方法論記事

従来のひと多能性幹細胞の向上多能分化と素朴なような状態の復帰化学

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DOI：

10.3791/57921

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2018年6月10日

 ,  ,  , 
1Department of Oncology, Division of Pediatric Oncology and Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins School of Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

効率的な一括、および急速な化学復帰従来系列プライミングひと多能性幹細胞 (hPSC) の epigenomically 安定した素朴な着床前胚盤葉上層のような多能性状態にするためのプロトコルを提案します。このメソッド結果減少系統プライミング遺伝子発現と分化多能でマーク付きの改善で従来の hPSC ラインの幅広いレパートリー。

要約

素朴なひと多能性幹細胞 (N hPSC) 機能改善された再生医療全体への影響があります。このプロトコルの目的は、効率的にリネージュ プライミング、従来人間多能性幹細胞 (hPSC) を機能改善された世間知らずのような多能性フィーダー無料またはフィーダーに依存した条件で保持される元に戻すです。復帰するこの化学世間知らずの手法では古典的な白血病抑制因子 (LIF)、GSK3β、MEK/ERK 抑制がカクテル (LIF 2 i) の時にタンキラーゼ阻害剤 XAV939 のみと補われる (LIF 3 i)。LIF 3i 生化学的解析、転写を採用し安定した多能性状態と人間着床前胚盤葉上層のエピジェネティックな機能を従来の hPSC を元に戻します。この LIF 3i メソッドは、ヒト胚性幹細胞 (hESC) と transgene 無料ひと誘導多能性幹細胞 (による) 線の広いレパートリーの中で再現性の高い最小限細胞培養操作が必要です。LIF 3i 方法では分化; 前に再プライミングの手順は必要ありません。N hPSC は非常に高い効率を直接区別できる保守核型とエピゲノム安定性 (捺印された遺伝子を含む)。、法の普遍性を向上させるため、従来の hPSC は蛋白質キナーゼ (フォルスコリン) とソニック ・ ザ ・ ヘッジホッグ (sHH) (purmorphamine) (LIF-5i) のシグナルを増強する 2 つの追加小分子添加 LIF 3i カクテルで培養最初。この簡単な LIF 5i 適応ステップ大幅に従来の hPSC の初期のクローン性増殖を強化し、LIF-3i バルク量で一人でこうしてピッキング/subcloning 珍しい N-hPSC のための必要があるとその後素朴な復帰することができるようにその後の植民地。LIF 5i 安定 hPSCs その後に保持されます LIF 3i 抗アポトーシス分子を必要とせず単独で。最も重要なは、LIF 3i 復帰は著しくリネージュ プライミング遺伝子発現を減少させると分化のインター ライン変動をよく消去によって向上従来 hPSC の幅広いレパートリーの機能的な多能性独立した hPSC ラインの中で観察。LIF 3i 戻った N hPSC の代表的な特徴は、リネージュ プライミング対同質遺伝子 hPSC の機能比較のため、そして実験的戦略です。素朴なような状態のとおりです。

概要

2i (MEK/ERK と GSK3β 阻害剤) 文化システムはマウス着床前胚盤葉上層1と同類の多能性の基底状態の制服に異種血清を用いたマウス胚性幹細胞 (mESC) 文化を絞り込むに元々 開発されました。ただし、2 i は、ひと多能性幹細胞 (hPSC) 線2の維持安定をサポートしません。様々 な成長因子の添加、複合体の小さい分子や形質推定をキャプチャする報告されている最近似たような人間のような素朴な多能性分子状態2。ただしもこれらのメソッドで作成された「世間知らずのような」状態の多くは核型不安定性、エピゲノム欠陥 (親ゲノムインプリンティングの例えば、グローバル損失) を展示や分化の障害。

コントラスト、トリプルの化学的阻害剤 GSK3β、ERK およびタンキラーゼ シグナリングのカクテルと白血病抑制因子 (LIF 3 i) は従来の hPSC ライン3の幅広いレパートリーの安定した世間知らずのような復帰のため十分でした。LIF 3i 戻す素朴な hPSC (N hPSC) 正常核型を維持し、素朴な固有人間着床前胚盤葉上層の遺伝子の表現を増加した (e.g.,NANOG、 KLF2 NR5A2、DNMT3L、HERVH、ステラ (DPPA3)、 KLF17、 TFCP2L1)。MESC のような素朴な多能性リン酸化 STAT3 シグナリング増加含まれて、ERK のリン酸化、グローバル 5-メチルシトシン CpG を減少するユニークな分子および生化学的な特性の配列と LIF 3i 復帰も授与 hPSC低いメチル化、胚性幹細胞 (ESC) のゲノム広い CpG メチル-特定の遺伝子の促進者と支配的な遠位 OCT4 エンハンサー使用。また、他の世間知らずと比較して異常 hypomethylated の結果返還方法刻印ゲノム遺伝子座, LIF 3i 戻った N hPSC 刻印 CpG パターンの体系や DNA メチルトランスフェラーゼ式の損失を欠いている (などDNMT3A、DNMT1 DNMT3B)3。

従来ヒト胚性幹細胞 (hESC)、ひと誘導多能性幹細胞 (こと) の送り装置か E8 フィーダー無料条件で栽培の広範な配列の直接 LIF 3i 文化は、素朴な鱗のような状態に迅速かつ一括返還を実現しました。ただし、直接 LIF 3 i 素朴な返還が遺伝的多様なドナーの背景から生じる固有のゲノムとリネージュ プライミングの変動のためのいくつかの不安定な従来の hPSC ラインで効率的にあります。

したがって、LIF 3i 手法の有用性を広げるため開発された段階的最適化と記載はほぼ従来 hESC や無料の遺伝子によるラインと普遍的な素朴な復帰をフィーダーに培養可能します。このじっさい素朴な復帰メソッドが 2 つ追加小さな分子 (LIF-5i) プロテインキナーゼ (フォルスコリン) とソニック ・ ザ ・ ヘッジホッグ (sHH) (増強と LIF 3i カクテルを補足する従来の hPSC の一時的な初期文化ステップを採用していますpurmorphamine) 信号。LIF-5i で従来の hPSC の 1 つの初期の通路はバルク量でその後の安定した LIF 3i 復帰にそれらを適応させます。初期の LIF 5i 適応は、E8 または送り装置 (LIF-3 i だけでその後安定的、連続的な通路) の前に上に成長した従来の hPSC の初期の単一細胞のクローン増殖を大幅強化します。適応従来の hPSC ライン最初 LIF 5i で 1 つの通路に耐える以降一括クローン継 LIF 3i 条件で素朴な戻す細胞のまれな安定したコロニーのルーチンの使用の subcloning を選択しする必要がなくなります、抗アポトーシス分子または Rho 関連タンパク質キナーゼ (ロック) 阻害剤。

LIF 3i メソッドを正常に安定して拡大し、幅広いレパートリーを維持に雇われている > の 30 の独立した、遺伝的に多様な従来の hPSC ライン > 非酵素または酵素の解離のいずれを使用して 10-30 通路と染色体の誘導の証拠なしやエピゲノム異常、インプリント遺伝子の遺伝子異常を含みます。さらに、シーケンシャルの LIF 5i/LIF 3i 文化はリネージュ プライミング遺伝子発現を減少させることによって従来の hPSC ラインの幅広いレパートリーの機能的な多能性を向上させるだけの素朴な復帰方法これまで報告されているとその多能性分化能が大幅に向上。素朴な復帰メソッドの LIF 3i 消去固有インター ラインの血統で、プライミング、従来の hPSC ラインの分化の変動と再生医療と細胞療法のアプリケーションの偉大なユーティリティ。

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プロトコル

動物のケアのガイドラインと、ジョンズ ・ ホプキンズ大学院の医学大学のアニマル ・ ケアおよび使用委員会 (IACUC) によって承認されたプロトコルに従ってすべての動物の手続きを行った。

1. 準備マウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEF) の送り装置に依存した従来 (hESC 媒体/MEF) または素朴な元に戻したり (LIF 3i 媒体/MEF) hPSC 文化

  1. 購入または DR4 ハイブリッド E13.5 マウス胚次の公開プロトコル4x CF1 やから CF1 MEF の送り装置の社内の低通路供給を準備します。
    1. 低い通路 (p1 ・ p2) MEF 文化 (長期間保存) の前を凍結または4が前述した照射 (6 ヶ月) の後、液体窒素内のストア。
    2. 照射 (5,000 rad)、γ- または X-線-照射器を使用して p5 の下で展開された MEF を一括して-80 ° c 超低温冷凍庫で短期的なストレージ (6 ヶ月未満) の因数で 1.5 × 10 バイアルあたり6セルを準備します。
    3. 1.2 x 10 間板6 (非凍結した新鮮な照射) と 1.5 x 106 (照射凍結保存) 下記のようにフィーダー文化を準備するための 1 つの 6 ウェル糊プレートごと MEF。
  2. 6 ウェル滅菌培養処理板のゼラチン コーティングを準備するには、生物学的安全キャビネットの各ウェルに滅菌 0.1% ゼラチン溶液 1.5 mL を追加します。
  3. 少なくとも 1 h 37 ° C でゼラチン コーティング プレートを孵化させなさいまたは CO2研究室のインキュベーターで一晩します。
  4. 次の日、低通過 (例えばP2 に P4) DMSO, 凍結保存と照射を解凍 (5,000 rad) MEF の手順に従って以下に示します。
    注: 非照射 MEF はまた解凍、展開し、使用する前にすぐに照射します。
  5. 37 ° C の水浴中凍結 MEF 因数を配置します。融解時にエタノールでチューブを滅菌してすぐにバイオ セーフティ キャビネット (例えば転送 1 mL の DMSO MEF 因数 9 mL MEF 培地 15 ml の滅菌に内、DMSO 保護剤の検討の少なくとも 10 倍と MEF 培地 (表 1) を希釈円錐形)。
  6. 200 x g滅菌 15 mL の円錐管に 5 分で希薄化後の MEF のセルを遠心します。
  7. バイオ セーフティ キャビネット、における吸引無細胞上澄みを廃棄し、1-2 mL 新鮮な MEF 培地で細胞ペレットを再懸濁します。
  8. 優しくゼラチン液を捨て、上記のように糊 6 ウェル プレートの各ウェルに MEF 培地に再浮遊 MEF の 2 mL を追加します。カウント MEF のセルとプレート 1.2 x 106 (非凍結した新鮮な照射) または 1.5 x 106 (照射凍結保存) MEF 糊ワンプレート 6 ウェルあたり。
    メモ: CO2インキュベーターからバイオ セーフティ キャビネットに転送されるすべての細胞培養皿エタノール スプレー紙で軽く拭くことができるが必要があります散布すること直接の井戸にエタノール普及を避けるために 70% エタノール溶液で。
  9. 使用前に、添付ファイルを許可する (5% CO2、湿気のある大気) CO2研究所インキュベーターで一晩 37 ° C で MEF の版を孵化させなさい。

2. 一括簡単な LIF 5i 適応ステップ以降の素朴な復帰のため従来の hPSC 文化の安定化

  1. 最初 LIF 5i/LIF 3i 返還前 G バンディングによって正常核型を所持のためすべての従来の hPSC 行を検証します。
    メモ: 高一節従来の hPSC ラインの LIF 3i 復帰 (e.g、P > 40 – 50) これらの文化は既に否定的に影響を与えるの安定性が、効率的な、一括の LIF 3i 復帰準備万端、ゲノムの収差を抱く可能性があるので避けるべき。在来の hPSC ライン。
  2. 維持し、MEF 文化システム (セクション 1 で説明した) として、または (治験責任医師の好み) フィーダー フリー培養システムで検証済みの正常核型と従来の hPSC 文化を展開します。
    注: 両方フィーダー依存 hPSC/MEF 共培養系 (例えば悪名高く培 (表 1) 4-10 ng/mL bFGF) またはフィーダー フリー (e.g、E8 5または mTSER 6メディア (の製造元の指示に従って。ビトロネクチン コーティング プレート) メソッドは、LIF-5i/LIF/3 i MEF システム (図 1) を使用して一括素朴な復帰と互換性があります。非酵素的メソッドが復帰のためにそれらを準備する前に従来の hPSC の通過を優先されます。LIF-5i と LIF 3i メディア製剤には、抗生物質や抗真菌剤は含まれません。バイオ セーフティ キャビネット不稔やメンテナンスのための標準的な運用ルールは、任意の細菌や真菌の汚染を避けるために厳しく観察されるべき期待されます。
  3. MEF ベース文化システム、LIF 5i 適応従来 hPSC 文化の通過する前に少なくとも 1 日のセクション 1 で説明したように糊 6 ウェル プレートで MEF の送り装置を準備します。
  4. 従来の hPSC 文化は ~ 50% の confluency (すなわち、初期めっき後 3-5 日) に達して後に、置き換える標準 hESC 培 LIF 5i 媒体 (2 mL/ウェル;表 1)。
    注: は、バイオ セーフティ キャビネットのこれらの手順を実行します。
  5. 文化および CO2インキュベーター (5% CO2、湿気のある大気) LIF 5i で最大 2 日間従来 hPSC/MEF を維持します。毎日 LIF 5i 媒体を変更すると、それに続く通路の LIF 3 i で安定した復帰それらを適応させます。
  6. また、従来フィーダー フリーの文化 (例えばE8 で)、LIF 5i で文化 hPSC のみ次の朝を通過する前に一晩します。
    注: LIF 5i と LIF 3i の文化の両方を維持でき、大気 (21% O2) または生理学的な (5% O2) 酸素 CO2インキュベーター (5% CO2、湿気のある大気) のレベル。
  7. 通過、前に一度、PBS と LIF 5i 適応従来 hPSC を安全キャビネットに培養皿を配置、洗って各ウェルの細胞解離試薬 1 mL を追加します。CO2インキュベーターで 37 ° C で 5 分間インキュベートし、キャビネットのバイオに戻って単一細胞懸濁液にピペットで軽くカップ刻んだ。
    注: 非酵素的解離バッファーは、継の単一セルを準備するためまたは使用可能性があります。
  8. HESC 媒体 (少なくとも 2 倍希釈) 滅菌 15 mL コニカル チューブに細胞懸濁液を収集し、単一細胞懸濁液を取得するピペッティングにより細胞を優しくカップ刻んだ。
  9. 5 分間 300 × gで遠心分離、吸引/破棄、上澄みとバイオ セーフティ キャビネットにおける LIF 5i 媒体の 1-2 mL で細胞ペレットを再懸濁します。診断またはセルの自動カウンターを使用してセルをカウントします。
  10. PBS (6 ウェル プレートのウェルあたり 2 mL) を 2 回事前メッキ MEF、洗浄および PBS 洗浄 MEF プレートの 1 に (LIF 5i 2 mL 中) 10 の6セル × 1-2 を配布します。
  11. 調整し、それぞれ個々 の hPSC ライン非常に可変することができます効率を replating 素朴な復帰を初期めっき密度を最適化します。CO2インキュベーター (5% CO2、湿気のある大気) でプレートを配置します。
    注: 抗アポトーシス試薬のルーチン使用はこの方法ではほとんどの hPSC ラインのため推奨されません。LIF-5i システムは既にかなり従来の hPSC ラインの初期一括クローンの再めっき効率を向上します。ただし、ROCK 阻害剤の使い捨て (5-10 μ M Y-27632) ための傾向のいくつかの不安定な系統先読み hPSC ラインの最初の通路で従来の hPSC 文化の初期の LIF 5i クローン再めっき効率が向上さらに自発的な差別化。
  12. 場合に LIF 5i で合わせられる解離の従来の hPSC の 1 つの井戸を転送直接フィーダー無料文化 (例えばE8) から始まって 1 つは MEF メッキも (すなわち1:1 通路) を照射しました。
  13. 次の日、ゆっくり旋回非添付のすべてのセルを持ち上げ、培地を吸引するプレート (PBS 洗浄はオプション) LIF 5i 培地 2 mL に置き換えます。バイオ セーフティ キャビネットの 3-5 日のために毎日、またはセルが 60-70% 合流 (図 1) まででこの手順を実行します。CO2インキュベーター (5% CO2、湿気のある大気) でプレートを配置します。

3. 長期的な保守と LIF 3i 中 N hPSC の拡大

  1. 次の初期の LIF 5i 適応以降安定した LIF 3i 文化文化が 60-70% 合流 (図 1) になったら、バイオ セーフティ キャビネット、3-4 日おきの通路します。
    メモ: LIF 3i 文化必要厳密なメンテナンスと長期にわたる文化から高密度/細胞密度に到達する N hPSC 文化を許可する (e.g、> 4 日) 以降のクローンの再めっき効率が下がると自発性を促進します。。差別化。
  2. バイオ セーフティ キャビネット、における培養液を破棄し、それぞれを洗う優しく 2 mL の PBS の追加によって LIF 5i/LIF 3i 文化のことをよくします。PBS を破棄し、細胞剥離液の 1 mL を追加します。CO2インキュベーター (5% CO2、湿気のある大気) で 37 ° C で 5 分間インキュベートします。
  3. 細胞懸濁液を収集、悪名高く媒体を追加 (阻害剤や成長因子 (表 1); せず、少なくとも 2 倍希釈) すべて hPSC を回復し、単一細胞懸濁液を取得するピペッティングにより細胞を優しくカップ刻んだ。懸濁液を滅菌 15 mL の円錐管に転送します。
  4. 5 分の 300 g で遠心し、上清を吸引/破棄。再 LIF 3i 培地で細胞ペレットを中断します。診断またはセルの自動カウンターを使用してセルをカウントします。
  5. LIF 3i 文化の日常継用糊 6 ウェル プレートで照射された MEF に x 10 の5細胞/ウェル プレート 〜 2。初期の LIF 5i 適応文化最初の通過する前に、最初に高い密度 (4 × 105細胞/ウェル) プレート LIF-3 i/MEF に。
  6. 再プレートし、プレートの上に新鮮な PBS 洗浄照射 MEF フィーダー (上記の前日準備) LIF 3i 中 LIF 5i 適応 hPSC を配布します。毎日 LIF 3i 媒体を交換してください。
  7. 最小通路 N hPSC 4-7 連続一括は N hPSC の機能解析や凍結で使用する LIF 3i 媒体前の通路します。いずれかでのレコード数 N hPSC の通路の従来または LIF 3i メディア。
    メモ: 高い通路の LIF 3i 復帰 (例えば> p40) リネージュ プライミング、従来の hPSC ラインはお勧めしません。彼らがあります最低の可能な通路で従来の hPSC ラインを元に戻す努力をすべきであります。さらに、N hPSC のような文化は長期細胞培養淘汰による karyotypically 異常クローンを抱く可能性があるので、機能研究では、10 LIF 3i 通路より大きいを受けた LIF 3i 戻った hPSC の使用は推奨されません。もし低通路従来の hPSC ラインの新鮮な LIF 5i/LIF 3i 差し戻し機能研究われるべきである N-hPSC との株式 < LIF 3i 10 通路はご利用いただけません。

4. 凍結と LIF 3i 戻った N hPSC の解凍

  1. 機能研究や長期凍結保存法で使用する前に、上記のように LIF-3 i、少なくとも 5-7 通路を戻した N hPSC を展開します。従来条件と各凍結バイアルの LIF 3i 条件では、通路の数を記録します。
    注: 過剰 LIF 3i 戻った N hPSC 機能の試金で使用されていないは各通路に凍結が低い復帰後通路の凍結をすることができます(例えば.、< p3) 貧しい、または非常に可変解凍後回復効率があります。
  2. バイオ セーフティ キャビネット、培養培地を吸引、PBS (ウェルあたり 2 mL) のセルを洗浄、吸引 PBS および細胞剥離液 (ウェルあたり 1 mL) を使用して 1 つのセルに hPSC のコロニーを分離します。CO2インキュベーター (5% CO2、湿気のある大気) で 37 ° C で 5 分間プレートを配置します。(倍) LIF 3i 培地で細胞剥離液を希釈、滅菌 15 mL の円錐形に hPSC を収集、200 x gで 5 分で細胞を遠心分離機、LIF 3i 中 (まあ相当につき 1-2 mL) 細胞ペレットを再懸濁します。診断またはセルの自動カウンターを使用してセルの数をカウントします。
  3. LIF 3i 媒体 (200 x gで 5 分) の N hPSC を遠心し、少なくとも 1 x 10 の6セル/ml の密度で凍結溶液 (表 2)、安全キャビネットで細胞を再懸濁します。
  4. 長期貯蔵低温管にセルを転送し、, 凍結コンテナーに配置します。一晩-80 ° C のフリーザーで凍結するサンプルを許可します。
  5. 次の日は、長期保存用液体窒素冷凍庫に、クリオバイアルを転送します。
  6. 融解、〜 2 分定置滅菌バイアル (すなわち、エタノール スプレー) 37 ° C の水浴に凍結バイアルを配置、滅菌 15 mL の円錐形に hPSC を転送および、セル 10 倍で悪名高く培 (表 1) の 5 μ M をゆっくりと希釈Rho 準蛋白質キナーゼ (ロック) 阻害剤 Y-27632 無菌生物学的安全フード キャビネット内。
  7. 200 x gで 5 分間遠心します。バイオ セーフティ キャビネット、無細胞上澄みを廃棄し、LIF 3i 媒体 (1-2 mL) を 5 μ M ROCK 阻害剤 Y-27632 を添加した細胞ペレットを再懸濁します。
    注: Y-27632 の除外は、貧しい後融解回復効率 (図 2) になります。
  8. PBS 洗浄 MEF メッキ井戸に LIF-3 i/ROCK 阻害剤で再停止される解凍のセルを転送します。バイアルあたり 1 x 10 の6セルの密度で LIF 3i 文化を凍結します。各糊 6 ウェル プレートのウェル 1 個でフィーダーにこれらのバイアルを解凍します。
  9. 次の日は、Rho キナーゼ阻害剤なし正規 LIF 3i 媒体拡大を開始します。

5. フィーダー N hPSC サンプルのコレクションの除去

  1. LIF-3 i/MEF (または悪名高く/MEF 従来) からのサンプルの文化を準備する (すなわち、遺伝子発現のため (例えば、定量的 RT-PCR 法、マイクロ アレイ) 蛋白質 (例えば、西部のしみ) 解析を使い果たす LIF 3 i MEF の送り装置を使用してから文化や磁気活性化セルの並べ替え (MAC) 対策-トラ-1-81 抗体コーティング メーカーのプロトコルに従ってマイクロ ビーズです。
  2. また、下記のとおりフィーダー、文化を破壊する次の簡単なプレめっき方法を利用します。
  3. 無菌生物学的安全フード キャビネット、無細胞上澄みを廃棄、ウェルあたり 2 mL 滅菌 PBS でペレットを洗浄します。細胞剥離溶液 (1 mL/も) を用いた付着性の LIF-3 i/MEF 文化をデタッチします。CO2インキュベーター (5% CO2、湿気のある大気) で 5 分間インキュベートします。滅菌 15 mL の円錐形に hPSC を収集します。転送細胞滅菌 15 mL コニカル 200 x gで 5 分間遠心し、2 倍の hESC 中洗浄
  4. バイオ セーフティ キャビネットで再 LIF 3i 培地 2 mL に LIF-3 i/MEF 解離細胞の各ウェルを中断し、たて 0.1% ゼラチンでコーティングされている 6 ウェル プレートの新しい井戸に直接転送します。
  5. LIF-3 i/MEF hPSC セル (5% CO2、湿気のある大気) の CO2インキュベーターで 37 ° C で 1 時間インキュベートします。新しい円錐管にピペットと非付着性細胞を収集します。優しく各ウェルに hESC 培地 2 mL を追加し、残りの非付着性細胞を収集するために旋回します。
    注: 照射の MEF の大半にアタッチされます糊板 1 h の懸濁液、hPSC の大半を残してします。
  6. 300 x gで 5 分間 PBS で洗浄で細胞を遠心分離機し、組み合わせます。スナップ-凍結細胞ペレット液体窒素で遠心分離後またはまた再下流蛋白質または核酸の分析 (図 2B) と互換性のある lysing バッファー内のペレットを中断します。
  7. 一致する従来のプライム同質遺伝子 hPSC コントロールと LIF 3 i hPSC ラインの特徴づけを実行します。
    注: 間およびプライミングの文化の内で本質的な可変性のため関連するコントロールに文化または素朴な返還前一致する timepoint で用意しています。詳細なプロトコルおよび下流の蛍光イメージングのための材料流れ cytometry、西部にしみが付くこと、遺伝子発現 (RT-PCR の試金およびマイクロ アレイ)、メチル化研究 (ドットのしみ、CpG メチル化マイクロ アレイ)、OCT4 の近位および遠位エンハンサー優位性記者試金およびシグナル伝達阻害アッセイにより、3を他の場所で提供しています。

6. 素朴な復帰の記事: ゲノム整合性検証と LIF 3i 戻す機能アッセイに使用する前に N-hPSC の親印しの保持

  1. LIF-5i-3 i の LIF 返還を開始する前に (例えば、公開の方法7を使用してギムザ バンド染色による) 染色体の所持開始プライミング、従来の hPSC 文化を画面します。
    注: これはクローンの LIF 3i 条件で artefactual 選択的生存の優位性を運転するかもしれない異常なゲノム変化を抱くことができる従来の hPSC 集団を排除するためには。
  2. 最適な結果を得るには、たてに戻す従来の hPSC の機能研究での使用前に数週間 LIF 3i と世間知らずのような状態に文化や監督の差別化。
    注: ルーチンは次の素朴な復帰は推奨されません以上 10 の通路の LIF 3i 条件の 'メンテナンス' 文化を延長しました。従来の培養系を用いた、ルーチンの拡張と悪名高くとによる線のメンテナンスを実行必要があります (例えばE8、または MEF/hESC の bFGF の中)。
  3. 通常の保持は LIF 3i 復帰後 5-7 通路を karyotypes の後復帰した N hPSC ラインを評価 (e.g。 バンド ギムザ染色解析7、または選択の他のメソッドで、)。
  4. 通常親ゲノム インプリントの保持のためすべての復帰した N hPSC 行を選択の DNA メチル化解析による評価 (例えば、プロトコル用 LIF 3i 戻った N hPSC で親の出版社の CpG DNA マイクロ アレイ解析他3) 5-10 通路 LIF 3i 復帰の後。

7 LIF 3i 戻った N hPSC を用いた定量的分化アッセイの記事素朴な復帰: 実験的設計ガイドライン

  1. 直接確立された分化プロトコル追加細胞培養操作なしに LIF 3 i N-hPSC を利用します。
    注: 再プライミング (すなわち、 N hPSC を従来のプライミング条件は分化アッセイでの使用前に変換する) LIF 3i メソッドを使用する必要はないとお勧めできません。
  2. アッセイの影響の制御、インター ラインの個々 の hPSC ラインの機能テストの可変性、少なくとも 3 つの hPSC を持つ独立した微分のプロトコルを採用することにより特定の系統分化能のクロス検証由来は独立した遺伝的背景 (すなわち、複数のドナー由来による、hESC)。
  3. 機能的な比較兄弟文化、等価通路番号、従来系列プライミングと並行して同じ (同質) hPSC ラインから、LIF 3i 戻す hPSC 文化を設定します。それぞれのメディアにプライム/素朴な兄弟同質遺伝子 hPSC 文化を維持 (e.g。、E8対。LIF-3i) と同時に区別 (図 4) 実験的バイアスを排除するために同じ微分のプロトコルおよび材料を使用しています。
  4. 同質の素朴な hPSC 比較対プライミング、調整し、それぞれの個々 の分化の試金のための初期めっき密度を最適化します。
    注: 神経前駆、決定的な内胚葉と LIF 3i 戻った N hPSC の血液内皮分化のための詳しいプロトコルは、他の場所で3で提供されます。LIF 3i 戻った N hPSC 従来の hPSC よりも分化アッセイにより堅牢な増殖と分化の能力があります。N hPSC は通常従来の hPSC よりも低い初期めっき濃度を必要し、の対応は次の酵素クローン生き残りを図る抗アポトーシス試薬の使用とは異なり、従来のプライム hPSC 不要分化アッセイで消化。

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結果

このプロトコルには、両方のフィーダーに依存し、フィーダー独立系統プライミング従来 hPSC 文化 (図 1) で LIF 3i と効率的な世間知らずのような返還が最適化されます。詳細なプロトコルに記載、アウトライン LIF 3i いずれかのフィーダーに依存または従来フィーダー無料 hPSC 条件 (例えばE8 中) から始まって順次適応。

代表結果いくつかの従来の hESC の LIF 3i の復帰のため、transgene 無料による線が図 1-3に表示されます。これらの典型的な結果は市販 hESC ライン H9、検証することができます。 または市販の transgene 無料コードの血由来 episomal によるライン (6.2) ・ ザンビディス研究室8,

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ディスカッション

LIF 3 i システムは、ひと多能性幹細胞に古典的なマウス 2i 素朴な復帰カクテル1の修正版を適用されます。(これは 2 i だけで展開できない) hPSC の自己更新タンキラーゼ阻害剤 XAV939 とこのカクテルを補うことで LIF 2i で安定させます。LIF 3i 文化では、バルクと人間着床前胚盤葉上層3のような多能性の状態に従来の hPSC の効率的な帰属をことができます。HPSC の XAV939 の作用機序が可能性があります複雑な彼らは可能性が最低でも、重要な安定化と WNT シグナル伝達経路3を介して hPSC の自己更新の増強に含める 2i 相乗効果。

従来の hPSC 文化は通常高い変数系列プライミング遺伝子発現と矛盾または減少された機能性多能性2 可能性があります...

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開示事項

生命技術とジョンズ ・ ホプキンス大学 (JHU) との間のライセンス契約の下で博士・ ザンビディス幹細胞のライセンスのための大学によって受信料の共有する権利があります。この整理の用語は、その利益相反ポリシーに従ってビジネスキャリーによって管理されます。これは、共有データと材料にジャーナル ポリシーへの著者の付着は変わりません。

謝辞

この作品は、NIH/ネイ (R01EY023962)、NIH/NICHD (R01HD082098)、RPB スタイン ・ イノベーション ・ アワードのメリーランド州の幹細胞研究基金 (2014-MSCRFE-0742 2018-MSCRFV-4048)、ノボ ノルディスク科学フォーラム賞、モーズリー財団からの助成金によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugatedBD Biosciences561716use 5µL per assay (FACS)
anti- TFCP2L1 antibodySigma AldrichHPA029708use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-beta-Actin antibodyAbcamab6276use at 1:5000 (Western blot)
anti-CD146 antibody,  PE conjugated BD Biosciences550315use 5µL per assay (FACS)
anti-CD31 antibody, APC conjugatedeBioscience17-0319-42use 2µL per assay (FACS)
anti-CD31 microbead kitMiltenyi Biotec130-091-935
anti-NANOG antibodyAbcamab109250use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-NR5A2 antibodySigma AldrichHPA005455use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibodyCell Signaling4695use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibodyCell Signaling4370use at 1:1000 (Western blot)
anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibodyCell Signaling9145use at 1:1000 (Western blot)
anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylatedAgilentE0432use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)
anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated R&D SystemFAB1435Ause 5µL per assay (FACS)
anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugatedR&D SystemNLLC1435Guse at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-STAT3 antibodyCell Signaling9139use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-STELLA/DPPA3 antibodyMilliporeMAB4388use at a 1:50 dilution (immunostainings)
anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated R&D SystemNLLC4770Ruse at  a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugatedStemgent09-0068use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugatedStemgent09-0069use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA1-60 antibody, PE conjugatedBD Biosciences560193use 10µL per assay (FACS)
anti-TRA1-81 antibody, PE conjugatedBD Biosciences560161use 10µL per assay (FACS)
APEL2-LiStemCell Technologies5271
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichA3311
CellAdhere dilution bufferStemCell Technologies7183dilutent for Vitronectin XF™ matrix
CF1 mouseCharles river023
CHIR99021R&D SystemL5283reconstitute at 100mM in DMSO
confocal microscope systemZeissLSM 510
cord blood CD34+ derived iPSC lineThermo Fisher ScientificA18945also referred as 6.2 line
Corning Costar tissue culture-treated 6-well platesCorning3506
Countess  cell counting chamber slideThermo Fisher ScientificC10228
Countess automated cell counterThermo Fisher ScientificAMQAX1000
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientific11995-065
DMEM-F12Thermo Fisher Scientific11330-032
DMSO (dimethyl sulfoxide)Sigma AldrichD2650
DR4 mouseThe Jackson Laboratory3208
Essential 8 (E8) mediumStemCell Technologies5940
Fetal bovin serum (FBS)Thermo Fisher ScientificSH30071.03
ForskolinStemgent04-0025reconstitute at 100mM in DMSO
Gelatin (porcine)Sigma AldrichG1890-100Gresuspend in water and sterilize with an autoclave
KnockOut Serum ReplacementThermo Fisher Scientific10828-028
L-Glutamine (100X)Thermo Fisher Scientific25030-081
MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X)Thermo Fisher Scientific11140-050
mTeSR1 mediumStemCell Technologies85850
Nalgene cryogenic vialsThermo Fisher Scientific5000-0020
Nunc Lab-Tek II Chamber Slide SystemFisher Scientific154534
Paraformaldehyde (PFA) solution, 4% in PBSUSB Corporation 19943
PD0325901Sigma AldrichPZ0162reconstitute at 100mM in DMSO
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
Phosphate buffered saline (PBS)Biological Industries02-023-1A
PurmorphamineStemgent04-0009reconstitute at 10mM in DMSO
recombinant human Activin APeprotechAF-120-14E
recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4Peprotech120-05ETresupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
recombinant human FGF-basic (bFGF)Peprotech1

参考文献

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