浄を追加します。1 の x SSC ソリューションを注ぐし、新鮮な 1 の 18 mL 交換 x SSC。穏やかな揺れで部屋の温度で 5 分間インキュベーションを繰り返します。
    4. 1 を注ぐ x SSC。振ることがなく 42 ° C で 18 mL 0.5 x SSC と 10 分の洗浄を追加します。SSC と置換 x 0.5 を注ぐそれ新鮮な 0.5 ml の 18 x SSC。振ることがなく 42 ° C で 10 分間のために再度洗ってください。

5. RNA プローブの可視化

注: プローブを視覚化、BM 紫は開発プロセス中に使用されます。ただし、この手順の前に、いくつかの洗浄は汚損のためにサンプルを準備する必要。

  1. 1 分 MgCl2 MgCl2、ap 通信バッファーを注ぐし、1 x ベーリンガーインゲルハイム マンハイムでマレイン酸バッファーで希釈バッファーの妨害の 18 mL を追加せず、18 ml のバッファー アルカリフォスファターゼ (ap 通信バッファー) のスライドを洗ってください。穏やかな揺れでスライド メーラーに室温で少なくとも 1 時間インキュベートします。
    注: ベーリンガーインゲルハイム マンハイム ブロック バッファーとマレイン酸バッファー使用された既成し、掘る洗浄やブロック バッファー設定で購入 (利用可能な商業的)。
    1. また、4 ° C で一晩培養が行えます。もはやブロック期間は非特異的結合の外観を軽減します。
  2. 20 ml 希釈掘るアンチ ジゴキシゲニン AP Fab 断片の (抗 DIG 抗体 = 抗 DIG 抗体 + 20 mL 1 ベーリンガーインゲルハイム マンハイム ブロック バッファー x 2 μ L)。これは、1 プラスチック製のスライド メーラーでの使用に十分です。このソリューションの詳細は、1 つ以上のスライド メーラーを使用する場合に準備されなければなりません。
  3. 新しい滅菌スライド メーラーに抗 DIG 抗体を追加し、スライドを抗 DIG 抗体溶液をスライド メーラーに転送します。穏やかな揺れで 3 時間室温で孵化させなさい。
  4. インキュベーション後、抗 DIG 抗体を注ぐし、穏やかな揺れで 5 分 MgCl2 AP バッファーの 18 ml スライド メーラーでスライドを洗います。
  5. MgCl2、 ap 通信バッファーを注ぐ、18 mL の AP バッファーを追加します。穏やかな揺れで 5 分間洗浄します。5 分インキュベーション後 AP バッファーを離れて注ぎ、18 ml の新鮮な AP バッファーの交換および穏やかな揺れで 5 分間洗浄します。
  6. 暗闇の中、ap 通信バッファーを注ぐし、スライド メーラーに BM purple の 18 mL を追加します。暗闇の中で室温でスライドを孵化させなさい、開発されているプローブに基づく可視化すべて ½ h. 反応時間が異なります紫発色のチェックします。
    注: BM 紫可視化ではなく開発ソリューション可能 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) とニトロ ブルー テトラゾリウム (NBT) を使用します。手順については表 1を参照してください。
  7. スライドを 18 ml の暗闇の中、室温で 5 分間トリス EDTA (TE) バッファーの新しい滅菌スライド メーラーに転送することによって発色を停止します。
  8. TE バッファーを離れて注ぎ、スライド メーラーと暗闇の中、1 分間洗浄する 18 mL の RNase フリーの水を追加します。
  9. 水からスライドを削除して、組織の境界に乾燥させる.グリセロール媒体をマウントを追加し、coverslips を置きます。写真は撮影する準備ができているまで、4 ° C でスライドを保存します。

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結果

このプロトコルを完了すると、細胞や関心の RNA プローブを表現している組織の同定が得られます。このプロトコルの代表的な結果は、AP-1、FosB、および TNFR41 です。これらの結果は、以前トレーラー ノウルズら刊11RNA のショー空間表現は、熱ストレスにさらされた大人のサンゴにプローブします。染色の種類の 2 つの例は図 1に示した。図 1 aは、びまん性組織染色の例です。汚れが特定のセルでだけでなく、組織全体であります。ここでは、対策をした意味 AP 1 の式は表皮と口腔 gastrodermis11 (図 1 a) で発見されます。染色には、ディフューズ ライト、および 1 つの特定のセル型に分離ですが。このタイプの染色では、結果のいくつかは、非特定の染色のためかもしれ...

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ディスカッション

このプロトコルで説明する方法は、医学と進化的発達研究8,9,10,12,17で前作から変更されています。このプロトコルは、保持されているし、パラフィンに埋め込まれた大人のサンゴに DIG 標識 RNA アンチセンス プローブの in situハイブリダイゼーションのニュアンスに焦点を当てください。このメソッドは、パラフィン包埋もサンゴを超えて生物のサンプルを簡単に転送できます。最後に、このメソッドを実行できる日中のサンゴ (例えば幼虫) または細胞培養内の異なるライフ ステージがサンプルのこれらのタイプは、必ずしもパラフィン埋め込まれた5,6ではないために、正確な...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品賞によって資金が供給されたないです。バローズ Wellcome 基金ポスドク濃縮プログラムから国立科学財団海洋科学員と賞の no.1012629 を介して OCE 1323652。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
デンハルトの溶液Affymetrix70468 50 ML
Bioworld アルカリホスファターゼ緩衝液Fisher50-198-724
スライドメーラーFisher12-587-17B
Bioworld アルカリホスファターゼ緩衝液Fisher50-198-724
50 mL Falcon tubesFisher14-959-49A
UltraPure Salmon Sperm DNA solutionInvitrogen15632-011
PBS - リン酸緩衝生理食塩水 (10X) pH 7.4InvitrogenAM9625
UltraPure DNase/RNase-Free 蒸留水、10 x 500 mLInvitrogen10977-023
UltraPure Salmon
Sperm DNA solutionInvitrogen15632-011
スライド ホワイト アペックス 優れた接着剤ライカ バイオシステムズ3800080
PBS 溶液、pH 7.4ライフ テクノロジー10010072
プロテイナーゼ K、分子グレード、2 mLニューイングランド バイオラボP8107S
スーパー パップ ペン リキッド ブロッカープロメガ22309
DIG 抗ジゴキシゲニン-APFab fragmentsRoche11093274910
BM Purple, 100 mLRoche11442074001
DIG Wash and Block Buffer SetRoche11585762001
NBT/BCIPRoche11681451001
Formaldehyde solution, 500 mL sizeSigma-Aldrich252549-500ML
SSC Buffer 20X concentrationSigma-AldrichS6639-1L
無水酢酸Σ-Aldrich320102-100ML
ホルムアミドΣΣ-Aldrich47670-250ML-F
トリエタノールアミンΣ-Aldrich90279-100ML
豚腸粘膜からのヘパリンナトリウム塩ΣΣ-AldrichH3149-10KU
キシレン、AR (ACS)、組織学的使用VWRMK866806
エタノールVWREM-EX0276-4S
TEバッファーVWRPAV6232
ハイブリダイゼーションオーブンVWR97005-252、97005-254
ビタルシェーカーVWR89032-088
ズ オー

参考文献

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