方法論記事

膜蛋白質の構造解析および経験的モデリング中性子小角散乱実験でコントラストに一致する洗剤

DOI：

10.3791/57901

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2018年10月21日

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1Neutron Scattering Division, Oak Ridge National Laboratory, 2School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology

この記事について

サマリー

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このプロトコルは、低解像度第一原理計算モデルと洗剤のコントラストが一致する中性子小角散乱法を用いたソリューションの洗剤可溶化膜蛋白質の構造の詳細を取得する方法を示します。

要約

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高流束同位体リアクターのオークリッジ国立研究所で生物学的中性子小角散乱装置、生体材料ナノからをカバー、バイオ燃料の処理、生物学的材料の調査に捧げられてマイクロメータ スケール。膜タンパク質の物性 (すなわちサイズと形状) を調査するためにここで提示されたメソッド (ここで MmIAP、 Methanoculleus marisnigriから膜アスパルチル プロテアーゼ) ミセル形成のソリューションで洗剤とりわけこの中性子小角散乱装置に適しています。他の生物物理学的解析技術がタンパク質洗剤複雑な構造で洗剤の貢献に対処する彼らの無力によって妨げられます。さらに、バイオ重水素化研究室へのアクセスは、大規模な耕作を準備し、タンパク質強化による散乱信号の重水素標識蛋白質を表現するためのユニークな機能を提供します。この技術は、高分解能で構造の詳細を提供しない、膜蛋白質の構造の知識のギャップには近く原子分解能を必要とせず研究の多くのアドレス指定可能な分野が含まれています。たとえば、これらの区域は、摂動、および折りたたみ/展開イベント オリゴマー状態、複雑な形成、構造変化の測定を含みます。これらの調査は、このメソッドのアプリケーションを容易に実現できます。

概要

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膜タンパク質は、すべての遺伝子1の推定 30% がエンコードされ、現代の医薬品のターゲットの大多数を表します。2これらの蛋白質は、彼らの豊かさと重要性にもかかわらず重要な細胞機能を3の広い配列を行うなど、研究利用に供構造バイオインフォマティクス (RCSB) 蛋白質のための総構造の約 1% にすぎませんデータ ・ バンク。4彼らの部分的に疎水性性質のため膜結合蛋白質の構造決定が極めて挑戦でされています。5,6,7

生物物理技法の多くは、測定溶液中における同一径粒子を必要と、ネイティブ膜から膜タンパク質を分離し、生体膜の可溶性模倣これらのタンパク質の安定化は最近の研究の活発な領域をされています。数十年。8,9,これらの調査は、nanodiscs11,12

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プロトコル

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1. 準備し、中性子施設はり時間と計測器の提案を提出

  1. 一般的なユーザー中性子ビームの時間アクセス、オークリッジ国立研究所 (ORNL) などを提供する中性子散乱施設を特定するためのオンライン リソースを参照してください。中性子設備、中性子研究世界についての情報の地図はオンラインできません。46これらの施設が通常提案; 通常の呼び出しであることを注意これは次回のビームが利用できる時を決定します。中性子は、さまざまなアプリケーションに使用されます。中性子小角散乱 (SAN) 楽器、特に、生物学的サンプルの機能を検索します。
  2. 中性子ビームの時間提案提出プロセスをナビゲートするために中性子設備によって提供されるリソースを使用します。あなたが適用されます楽器に関連付けられている中性子散乱科学者 (NSS) とを参照してください。中性子施設の公募、期限、および送信のための助言に関する現在の情報を確認します。オークリッジこれは利用可能なオンラインです。47は、送信が成功したのすべてのガイドラインに従うビーム時間の提案を提出します。
  3. 重水素化蛋白質が必要 (2.2 を参照) の場合、中性子散乱施設多い所と重水素化材料の生産に特化の専門知識によってサポートされます。オークリッジ国立研究所でバイオ重水素化ラボ (BDL) へのアクセスを要求するには、提案システムで 2 番目の楽器として BDL を....

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結果

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ビームの時間と計測器の提案は、提案する実験の有効な評価を行うことができますので、審査委員会に必要なすべての情報を明確に伝える必要があります。NSS との通信は非常に経験の浅いユーザーの示唆されました。NSS は、初期の可能性と可能性、安全性、効果の高い科学の可能性を強調するガイド提案提出を評価できます。提案で提供される情報は、背景情報と、研究の意義のコンテキストを含める必要があります。知識を獲得することになっている、これは科学の分野で現在の理解に及ぼす影響について作業、サンプル、メソッド、および採用される手順の説明該当する場合は、関連する出版物や結果をはじめとして、施設でのチームの前の生産性。中性子科学ユーザー ポータル (neutrons.ornl.gov/users) 経由でユーザーに提案書テンプレートや、提案を準備するためのヒントなどの有用な資源があります。

実験計画がしばしば提案書の提出の最初の段階の間に始まる実験直前まで完全に構想がない動的な.......

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ディスカッション

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構造生物学研究では、溶液散乱溶液中生体分子から (全体のサイズや形) など生化学的および構造の詳細を取得するような相補的な構造技術を活用します。SAN は、膜蛋白質の低分解能構造、現代構造生物学と生化学のコア焦点を決定するための特に魅力的な手法です。SAN に匹敵する結晶構造試験 (1 mg/サンプル) の浄化された蛋白質の量が必要です。高純度重水素化洗剤膜タンパク質研究に関連する、最近拡大の商業的利用にアクセス可能なこの水素/重水素実験膜蛋白質界面活性剤複合体のサンセリフのコンテンツを操作するための手段蛋白質信号を直接記録することができます。成功した場合、わずか数時間にわたって収集されたデータから経験的モデル分子エンベロープを計算できます。したがって、膜蛋白質の生化学者、とらわれる、および構造生物学者容易に活用できます SAN ソリューションの膜蛋白質、パートナーまたは基板、および得られたモデルを結合との複合体構造の切望された最初の 3 D モデルを取得するのSAN では、回折データを段階的に使用できます。膜蛋白質を特徴付けるための SAN のルーチン使用膜タンパク質の生化学分野の変革と創薬と開発に基本的な構造機能か.......

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開示事項

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フォルカー s. 都市、サイ ヴェンカテシュ Pingali、ケビン ・ l ・ ワイス、C. ライアンオリバー著者が中性子科学ユーザー プログラムとバイオ サポートする米国 DOE と UT バテルを通じて契約されています-オークリッジ国立研究所のこの記事で使用される楽器の SANS。

この原稿がされてポーセリンペインティングの UT-バテル、LLC は、デ-AC05-00OR22725 米国エネルギー省 (DOE) との契約の下。米国政府を保持し、パブリッシャー、パブリケーションのアーティクルを受け入れることで米国政府が発行またはこの原稿の発行済みのフォームを再現したりする非独占的、払込、取消不能、世界的なライセンスを保持することを認める他の人は、米国政府の目的のために。DOE は、DOE のパブリック アクセスの計画に従って連邦政府委託研究のこれらの結果へのパブリック アクセスを提供します。 82

謝辞

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構造分子生物学 (CSMB) とバイオのオークリッジ国立研究所のセンターで研究をサポート オフィスの生物と環境の研究-科学的なユーザー施設課の基本的なエネルギー科学のオフィス、米国部門でサポートされている機能を使用して SANエネルギー。リーバーマン ラボでの膜タンパク質の構造的な仕事は、NIH (DK091357、GM095638) によってサポートされている、NSF (0845445)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アミコンウルトラMWCO 50KDa濃縮器 EMD MilliporeUFC905096labware
エン酸アンモニウム二塩基性 Fisher ScientificA663中成分
硫酸アンモニウムEMD Millipore2150中成分
Bioflo 310 バイオリアクターシステムEppendorfM1287-2110機器
塩化カルシウム二水和物アクロス423525000 中成分
カルベニシリンIBI サイエンティフィックIB02025抗生物質
クロラムフェニコールEMD ミリポア3130抗生物質
塩化コバルト (II) アクロスAC21413-0050中成分
硫酸銅 (II)アクロスAC19771-1000 ミディアムコンポーネント
酸化重水素Sigma-Aldrich756822中成分
ドリエライト ガス清浄器W.A. ハモンド ドリエライト (株)27068
EDTA、二ナトリウム、二水和物EMDミリポア4010中型成分
Emulsiflex-C3AvestinEF-C3機器
Äkta 清浄機 UPC100GEヘルスケア 機器
グリセロールSigma-AldrichG5516中成分
HEPESSigma-AldrichH4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR columnGE Healthcare 
イミダゾールVWR97064-622
IPTGテクノバI3325
塩化鉄(III) 六水和物MP 生化学品ICN19404590中成分
LB 寒天ミラーフィッシャーサイエンティフィックBP1425-2
硫酸マグネシウム七水和物VWR97062-134中成分
硫酸マンガン(II) 一水和物アクロスAC20590-5000中成分
MaxQ 6000 インキュベート/冷蔵シェーカーThermo ScientificSHKE6000-7 備品
n-ドデシル-d25-&β;-D-マルトピラノシドアナトレースD310T
n-ドデシル-&β;-D-マルトピラノシドアナトレースD310A
リン酸カリウム 一塩基性VWR97062-346中型成分
RC 6 プラス 遠心分離機Thermo Scientific Sorvall46910機器
SIGMAFAST プロテアーゼ阻害剤 カクテル錠、EDTAフリーSigma-AldrichS8830
塩化ナトリウムSigma-AldrichS3014
水酸化ナトリウムSigma-Aldrich795429
リン酸二塩基性Sigma-AldrichS7907中型成分
滅菌 25mm シリンジフィルター 0.2µm PESの膜VWR28145-501のlabware
0.2µが付いている生殖不能の使い捨て可能なびんの上のフィルター;m PESメンブレンThermo Scientific596-4520 実験器具
スーパーデックス 200 10/300 GL GEヘルスケア 
Superose-12 10/300 GLコラム GEヘルスケア 
Ultrospec 10 細胞密度計GE Healthcare 80211630機器
硫酸亜鉛一水和物アクロスAC38980-2500 ミディアムコンポーネント
ク17116701の1751750117517301

参考文献

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  1. Wallin, E., Heijne, G. V. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Science. 7 (4), 1029-1038 (1998).
  2. Tautermann, C. S. GPCR struc....

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