Method Article

マウス心臓のセクションを使用してその場で交配で発現組織固有の miRNA

DOI:

10.3791/57920

⸱

September 15th, 2018

 ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, University College London, 2Yale Cardiovascular Research Group, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine, 3Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine

In This Article

Summary

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マイクロ Rna (Mirna) は、メッセンジャー Rna (Mrna) の転写調節因子として、短いと高い相同性の RNA シーケンスです。現在の miRNA 検出方法は、感度と特異度で変わる。In situハイブリダイゼーションや免疫染色マウス心臓ティッシュ セクションのマイクロ Rna とタンパク質分子の同時検出を組み合わせたプロトコルについて述べる。

Abstract

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マイクロ Rna (Mirna) は、メッセンジャー Rna (Mrna) にバインドの翻訳を阻害して、劣化を促進させる、単一座礁させた RNA 転写産物です。日には、miRNAs はマイクロ Rna 転写産物の信頼性の高い検出法の必要性を意味したが、生物学的および病気プロセスの多数に関与しています。ここでは、ジゴキシゲニン標識 (DIG) ロックされた核酸 (LNA) プローブを用いた miRNA 検出、マウス心臓セクションにおける蛋白免疫染色と組み合わせるための詳しいプロトコルについて述べる。まず、プローブを使用して、コントロールと心臓肥大のマウスからの中心セクションに miRNA 182 式を識別するの in situハイブリダイゼーション法を行った。次に、共同 miRNA-182 心筋細胞をローカライズするのには、同じセクションの心臓トロポニン T (cTnT) タンパク質に対する免疫染色を行った。このプロトコルを使用して、アルカリ性ホスファターゼによる miRNA 182 ベースの比色定量法と蛍光染色を通じて cTnT を検出することができました。このプロトコルは、LNA の掘分類されたプローブを介して関心の任意の miRNA の発現とマウス心臓切片に関連するタンパク質の発現を検出する使用することができます。

Introduction

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マイクロ Rna (Mirna) は短い (18-25 のヌクレオチド)、単一座礁させた、非コード Rna メッセンジャー RNA (mRNA) の翻訳を抑制することおよび/または mRNA の分解促進により転写レベルでの遺伝子発現の負の制御因子として機能します。1。 miRNAs はイントロンやコーディングのエクソンから転写されるまたは非コード遺伝子と切断 70 ヌクレオチド2の短い茎ループ構造は、前駆体 miRNAs (pre-Mirna) に DROSHA、による核。次の細胞質をエクスポート、プレは 18-25 のヌクレオチド3,4にまたがる成熟 Mirna にダイサーによってさらに処理されます。その後、RNA によるサイレンシング複合体 (RISC) として組み込まれていますこれらの Mirna 一本鎖 Rna を式3,5 を抑制するため、3' 非翻訳領域 (3' UTR)、ターゲット Mrna に結合可能.

最後の三十年に彼らが最初に識別されたので、遺伝子発現、その独自の表現のレベルが厳しく制御された6<....

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Protocol

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この研究のマウス心臓組織サンプルは関連する法律と制度のガイドラインに準拠して得られたし、イェール大学機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。

1. ソリューションの準備

  1. RNase フリー ddH2O を用意し、5 ml の 0.1% ジエチルピロカーボネート (DEPC) の ddH2O の 5 L を扱うことによって常温 (RT) (O/N) を一晩します。オートクレーブ (121 ° C)、DEPC を非アクティブ化します。使用 DEPC 処理 ddH2O 準備のため下流のソリューションが示されます。
    注意: DEPC は既知の発癌物質、発煙のフードのみを処理します。
  2. 1 x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) ソリューションを準備するには、1 l の DEPC 処理 ddH2o ・ オートクレーブ (121 ° C) 5 PBS 錠剤を溶解します。
  3. 非イオン性洗剤 1 × PBS の 1 L あたり 1 mL を希釈して 0.1% 非イオン性洗剤/PBS (pbst;) を準備します。
  4. DEPC 処理 ddH2o. で 90%、70%、50%、30% のエタノールを準備します。
  5. DEPC 処理 ddH2O. 因数でプロテアー....

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Results

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miRNAの in situハイブリダイゼーション スクランブル miRNA と U6 snRNA、それぞれ正と負のコントロールとして提供を使用してマウス中心セクションの最適化を行った。否定的な汚損は発色の欠乏によって示されている間、青で示されます陽性 (図 1 a-1 b)。MiRNA 182 の心筋細胞特異的発現を制御 PlGF 過剰発現マウスからの心臓セクションで評価しました。ΑMHC プロモーター PlGF 遺伝子を運ぶマウスは、遺伝子活性化26の 6 週間以内に心臓肥大、血管新生にセカンダリを開発します。In situハイブリダイゼーションを行い PlGF マウス、コントロールと比較しての心の中に 182 miRNA の発現の増加を発見した (図 2 a-2 H)、青染色によって示される。セル種.......

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Discussion

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miRNA のトラン スクリプトの検出は、感度、特異性、定量的な力が異なる別の技術で実現できます。ここでは、miRNAの in situハイブリダイゼーション免疫染色のカップリングを示す心のセクションは同じに、マイクロ Rna とタンパク質分子の発現量の同時評価を可能にするプロトコルを記述し、。心臓切片で上皮内掘 LNA マイクロ Rna プローブの交配を実行する方法を示す.次に、我々 は同じセクションに cTnT の免疫染色を行う方法をについて説明します。最後に、我々 は結果のカラーと蛍光画像をマージする方法を示します。このプロトコルは、ホルマリン固定 (4 ° C, O/N) に最適化されています/パラフィン掘 LNA miRNA プローブと cTnT を使ってマウス中心のティッシュを埋め込まれました。さらに最適化可能性がありますさまざまな組織に必要なプローブまたは抗体の種類、下記のとおりです。

RNase フリーの条件は、RNase の混入することができます実験の結果が著しく損なわれると、交配のプローブにつながるステップ全体にわたって慎重に.......

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Disclosures

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著者が明らかに何もありません。

Acknowledgements

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我々 は原稿の批判的なコメントのアタナシオス Papangelis を感謝したいです。バイオ テクノロジー ・生物科学研究会議 (BBSRC; で FM をサポートします。BB/M009424/1)。IP は、アメリカ心臓協会の科学者開発の補助金 (17SDG33060002) によってサポートされます。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ジエチルピロカーボネートSigma AldrichD5758DEPC
リン酸緩衝生理食塩水Sigma AldrichP4417PBS
Tween-20American BioanalyticalAB02038非イオン性界面活性剤
HistoclearNational DiagnosticsHS-200
Proteinase K, recombinant, PCR GradeSigma Aldrich3115879001ProK
パラホルムアルデヒドΣ AldrichP6148PFA
塩化ナトリウムThermoFisherS271NaCl
塩化マグネシウム 六水和物ThermoFisherM33MgCl2
TrisSigma AldrichT6066
塩酸溶液、1 NThermoFisherSA48HCl
塩酸溶液、12 NサーモフィッシャーS25358HCl
1-メチルイミダゾールSigma Aldrich336092
N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N′-エチルカルボジイミド塩酸塩Sigma Aldrich39391EDC
過酸化水素溶液 H2O2Sigma Aldrich216763H2O2
クエン酸三ナトリウム二水和物Sigma AldrichS1804クエン酸ナトリウム
miRCURY LNA miRNA ISH バッファーセット (FFPE)Qiagen339450スクランブル miRNA/U6 snRNA
miRCURY LNA mmu-miR-182 検出プローブQIagenYD006157015'-DIG および 3'-DIG 標識塩
酸レバミゾールSigmaAldrich31742
ウシ血清アルブミンSigma AldrichA9647BSA
NBT/BCIP 錠Sigma Aldrich11697471001NBT-BCIP
塩化カリウムThermoFisherP217KCl
DAPI 溶液 (1mg/ml)ThermoFisher62248DAPI
ガラスカバースリップThermoFisher12-545Eガラスカバースリップ
プラスチックカバースリップGrace Bio-LabsHS40 22mmX40mmX0.25mmRNAアーゼフリープラスチックカバースリップ
抗ジゴキシゲニン-AP、ファブフラグメントシグマ・アルドリッチ11093274910DIG抗体
疎水性バリアペンベクターラボラトリーズH-4000パップペン
抗心筋トロポニンT抗体アブカムab92546cTnT抗体
ヤギ抗ウサギIgG(H + L)交差吸収二次抗体、Alexa Fluor 568ThermoFisherA-11011抗ウサギ-568抗体
Dako Fluorescence 埋込培地DAKOS3023埋込培地
羊血清Sigma AldrichS3772
ヤギ血清ΣAldrichG9023
脱イオンホルムアミドアメリカ人バイオアナリシスAB00600
ハイブリダイゼーションオーブンThermoFisherUVP HB-1000 ハイブリダイザー

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  2. Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature. 432, 231-235 (2004).
  3. Hu....

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In Situ HybridizationMicroRNA DetectionMouse Heart SectionsProtein ImmunostainingCardiac Troponin TDigoxigenin Labeled ProbeLocked Nucleic AcidAlkaline Phosphatase AssayFluorescent StainingTissue Section Preparation

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