データベース ガイド-フローサイトメトリー評価骨髄骨髄細胞の成熟のため

Summary

MDS の診断は非有益な細胞遺伝学または形態学的条件の不在で難しいです。MFC では、MDS の診断プロセスを改良を助けることができます。臨床練習のために便利になる、MFC 分析が十分な特異性と感度、パラメーターに基づく必要があります、データは異なる事業者間再現する必要があります。

Abstract

フランス語フローサイトメトリー協会 (AFC) 内を開始したワーキング グループは、フランスの骨髄疾患診断のため多項目フローサイトメトリー (MFC) のアプリケーションを調和させるために開発されました。ここで提示されたプロトコルが合意し、2013 年 9 月と 2015 年 11 月の間応用 6 フランス診断所 (サンテティエンヌ、グルノーブル、クレルモン ・ フェラン、ニース、リール、Institut パオリ-Calmettes での大学病院でマルセイユ)、骨髄サンプル準備およびデータ集録の標準化を許可します。3 つの成熟データベースは、好中球、単球と「健康」ドナー個人 (造血疾患の証拠なしの個人) から骨髄で赤芽球系に開発されました。各骨髄系の頑健な解析は日常的診断に該当する必要があります。新しいケースは同じ方法で解析でき、通常のデータベースと比較します。したがって、量的・質的形質異常を識別でき、2SD 通常骨髄のサンプルのデータと比較して上記の病理を示す考慮すべき。主な制限は、ハイブリドーマ技術に基づいて、現在臨床診断に使用方法で得られたモノクローナル抗体を使用して達成データ間の高い変動です。取得したデータの技術的な検証に関する条件を設定 MDS の診断のための MFC のユーティリティを向上させるを助けるかもしれない。これらの基準の確立には、データベースに対して分析が必要です。データ分析で調査官の主観の削減は、この方法の重要な利点です。

Introduction

近年成熟経路 (の発現の変化の評価に基づく MDS の開始そして進行の間に骨髄系細胞で発生する異形成の変更を特定の表現型マーカーがない場合は、新しいアプローチを提案されています。成熟した骨髄系細胞の生産の間に骨髄性抗原) や骨髄 (BM) 内の別のセル型の異常分布の細胞コンパートメント^1,2。

骨髄異形成症候群 (MDS) やその他の骨髄性血液疾患に関連する BM 骨髄球系細胞コンパートメントの異形成の変化を検出するために MFC の標準化されたアプリケーションのための新しい手法を提案します。本研究では、MFC データ解析のための成熟のデータベースを使用するユーティリティも示しています。

サンプルの準備の手順、データ集録、およびデータベースを用いた解析の標準化 BM 骨髄細胞の異形成の変化に関連する最も関連性の高い表現型異常の同定できるようになります。したがって、適切な標識が、よく知られている形式 (自動人口区切り記号 (APS) 図、ヒストグラム、およびドット プロット) に基づく統計的に選択したサブセットがその後の分析で使用できる解析戦略を開発するため必要丸めます。MDS の堅牢な表現型異常の発見とせず最小限の形態学的異形成や細胞遺伝学的 aberrancies なしの場合診断も和らぐ。肺浸潤パネルの....

Protocol

下記プロトコルは、「Comité デ保護デ Personnes」(独立倫理委員会) によって承認されている大学病院のサンテティエンヌ フランスのシュド ・ エスト 1。

1. Cytometer 設定

注: cytometer 設定はフランス流の推奨事項、EuroFlow に従って"EuroFlow 標準オペレーティング (SOP) のプロトコル設定や補償 (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php) に従って行われました。

1. 毎月の機器設定
   1. Cytometer を入れます。すべての流体レベルを適切かつオープン歌姫 6.1.3 ことを確認します。流体工学のスタートアップを実行: メニュー バーでを選択 ' の Cytometer |流体工学スタートアップ '。[OK]が表示されたらクリックします。少なくとも 30 分間のウォーム アップに cytometer を許可します。
   2. パフォーマンス チェック - CST ビーズ
      注: この手順で、12 75 mm ポリスチレン管、CST ビーズとシース液 (材料の表を参照) を準備します。
      1. 12 × 75 mm²ポリスチレン管....

Results

K-EDTA 血液凝固阻止剤で収穫された 54 の BM サンプルは研究に含まれていた。MFC データは、患者についての情報のない状態で分析されました。BM のサンプルを (男性 5 と 47.4 [35-48] の年齢の中央値と 2 人の女性、(8 男女 57.9 [35-72] の年齢の中央値で 3 名) 造血疾患の証拠と 11 個人や様々 な 36 例 7 の健康なドナーから示した回顧的研究 病理学の条件: 1 ケース貧血と貧血と高クレアチニン レベル、8 の炎症、貧血症例 3 例、低クレアチニン レベル 1 貧血症例によるビタミン B₁₂欠乏症、貧血 ± 4 症例によって引き起こされる他の血球減少によって肝臓の損傷、3 症例の自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病 5 例、マクロファージ活性化症候群の 1 例、リンパ腫完全寛解 (微少残存病変 < 0.01%) で 3 例, 7 例血液疾患 (4 MDS、1 急性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病の 1 と 1 骨髄増殖性症候群 JAK2 正) を運ぶ。18 男女各 18 名平均.......

Discussion

BM 吸引の質が最終的な結果に影響を与えます。BM 吸引の希釈は、前駆細胞の不在のための成熟のさまざまな段階で細胞や前駆体細胞の分布をゆがめる可能性があります。おそらく大量に溶解法を用いた流れのフローサイトメトリーによる解析で希釈の BM 吸引の正規化で助けるかもしれない。また、フローサイトメトリーによる BM 骨髄異形成の評価のための重要なステップはサンプル処理や染色、データ集録、および解釈^2,3。BM 収穫後最大 72 h 処理と染色サンプルを実行必要があります。データは、染色後すぐに、好ましくは、取得する必要があります。 または、4 ° c で 1 h 以上まで流れの cytometer で測定のための光から保護されたサンプルを格納します。データベース ガイド通訳は、BM の骨髄細胞の成熟の主観評価を回避できます。

抗体の組み合わせおよびサンプル準備はあった EuroFlow 手順^9,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD FACSCanto II フローサイトメーター	BD Biosciences, CA, USA	SN:	3-laser, 4-2-2 configuration, フィルターとミラー 詳細: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf
Awel C48-R 遠心分離機	AWEL Industries, FR	SN: 910120016;モデル番号:320002001	低速遠心分離機、容量60 FACSチューブピ
ペット10µLおよび200µL
パスツールピペット
15 mL ファルコンチューブ
ポリプロピレンチューブ FACS
マウス用 抗ヒト HLA-DR	BD Biosciences, CA, USA	655874	クローン L243 マウス BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm)
マウス Anti-Human CD45	BD Biosciences, CA, USA	560777 clone	HI30 Mouse IgG1, κ Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm)
マウス Anti-Human CD16	BD Biosciences, CA, USA	656146	クローン CLB/fcGran1 マウス BALB/c IgG2a, κ 蛍光色素 FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
マウス 抗ヒト CD13	BD Biosciences, CA, USA	347406 clone	L138 Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ 蛍光色素 PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
マウス アンチヒト CD34	BD Biosciences, CA, USA	347222	clone 8G12 Mouse BALB/c IgG1, κ 蛍光色素 PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm)
マウス 抗ヒト CD117	BD Biosciences, CA, USA	339217	クローン 104D2 マウス BALB/c IgG1 蛍光色素 PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm)
マウス 抗ヒト CD11b	BD Biosciences, CA, USA	333143	クローン D12 Mouse BALB/c IgG2a, κ D12, Fluorochrome APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm
Mouse Anti-Human CD10	BD Biosciences, CA, USA	646783	HI10A Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
マウス Anti-Human CD35	BD Biosciences, CA, USA	555452	E11 Mouse IgG1, κ 蛍光色素 FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
マウス 抗ヒト CD64	BD Biosciences, CA, USA	644385	clone 10.1 Mouse BALB/c IgG1, κ 蛍光色素 PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
マウス 抗ヒト CD300e	Immunostep	IREM2A-T100	クローン UP-H2 マウス BALB/c IgG1, k 蛍光色素 APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
マウス 抗ヒト CD14	BD Biosciences, CA, USA	641394	clone MoP9 Mouse BALB/c IgG2b, κ 蛍光色素 APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
マウス 抗ヒト CD36	BD Biosciences, CA, USA	656151	CLB-IVC7 Mouse IgG1, κ 蛍光色素 FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
マウス 抗ヒト CD105	BD Biosciences, CA, USA	560839	clone 266 Mouse BALB/c IgG1, κ 蛍光色素 PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
マウス 抗ヒト CD33		345800	クローン P67.6 マウス BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
マウス Anti-Human CD71	BD Biosciences, CA, USA	655408	clone M-A712 Mouse BALB/c IgG2a, κ 蛍光色素 APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Lysing Solution 10x Concentrate (IVD)	BD Biosciences, CA, USA	349202
FACSFlow Sheath Fluid	BD Biosciences, CA, USA	342003
FACSDiva CS&T IVD ビーズ	BD Biosciences, CA, USA	656046
RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS	Cytognos, Salamanca, Spain	SPH-RCP-30-5A	lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01
Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD)	BD Biosciences, CA, USA	ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291
Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3	BD Biosciences, CA, USA
リン酸緩衝生理食塩水錠剤	R&D Systems, Minneapolis, USA	5564
ウシ血清アルブミン (BSA)	Sigma-Aldrich, France	A9647
Sodium Azide 99%	Sigma-Aldrich, France	199931
Infinicyt software version 1.8.0.e	Cytognos, Salamanca, Spain