方法論記事

膜蛋白質の構造解析および経験的モデリング中性子小角散乱実験でコントラストに一致する洗剤

DOI：

10.3791/57901

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2018年10月21日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Neutron Scattering Division, Oak Ridge National Laboratory, 2School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology

この記事について

サマリー

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このプロトコルは、低解像度第一原理計算モデルと洗剤のコントラストが一致する中性子小角散乱法を用いたソリューションの洗剤可溶化膜蛋白質の構造の詳細を取得する方法を示します。

要約

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高流束同位体リアクターのオークリッジ国立研究所で生物学的中性子小角散乱装置、生体材料ナノからをカバー、バイオ燃料の処理、生物学的材料の調査に捧げられてマイクロメータ スケール。膜タンパク質の物性 (すなわちサイズと形状) を調査するためにここで提示されたメソッド (ここで MmIAP、 Methanoculleus marisnigriから膜アスパルチル プロテアーゼ) ミセル形成のソリューションで洗剤とりわけこの中性子小角散乱装置に適しています。他の生物物理学的解析技術がタンパク質洗剤複雑な構造で洗剤の貢献に対処する彼らの無力によって妨げられます。さらに、バイオ重水素化研究室へのアクセスは、大規模な耕作を準備し、タンパク質強化による散乱信号の重水素標識蛋白質を表現するためのユニークな機能を提供します。この技術は、高分解能で構造の詳細を提供しない、膜蛋白質の構造の知識のギャップには近く原子分解能を必要とせず研究の多くのアドレス指定可能な分野が含まれています。たとえば、これらの区域は、摂動、および折りたたみ/展開イベント オリゴマー状態、複雑な形成、構造変化の測定を含みます。これらの調査は、このメソッドのアプリケーションを容易に実現できます。

概要

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膜タンパク質は、すべての遺伝子1の推定 30% がエンコードされ、現代の医薬品のターゲットの大多数を表します。2これらの蛋白質は、彼らの豊かさと重要性にもかかわらず重要な細胞機能を3の広い配列を行うなど、研究利用に供構造バイオインフォマティクス (RCSB) 蛋白質のための総構造の約 1% にすぎませんデータ ・ バンク。4彼らの部分的に疎水性性質のため膜結合蛋白質の構造決定が極めて挑戦でされています。5,6,7

生物物理技法の多くは、測定溶液中における同一径粒子を必要と、ネイティブ膜から膜タンパク質を分離し、生体膜の可溶性模倣これらのタンパク質の安定化は最近の研究の活発な領域をされています。数十年。8,9,これらの調査は、nanodiscs11,12,13膜,14,15 等の膜タンパク質の可溶化多くの新規両親媒性アセンブリの開発につながっている10と amphipols。16,17ただし、洗剤のミセルの使用特定の蛋白質の容解性の要件を満たすための最も一般的で簡単な方法の 1 つは。18,19,20,21,22,23,24,25残念ながら、単一の洗剤や洗剤の魔法混合現在存在満たすすべての膜蛋白質。したがって、これらの条件は経験的蛋白質ごとの固有の要件にスクリーニングする必要があります。26,27

洗剤は、ミセルと呼ばれる集合構造を形成するソリューション、臨界ミセル濃度以上で自己組み立てます。ミセルは、疎水性のアルキル鎖ミセル コアおよび水溶媒に直面してミセル シェル層に配置される親水性のヘッド グループを形成 (通常は 20 から 200 まで) 多くの洗剤モノマーの構成されます。洗剤のミセル形成挙動は古典的な疎水性効果、28およびサイズでチャールズ タンフォードによって記述され、膜タンパク質研究で一般的に使用される洗剤のミセルの形状をしています。小角散乱法を用いた特徴付けられます。29,30洗剤組織膜タンパク質についても研究されていると、きちんと洗剤のような配置でタンパク質を取り巻く洗剤の分子蛋白質界面活性剤複合体 (Pdc) の形成を期待ミセル。31

1 つは、洗剤を使用する利点は他の洗剤を組み込むことによって生じるミセル プロパティを操作できることを追加しました。多くの洗剤を示す理想的な混合と混合ミセルの選択プロパティはコンポーネントとの混合比率からも予想されます。22ただし、洗剤の存在できますまだ課題が生物物理特性の信号全体に貢献することであります。たとえば、x 線と光散乱技術、PDC の洗剤からの信号はタンパク質と実質的に区別できます。32単一粒子の低温電子顕微鏡 (Cryoem) 調査は通常トラップ (冷凍) 粒子に依存してください。蛋白質の構造の詳細は、特定の洗剤や洗剤を背景に追加する高濃度によってまだ隠されています。33 (洗剤を含む) 完全な PDC 構造の解釈への別のアプローチは、指定された膜タンパク質の周り洗剤を再構築しようとする計算方法で行われています。34

中性子散乱の場合は、洗剤のミセルでコア-シェル アレンジ観測散乱に寄与するフォーム ファクターが生成されます。幸いなことに、彼らは net の観測された散乱に寄与しないことなどは、ソリューション コンポーネントを変更できます。この「コントラスト マッチング」のプロセスと一致する (バッファー) の背景の散乱長密度を達成するために水素の重水素を置き換えることによって達成されます。(利用できる重水素化対応) と洗剤の賢明な選択と混合の比率を考慮しなければなりません。洗剤のミセル、洗剤を用いた重水素置換アルキル鎖 (d-尾 h 尾ではなく) を持っているが、同じヘッド グループこの置換を実行できます。洗剤は十分に混合されたので、35の集計でお越しの加重モル分率は、散乱長密度 (h 尾と尾 d) の 2 つのコンポーネントの平均。この平均コントラストが頭のグループの一貫性のある、均一の凝集構造と観測された散乱へのすべてを削除する完全に照合できます。

重水素標識アルキル鎖と化学的に同一の洗剤の分子を組み込むことによって洗剤のミセルの中性子コントラストを操作するためのプロトコルをご紹介します。19,36,37ミセル コアとシェルは、中性子散乱のユニークな機能は、一致する完全な対比ができます。35,38により大幅に洗練されたこの詳細レベルには、コントラストのマッチングを実現できます膜蛋白質の構造のそれ以外の場合不可能研究。さらに、このコントラスト マッチング方法は高分子交換反応39と油水分散剤、40または膜、41なども他の可溶化剤などの洗剤を含む他のシステムに拡張することnanodiscs、42またはブロック共重合体。この原稿が、アルキル鎖および/または頭の部分重水素置換の単一洗剤種を用いたアウトラインとして43 A 同様のアプローチは最近出版されました。置換および 2 段階用の洗剤の利用できる位置の限られた数、ここで紹介した方法と比較して37これが水素と重水素洗剤中のランダムな分布の改善に期待できます。合成洗剤は、ポーズの追加の課題を検討に必要な。

多くの場合下記のプロトコルの手順 1 と 2 が重なる品質提案を提出する最初の実験計画を行う必要がありますので。ただし、提案書の提出であるここでは中性子実験の前にこのプロセスを開始することを強調する最初のステップとして。また、提案によって示される必要があります、前提条件の手順が生化学的および物理的な特性 (安定性、純度など) 中性子研究の必要性をサポートするサンプルを持つことをする必要があります。小角中性子散乱 (SAN) の一般的な議論はこの記事の範囲を超えています。簡単なしかし徹底的な導入はカウフマン、44と包括的な教科書に焦点を当てた生物小角ソリューション散乱による材料特性評価を公開されている最近の参照作業で利用可能です。45さらにおすすめの読書は、ディスカッション セクションで与えられます。小角散乱は、散乱過程を説明する中央の量として、いわゆる散乱ベクトル Q を使用します。この資料を使用して、広く受け入れられている定義 Q = 4 π 罪 (θ)/θ が受信および散乱ビームと λ の半分の角度、λ は、オングストロームの中性子放射の波長。使用別のなどの記号、その他の定義が存在する ' の散乱ベクトルは要因 2 π かナノメートル オングストロームの代わりを使用して異なる場合があります (図 10の議論を参照してください)。

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プロトコル

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1. 準備し、中性子施設はり時間と計測器の提案を提出

  1. 一般的なユーザー中性子ビームの時間アクセス、オークリッジ国立研究所 (ORNL) などを提供する中性子散乱施設を特定するためのオンライン リソースを参照してください。中性子設備、中性子研究世界についての情報の地図はオンラインできません。46これらの施設が通常提案; 通常の呼び出しであることを注意これは次回のビームが利用できる時を決定します。中性子は、さまざまなアプリケーションに使用されます。中性子小角散乱 (SAN) 楽器、特に、生物学的サンプルの機能を検索します。
  2. 中性子ビームの時間提案提出プロセスをナビゲートするために中性子設備によって提供されるリソースを使用します。あなたが適用されます楽器に関連付けられている中性子散乱科学者 (NSS) とを参照してください。中性子施設の公募、期限、および送信のための助言に関する現在の情報を確認します。オークリッジこれは利用可能なオンラインです。47は、送信が成功したのすべてのガイドラインに従うビーム時間の提案を提出します。
  3. 重水素化蛋白質が必要 (2.2 を参照) の場合、中性子散乱施設多い所と重水素化材料の生産に特化の専門知識によってサポートされます。オークリッジ国立研究所でバイオ重水素化ラボ (BDL) へのアクセスを要求するには、提案システムで 2 番目の楽器として BDL を選択します。SAN 提案の可能性および科学的審査委員会による審査は、BDL 要求は可能性のみ上映します。BDL 実現可能性検討のため提出完了した情報要求フォーム48推定収量および蛋白質の表現のプロトコルを記述する (利用可能なオンライン)。
  4. ビームの時間の提案の成功したピア レビュー後、実験前にビームに受賞の日付を確認します。適切なレビューのための提案のすべての数式とサンプルとバッファーの詳細が正しく一覧されることを確認します。サンプルとバッファーの組成の変化を含む実験計画案への変更、施設の届出が必要です。
    注:変更は、割り当て済みの NSS とできるだけ早く議論されるべき。

2. タンパク質測定のため中性子コントラスト マッチ ポイントと必要なコントラストを決定します。

  1. (仕入先の製品情報、オンライン データベース、公開された値など)から情報を収集原子組成とコントラスト-一致する洗剤システム コンポーネントのボリュームに関連します。ソリューションでは、SAN のコンテキストで関心の膜タンパク質のデータと構造情報の品質を得るために重要である中性子散乱長密度 (Sld) を決定し、従ってマッチ ポイント (Cmp) は対照的にこの情報を使用します。PDC。膜タンパク質の生物物理学的研究でよく使用される洗剤の物理特性とコントラスト マッチ ポイントは集計表 (表 1) が含まれています。
  2. Web アプリケーションのマルチを使用して中性子 Sld を決定: モジュールのためのコントラスト変化データ解析49 (利用できるオンライン50の無料)。ユーザー マニュアルへのリンクをホーム ページにあります。サイトにアクセスし、添付ドキュメントを読みます。図 1と図 2 2 つの関連例コントラスト モジュール入力と出力の概要を提供します。
    注:Sld を計算する他のウェブサイトが利用可能、中性子研究の国立研究所の標準とテクノロジ (NIST) センターで整備されたものなど。51
    1. コントラスト モジュールを開くには、左側のナビゲーション ペインにある「コントラスト」をクリックします。プロジェクトのタイトルのテキストを指定し、として (例えば、洗剤のヘッド グループおよび尾) の 2 つのコンポーネントの下の詳細を入力 'サブユニット 1' と' 2' サブユニット。
    2. 「式」テキスト ボックス内の各コンポーネントの分子式を入力します。
      注: ラジオボタンだ '分子式を入力する' 物質型 ' の下で選択する必要があります。また、数式の文字 'X' を使用して、容易に交換可能な水素原子を示します。場合、タンパク質や RNA、DNA シーケンスを入力ことができます対応する 'P'、'R'、またはいた ' ラジオボタンが選択されて。サブユニット内にコンポーネントの複数のコピーが存在する、'Nmolecules' の値はそれに応じて変更できます。実用的な例をここでは片側 2 に等しい Nmolecules で入力する式を許可する 2 つの同一の尾を含んでいる脂質のような洗剤に関連します。
    3. 'ボリューム (Å3)' 下のボックス内の各コンポーネントの立方オングストロームのボリュームを入力します。長さn、 Vテールのアルキル鎖のタンフォードの数式28を使用して = 27.4 + n * 26.9、おおよそ尾翼容積を計算したり、製品情報から分子容積を取得するまたは値を公開文学。
    4. バッファーのコンポーネントの詳細を入力します。'番号溶解溶媒種' を変更するドロップ ダウン メニューを使用して追加またはバッファーの各コンポーネントの行を削除します。ミセル形成の場合洗剤、洗剤の臨界ミセル濃度 (CMC) のコンポーネントを別々 のバッファーとして無料洗剤モノマーが含まれます。
    5. 中性子コントラスト計算を実行し、D2O での任意の特定の割合でこれらのパラメーターを決定するための式と同様に、散乱長密度とコントラスト マッチ ポイントの表を提供しています結果ページを生成するには、[送信] をクリックします。バッファー。コンポーネント Cmp に留意して散乱パラメーターを確認します。マッチ ポイント (10% D2O) の内で類似していると無料ミセル濃度が低いし、CMP がすることができます平均洗剤貢献コントラスト一致に使用されます。ほとんどのケースで洗剤頭グループと尾の CMP よりも 10-15% だけでタンパク質から散乱信号の直接のコレクションを難読化する SAN データでコア-シェル フォーム ファクターを生産異なります。
  3. 洗剤のヘッド グループと尾の間のコントラストを評価します。洗剤頭グループとアルキル鎖尾 Cmp が似合い、可用性と重水素置換洗剤定款を操作する成分の選択の長さ密度を散乱許可できます。ほとんどの場合、これは重水素置換アルキル鎖と同じ洗剤を組み込むことによって混合ミセルを形成が必要です。重水素の添加は、アルキル鎖尾によって形成されたコアの散乱長密度を発生させます。目的のエンドポイントはこの場合、頭グループ シェル CMP とアルキル鎖コア CMP があるほぼ等しい値です。
    1. H 尾と頭のグループと一致する完全なコントラストを実現する d ツインテールの混合の適切な比率を決定することにより頭グループのシェルの CMP に相当する洗剤のミセル コアの CMP を上げます。この決定の前提条件は、重水素置換アルキル鎖尾 CMP の知識です。N-β-D-maltoside (DDM) に市販の相手はすべてアルキル鎖水素重水素 (d25 DDM) に置き換えられます。いた尻尾の手順 2.1 に示したコントラスト計算を繰り返す '' h 尾 ' の代わりに。
    2. CMP の頭のグループとのコントラスト マッチングに必要な d 尾 h 尾のモル比を計算します。次の数式は、この決定に役立ちます。
      CMP頭CMPh 尾を = * χh 尾+ CMPd 尾* χd 尾
      CMP が散乱長密度と χ 洗剤頭 h 尾、または d 尾コンポーネントの体積です。DDM のバッファリングされたソリューションは、定款重水素置換アルキル鎖 d25 DDM として合計洗剤の重量 (ほくろ 43%) の 44% 48.5% D2O の頭と尾のコンポーネントで 1 つの CMP が生成されます。
  4. 膜タンパク質の重水素置換度を検討してください。タンパク質から十分な散乱信号を測定するには、蛋白質の CMP は少なくとも 15% D2O 洗剤 CMP からソリューションで、測定条件をする必要があります。この % 差の正方形と増加する信号。ラベルのないタンパク質の CMP は 〜 42% D2O (CMP の多くの洗剤頭グループに似ています) のソリューションで通常発生するので蛋白質の重水素標識がほとんど常に必要です。52

3. エクスプレスし、興味の膜蛋白質を浄化します。

  1. LB (ホストゲノム スープ) 培地を準備し、大腸菌の成長 (エシェリヒア属大腸菌)細胞のターゲット蛋白質シーケンスの誘引可能な表現のベクトル。
    1. 最小媒体を準備します。H2O または D2O、溶解 7.0 g/L (NH4)2、4、5.25 g/L の Na2HPO4、1.6 g/L KH2PO4、0.50 g/L のクエン酸水素アンモニウム、グリセリン 5.0 g/L、1.0 mL/L 20 %w/v MgSO4·7H2O と 1.0 mL/L ホルメ微量金属 (0.50 g/L CaCl2·2H2O、0.098 g/L CoCl2、0.102 g/L CuSO4、16.7 g/L した FeCl3·6H2O、0.114 グラム/L の MnSO4·H2O、22.3 グラム/L の Na2EDTA·2H2O および 0.112 g/L ZnSO4·H2O)。53,54
    2. H2O または D2o. を使用して適切な抗生の貯蔵液を準備します。
    3. H2O または D2o. を使用してイソプロピル-β-D-1-thiogalactopyranoside 原液を準備します。
    4. 無菌フィルターにすべてのソリューション乾燥、ボトル上部の真空を使用して滅菌容器とシリンジ フィルター孔径 0.22 ミクロンの。
  2. 重水素化タンパク質の発現をスケール アップ中前の重水素標識にエシェリヒア属大腸菌のセルを適応します。
    1. ホストゲノム スープ (LB) 寒天板から隔離されたコロニーまたは冷凍のグリセロール ストックから細胞を LB 培地 3 mL に接種します。250 回転で振動のインキュベーターで 37 ° C で細胞の成長または一晩インキュベート時文化の増殖を避けるために 30 ° C 以下の温度を下げます。
      注:適応手順を変えることができます。55,56,57
    2. 600 の光学濃度に LB 文化が成長していたら nm (外径600) 〜 1、1:20 H2O 最小培地 3 mL に希釈し、~ 1 の外径600に成長します。1:20 を繰り返して 50、75、100% D2O (または) を含む D2O パーセンテージまで最小限の媒体を使用して希釈。
      注: としての D2O 量が増加、成長率が低下します。タンパク質成長メディアおよび重水素置換で D2O の割合の関係は文献で報告されています。58,59,60
    3. 重水素化細胞塊 (図 3) の収穫を増加するバイオリアクターで培養を拡張し続けます。
      注:バイオリアクター操作の詳細な手順は、他の場所で検討されています。61,62,63,64
  3. 収穫し、大腸菌の細胞膜抽出および蛋白質の浄化のための溶解
    1. 30 ~ 45 〜 6,000 × g で遠心分離によって細胞をペレット 4 ° C で分
    2. ~ 30 分間氷の上のバッファーに浸すことによって細胞のペレットを柔らかきます。その後、優しく再懸濁します細胞ペレット バッファーで軽くピペッティング血清ピペットまたは穏やかな ~ 1 g 湿電池質量/10 mL のバッファーの最終濃度に、2 D のロッカーの揺動によって。
      注: 例バッファーは 50 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 酸)、pH 7.5、200 mM の NaCl 添加プロテアーゼ阻害剤タブレット。
    3. 流出を低温中 3 10,000 psi の高圧ホモジナイザーを通過で再懸濁細胞を溶解させます。
      注:必要なスケールによって、他の換散方法は使用される (例えば、フランス語を押すまたは超音波処理によって) にあります。
    4. 4 ° C で 15 分間 4,000 〜 5,000 × g で遠心分離によって細胞の残骸をペレット上清が明らかになるまでこの手順を繰り返します。
    5. 超遠心機 (30-45 分 ~ 150,000 x g)、水溶性を含む前のステップと膜の一部分から上澄み。遠心後のペレットには、膜画分が含まれています。
    6. 大 Dounce ホモジナイザーで膜ペレットを再懸濁し、遠心 (ステップ 3.3.5) によって再び膜画分を分離します。ゆるく縛られた蛋白質を削除するには、この手順を少なくとも 1 回を繰り返します。
    7. 浄化に適した洗剤を含むバッファーの 4 ° C で 30 分程度の穏やかな揺動によって膜可溶化します。可溶化は、懸濁液が透明に変わったら曇りから明らかです。超遠心法 (30-45 分 ~ 150,000 x g) で不溶性物質を削除します。
      注:例バッファーは、50 mM HEPES、pH 7.5、500 mM の NaCl、20 mM のイミダゾールと 4% (w/v) DDM Ni2 +親和性クロマトグラフィーによる浄化のためです。
  4. 次のフォームのプロトン化以前に開発されたプロトコルの蛋白質を浄化します。
    注:タグ付き hexahistidine M. marisnigri JR1膜アスパルチル プロテアーゼ (d MmIAP) の例の浄化のプロトコルのためのナインらを参照してください。65最終的な収量であった 〜 1 mg の重水素重水素化 5 L 細胞培養成長、すべてが使用されたから SAN 実験 (図 4)。
  5. コントラストが一致する「最終的な交換バッファー」に浄化された蛋白質を交換します。
    1. 準備、例えば、20 mM HEPES、pH 7.5 に一致するコントラストの正しい混合物を含む「最終交換バッファー」の 200 mL、250 の mM の NaCl、の 0.05 %%2 49 D2o. で DDM (0.028% DDM と 0.022 %ddm d25) の合計
    2. サイズ排除カラムの平衡 > 2 列内のボリューム (CV)「最終交換バッファー」の 3.5.1 高速蛋白質液体クロマトグラフィー (FPLC) システムを使用しています。
    3. サンプルを注射した後、列を実行し、興味の蛋白質に相当する画分を分離します。
    4. 望ましい最終的な集中 (2-5 mg/mL) に蛋白質を集中します。
      注:〜 300 μ L のボリュームは、SAN の使用 1 mm 円筒形の石英キュベットに合わせて必要です。
    5. 背景差分 SAN の整合バッファーの因数をぜひご予約ください。
      注:準備されたバッファーから直接または理想的に FPLC 実行の終わりにきれいな溶出画分から、因数を取ることができます。

4. ビーム時間と SANS のデータ収集のための最終的な準備を作る

  1. 採択されて、サイトへのアクセスが承認された後は、割り当てられた時間の前にすべての必要なトレーニングを完了します。これは、prearrival、web ベースの敷地内の放射線検査と計測器固有のトレーニングだけでなく、トレーニングが含まれています。
    注:トレーニング要件と、初めてのユーザーのための事前到着が指示できます。詳細については、オンライン利用可能です。66
  2. サンプルおよびデータ コレクションに対するバッファーをロードします。
    注:生物の小角中性子散乱の概要 (バイオ-SAN) 楽器サンプル環境領域は図 5に示します。
    1. サンプルとバッファーを石英セルに読み込みます。楽器の科学者や施設からは、石英セルがあります。ほとんどのサンプル細胞の狭い開口部にアクセスするのにゲル ロード ヒントを使用します。
    2. ビーム シャッターが閉じていることを確認、サンプル環境エリアに接近し、検体チェンジャーで石英セルを配置します。サンプルの各セルのサンプル チェンジャー位置を記録します。
    3. エリアをチェックしビーム光路が閉塞から無料を確認し、サンプル環境領域を残すし、ビーム シャッターを開きます。
      注:慎重にすべての施設の規則および規制に従う、すべての投稿に従うし、楽器の科学者のアドバイスに耳を傾けます。サンプルのビームから削除、次の特別な注意なしビームへの露出の後の操作はありません。これらの手順の前に放射線管理技術者 (RCT) を参照してください。
  3. データ収集の自動化についてはテーブル スキャンを実行します。
    1. カスタム コントロール LabVIEW ベースのソフトウェア分光計測器制御環境 (スパイス) を通って測定器を動作します。中性子散乱科学者によって提供される操作の指示に従います。図 6にテーブル スキャン操作ウィンドウの概要があります。
    2. 適切な分野で必要な情報を入力した後テーブル スキャンを実行し、自動化されたデータ収集プロセスが開始されます。テーブル スキャン ステータス タブを介して進行状況の監視。

5. 1 D のプロットの 2次元画像からの SAN データ削減します。

  1. 記録されたスキャン数から各サンプルとバッファーのデータ ファイルを識別します。各測定には、一意のスキャン数が割り当てられます。この情報は、各対応するサンプルとバッファーのペアを識別するデータ削減の時に便利です。
  2. MantidPlot ソフトウェアと Python スクリプトを使用して、削減のため
    1. 中性子散乱ユーザーは、リモート解析クラスター上のデータにアクセスするためのアカウントの詳細を提供しています。67リモート解析クラスターにログインし、コマンドラインから"MantidPlot"を実行します。図 7および図 8は、これらの手順を支援するために提供されます。
    2. (これは通常実験中に発生します) 中性子散乱科学; からユーザー削減スクリプトを取得します。このスクリプトは、Python ベースは、すべての必要な校正と I(Q) 散乱角の関数として散乱光強度の 1 D のプロットに 2次元散乱画像を縮小するスケーリングの調整が含まれます。
    3. MantidPlot で提供されているユーザー削減スクリプトを開き、適切なリストに対応するスキャン番号またはサンプルとバッファーのペアのための識別を配置します。
    4. 4 段組みテキスト ファイルとして減らされたデータを生成するスクリプトを実行する (列の順序が Q、I(Q)、I(Q) エラーは、Q エラー) 指定した場所に。MantidPlot で適切なワークスペースを右クリックし、「プロット エラー...」散乱プロファイルの初期審査を選択します。

6. 散乱粒子の構造パラメーターのデータを分析します。

  1. セキュリティで保護された FTP ファイル転送を使用してローカル コンピューターに分析サーバーから減らされたデータ ファイルを転送します。これは、CyberDuck FileZilla などのソフトウェアを使って実行できます。追加手順と分析サーバーのファイル システムに接続するための詳細については、analysis.sns.gov ログイン ページで提供されます。
  2. ATSAS ソフトウェア スイート65,68 (全体 ATSAS スイート) をダウンロードします。69個々 のプログラム70も承りますオンラインすなわち構造パラメーターと第一原理計算のモデルを決定する SAN データを分析するため。
    注:多くのオプションは、SANS の生体高分子のデータ解析に使用できます。45
  3. データのプロットに PRIMUS71を使用、バッファー スケーリングし減算と Guinier 分析。
    1. ATSAS 'SAS データ分析' を起動アプリケーションと負荷低減データ ファイルのサンプルとバッファーのペアに対応します。
      1. バッファーを適切に拡大縮小する高 Q でデータ範囲を選択 (Q > 0.5 Å-1) 両方のプロファイルが似ており、フラット、'操作' の下にある 'Scale' ボタンをクリックしてタブします。スケール ファクターは、これら 2 つのフラット領域が重複するようにバッファーに適用されます。注意: バッファー強度サンプルを一致するようにスケーリングを正当化する説得力のある物理的な理由があるはず。ずれが大きい場合は、バック グラウンド減算への有効なアプローチを楽器の科学者を参照してください。44,45,72
      2. すべてのポイントを表示するデータ範囲を増やします。この操作を実行する ' 削除' をクリックします。凡例内のバッファー減算データファイルを右クリックし、その後の分析のためこのファイルを保存します。図 9では、'操作' タブの使用について説明します。
    2. 'SAS データ分析' アプリケーション '分析'] タブを使ってバッファー減算サンプル データの Guinier 解析を実行します。
      1. 一覧で適切なファイルを選択し、' 旋回半径 ' をクリックします。自動でフィット Guinier を実行しようとした場合は、'Autorg' ボタンをクリックして提供されます。
      2. 低 Q データのすべてを含めるし、尿まで高 Q ポイントを奪うことによってデータ範囲を縮小を開始に使用するデータの範囲を拡大 * Rg制限が 1.3 以下。残差のプロットを使用して、データが適合範囲で線形であることを確認します。フィット Guinier では、おおよその Rgと散乱粒子の0が得られます。
      3. フィットの領域を少しずつ調整し、フィットで使用されるデータの範囲にこれらの値の感度を監視します。図 10 aは、「旋回半径 ' ツール使用を示します。
  4. 確率分布関数 (GNOM の P(r))。73ここで生成された出力ファイルは、入力として、第一原理計算モデルの作成プロセスに使用されます。
    1. データによいフィットを取得 '分析' タブ内の距離配布ウィザードを開始品質モデルの取得に不可欠です。正確なフィットを取得に関する詳しい情報は、パットナムらによるレビュー74を参照してください。
      注:「GNOM プログラム距離配布ウィザードを超えてフィットに関する追加情報を提供します。図10Bに '距離分布' ツールの適切な使用と図 11に発生する一般的なエラーのいくつかを示します。
    2. Dmax、分子内最大原子間の距離を決定します。
      1. Rmax を強制するチェック ボックスをオフして Dmax の値を見積もる = 0 および Dmax に大きな値を入力 (150 Å、たとえば)。P(r) のプロットの最初の x 切片の値には、この推定値が得られます。
      2. この Dmax 値と使用するデータの範囲またはフィット データと結果 P(r) 曲線に合わせて GNOM を最適化するために使用されるポイント数を増分変更します。
    3. 続行 GNOM フィットを改良しモデリング手順以降第一原理計算の良いフィット パラメーターに GNOM 出力ファイルを保存します。
  5. SANS の CRYSON プログラムを使用して高解像度 PDB モデルからプロファイルをシミュレートします。75
    1. プログラムを開き、'0' のオプションを選択します。ポップアップのファイル ブラウザーに PDB ファイルの名前を選択します。適切なコントラストのパラメーターを達成するために溶剤でチェーン重水素化画分と D2O の分数を指定することを除いて、既定の設定を受け入れる enter キーを押します。
    2. 'Y' を入力しポップアップ ファイル ブラウザーでデータ ファイルを選択実験のデータ セットにモデルに適合します。残りの既定値を受け入れるし、出力ファイルが PDB ファイルの場所に書き込まれます。'.Fit' ファイルには、高解像度の 3 D モデルから予測される散乱プロファイルの情報が含まれています。

7.第一原理からモデルを作成する、データの SANS。

注: DAMMIF76と77 ATSAS ソフトウェア スイート内の DAMMIN を使用して出力、P(r) データや確率についての情報を含む GNOM から焼鈍処理のシミュレーションを使用してダミー原子モデル (ダム) を再構築するか散乱粒子内の原子間距離の頻度。これらのプログラムは、バッチ モードと ATSAS オンラインの web サーバーで実行可能性があります。

  1. 'SAS データ分析' の '分析' タブで 'Dammif' ボタンからプリムス形状ウィザードを起動し、パラメーターの手動選択を使用します。ウィザードの入力は、図 12に示されています。
    1. フィット (ステップ 6.3.2) から Guinier 範囲を定義し、ナビゲーション ボタンを使用して次の手順に進みます。P(r) プロット (ステップ 6.4) からフィットの値を定義し、次の手順に進みます。
    2. 第一原理計算モデルの作成プロセスのパラメーターを提供します。モデル出力ファイル名 (例: SANSEnvelope) のプレフィックスを入力する、いずれかの '高速' または 'ゆっくり' モード モデルを選択、モデル (統計的な有意性をお勧めします 17) 数の値を入力、粒子の対称性の利用可能なオプションから選択anisometry と角度スケール (既知の場合)。ボックス平均モデル DAMAVER にチェックされます、DAMMIN と最終的なモデルを絞り込むことを確認します。
    3. 'Commit' ボタンを使用して、プロセスを開始します。プロセスが完了すると、表示および作業ディレクトリに保存します。
      注: 1 つの一般的なモデリング プロセス、小さなタンパク質にかかることが一般的なパソコンでは数時間。ファイルは、保存されるまで一時ディレクトリに格納されます。
  2. オーバーレイし、決勝をスーパーイン ポーズ内 ATSAS SUPCOMB を使用して関連する高解像度モデルのエンベロープ SAN。作業ディレクトリで SAN 封筒に合わせて高解像度の PDB のモデルのコピーを配置します。コマンドラインから SUPCOMB を実行最初に表示されるテンプレートの構造を持つ 2 つの引数として PDB ファイル名を使用して: $ supcomb HiRes.pdb SANSEnvelope.pdb
    注:テンプレート構造の重ね合わせの終わりと新しい座標に追加"r"で新しいファイルとして記載されている 2 番目のファイル名が書き換えられます。
  3. ソフトフェア (pymol.org)、分子の 3 D グラフィックス表示プログラムを使用して経験的モデル結果を可視化します。図 13は、ソフトフェアの操作の概要を提供します。
    注:溶液中の生体分子から小角散乱データの構造化のための文書ガイドラインがあります。78
    1. ソフトフェア アプリケーションを起動し、表示する SANS の封筒と SUPCOMB 揃えの高分解能構造 3 D に対応する .pdb ファイルを開きます。
    2. サーフェスとしてこのモデルを表すことによって SAN 封筒を視覚化します。クリックして s 'モデルと選択] の横にあるボタン' を表示: として: 表面 '。
    3. 漫画としてこのモデルを表現することによって高解像度のタンパク質の骨格構造を視覚化します。選択 s 'このモデルの横にあるボタンをクリックし、選択' を表示: として: 漫画 '。'C' ボタンを選択することによって虹 N ・ C 末端のようにチェーンを表示と ' によってチェーン: Chainbows'。
    4. わかりやすくするため表面の表現の透明度を変更します。「設定」メニュー ・ バーから選択 ' 透明» 表面» 40% '。
    5. 背景白と非不透明。'Display' のメニューバーから選択 ' 背景»' '不透明' このオプションと '白' の背景にこの色をマークするをオフにするを選択します。
      注: 追加の操作、ソフトフェアの使用方法は、PyMolWiki.org で見つけることができます。

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結果

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ビームの時間と計測器の提案は、提案する実験の有効な評価を行うことができますので、審査委員会に必要なすべての情報を明確に伝える必要があります。NSS との通信は非常に経験の浅いユーザーの示唆されました。NSS は、初期の可能性と可能性、安全性、効果の高い科学の可能性を強調するガイド提案提出を評価できます。提案で提供される情報は、背景情報と、研究の意義のコンテキストを含める必要があります。知識を獲得することになっている、これは科学の分野で現在の理解に及ぼす影響について作業、サンプル、メソッド、および採用される手順の説明該当する場合は、関連する出版物や結果をはじめとして、施設でのチームの前の生産性。中性子科学ユーザー ポータル (neutrons.ornl.gov/users) 経由でユーザーに提案書テンプレートや、提案を準備するためのヒントなどの有用な資源があります。

実験計画がしばしば提案書の提出の最初の段階の間に始まる実験直前まで完全に構想がない動的な...

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ディスカッション

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構造生物学研究では、溶液散乱溶液中生体分子から (全体のサイズや形) など生化学的および構造の詳細を取得するような相補的な構造技術を活用します。SAN は、膜蛋白質の低分解能構造、現代構造生物学と生化学のコア焦点を決定するための特に魅力的な手法です。SAN に匹敵する結晶構造試験 (1 mg/サンプル) の浄化された蛋白質の量が必要です。高純度重水素化洗剤膜タンパク質研究に関連する、最近拡大の商業的利用にアクセス可能なこの水素/重水素実験膜蛋白質界面活性剤複合体のサンセリフのコンテンツを操作するための手段蛋白質信号を直接記録することができます。成功した場合、わずか数時間にわたって収集されたデータから経験的モデル分子エンベロープを計算できます。したがって、膜蛋白質の生化学者、とらわれる、および構造生物学者容易に活用できます SAN ソリューションの膜蛋白質、パートナーまたは基板、および得られたモデルを結合との複合体構造の切望された最初の 3 D モデルを取得するのSAN では、回折データを段階的に使用できます。膜蛋白質を特徴付けるための SAN のルーチン使用膜タンパク質の生化学分野の変革と創薬と開発に基本的な構造機能か...

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開示事項

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フォルカー s. 都市、サイ ヴェンカテシュ Pingali、ケビン ・ l ・ ワイス、C. ライアンオリバー著者が中性子科学ユーザー プログラムとバイオ サポートする米国 DOE と UT バテルを通じて契約されています-オークリッジ国立研究所のこの記事で使用される楽器の SANS。

この原稿がされてポーセリンペインティングの UT-バテル、LLC は、デ-AC05-00OR22725 米国エネルギー省 (DOE) との契約の下。米国政府を保持し、パブリッシャー、パブリケーションのアーティクルを受け入れることで米国政府が発行またはこの原稿の発行済みのフォームを再現したりする非独占的、払込、取消不能、世界的なライセンスを保持することを認める他の人は、米国政府の目的のために。DOE は、DOE のパブリック アクセスの計画に従って連邦政府委託研究のこれらの結果へのパブリック アクセスを提供します。 82

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

構造分子生物学 (CSMB) とバイオのオークリッジ国立研究所のセンターで研究をサポート オフィスの生物と環境の研究-科学的なユーザー施設課の基本的なエネルギー科学のオフィス、米国部門でサポートされている機能を使用して SANエネルギー。リーバーマン ラボでの膜タンパク質の構造的な仕事は、NIH (DK091357、GM095638) によってサポートされている、NSF (0845445)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アミコンウルトラMWCO 50KDa濃縮器 EMD MilliporeUFC905096labware
エン酸アンモニウム二塩基性 Fisher ScientificA663中成分
硫酸アンモニウムEMD Millipore2150中成分
Bioflo 310 バイオリアクターシステムEppendorfM1287-2110機器
塩化カルシウム二水和物アクロス423525000 中成分
カルベニシリンIBI サイエンティフィックIB02025抗生物質
クロラムフェニコールEMD ミリポア3130抗生物質
塩化コバルト (II) アクロスAC21413-0050中成分
硫酸銅 (II)アクロスAC19771-1000 ミディアムコンポーネント
酸化重水素Sigma-Aldrich756822中成分
ドリエライト ガス清浄器W.A. ハモンド ドリエライト (株)27068
EDTA、二ナトリウム、二水和物EMDミリポア4010中型成分
Emulsiflex-C3AvestinEF-C3機器
Äkta 清浄機 UPC100GEヘルスケア 機器
グリセロールSigma-AldrichG5516中成分
HEPESSigma-AldrichH4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR columnGE Healthcare 
イミダゾールVWR97064-622
IPTGテクノバI3325
塩化鉄(III) 六水和物MP 生化学品ICN19404590中成分
LB 寒天ミラーフィッシャーサイエンティフィックBP1425-2
硫酸マグネシウム七水和物VWR97062-134中成分
硫酸マンガン(II) 一水和物アクロスAC20590-5000中成分
MaxQ 6000 インキュベート/冷蔵シェーカーThermo ScientificSHKE6000-7 備品
n-ドデシル-d25-&β;-D-マルトピラノシドアナトレースD310T
n-ドデシル-&β;-D-マルトピラノシドアナトレースD310A
リン酸カリウム 一塩基性VWR97062-346中型成分
RC 6 プラス 遠心分離機Thermo Scientific Sorvall46910機器
SIGMAFAST プロテアーゼ阻害剤 カクテル錠、EDTAフリーSigma-AldrichS8830
塩化ナトリウムSigma-AldrichS3014
水酸化ナトリウムSigma-Aldrich795429
リン酸二塩基性Sigma-AldrichS7907中型成分
滅菌 25mm シリンジフィルター 0.2µm PESの膜VWR28145-501のlabware
0.2µが付いている生殖不能の使い捨て可能なびんの上のフィルター;m PESメンブレンThermo Scientific596-4520 実験器具
スーパーデックス 200 10/300 GL GEヘルスケア 
Superose-12 10/300 GLコラム GEヘルスケア 
Ultrospec 10 細胞密度計GE Healthcare 80211630機器
硫酸亜鉛一水和物アクロスAC38980-2500 ミディアムコンポーネント
ク17116701の1751750117517301

参考文献

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