Method Article

した Qdot 標識タンパク質と Site-specifically 変更された λ DNA の単一分子レベルでの相互作用の可視化

DOI:

10.3791/57967

⸱

July 17th, 2018

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Microbial Resources, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2Savaid Medical School, University of Chinese Academy of Sciences

In This Article

Summary

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ここでは、site-specifically 変更された λ DNA 基板とタンパク質をラベル量子ドットを用いた全反射蛍光顕微鏡 (TIRFM) による DNA 蛋白質の相互作用を研究するためのプロトコルを提案する.

Abstract

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蛍光顕微鏡は、単一分子レベルでの複雑な生物学的過程のメカニズムを解剖に多大な貢献をしました。単一分子アッセイ DNA 蛋白質の相互作用を研究するため、検討のための 2 つの重要な要因がある: 十分な長さの簡単な観察と適切な蛍光プローブを用いたタンパク質を標識 DNA 基板。48.5 kb λ DNA は DNA の基質の良い候補です。量子ドット (Qdots)、蛍光プローブのクラスとして長年観察 (時間分) と高品質画像の取得を許可します。Site-specifically 変更された λ DNA を準備して、ラベリング、ストレプトアビジン コーティング Qdots と標的タンパク質など分子レベルで DNA 蛋白質の相互作用を研究するためのプロトコルを提案します。コンセプトの証明、我々 興味の蛋白質として出芽酵母におけるオーク (原点認識複合体) を選択し、観察を使用して、アルス (自律的複製シーケンス) との相互作用を視覚化します。他の蛍光プローブと比較して、Qdots は退色、に対して高い安定性のための単一分子の研究で明白な利点を持っているが、定量的アッセイへの応用をこのプロパティに制限に注意してください。

Introduction

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タンパク質と DNA の相互作用は、DNA 複製、DNA 修復および転写など、多くの複雑な生物学的プロセスに不可欠です。従来のアプローチは、これらのプロセスのプロパティに光を当てるが、多くの主なメカニズムはまだ明らかではありません。最近では、急速に成長の単一分子技術メカニズムのいくつかは対処1,2,3をされています。

主にリアルタイムで蛋白質 DNA 相互作用の視覚化の単一分子蛍光顕微鏡の応用は、蛍光検出蛍光プローブの開発に依存します。単一分子研究のため適切な蛍光プローブ蛍光検出システム、ほとんど商業的に利用可能なので興味の蛋白質にラベルすることが重要です。

蛍光タンパク質は、分子生物学の一般的使用されます。ただし、低蛍光輝度とフォトブリーチングに対する安定性は、多くの単一分子アッセイへの応用を制限します。量子ドット (Qdots) は、小さな発光ナノ粒子4。彼らのユニークな光学特性のため Qdots は 10-20 倍明るく、数千倍より安定したよりも広く使われている有機染料5。さらに、Qdots は大きなストークス シフト (励起と放射のピ....

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Protocol

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1. λ ARS317 DNA 基板の作製

  1. DNA 基板構成と包装形態
    1. Xhoを使用してネイティブ λ DNA を消化私酵素;新進の genomic DNA から ARS317 酵母 20 を含むプライマーを用いて 543 bp DNA フラグメント ベアリングを増幅する相同 bp 系列の上流と下流にXho私ラムダ DNA 上の酵素のサイト。追加 100 ng Xhoの λ DNA と 10 を消化され ng の DNA のフラグメントの相同組換え反応システムの 10 μ L と 30 分の 37 ° C で反応を孵化させなさい。
    2. 再結合 λ DNA をパッケージ化、遺伝子組み替え品にラムダ包装エキスを 25 μ l 添加し、90 分の 30 ° C で反応を孵化させなさい。反応管にラムダ包装抽出物の追加 25 μ L を追加します。90 分の 30 ° C で反応をインキュベートし続けます。
    3. 滅菌希釈バッファー (10 mM トリス-HCl (pH 8.3)、100 mM の NaCl、10 mM MgCl2) 500 μ L を反応システムに追加、チューブを数回上下に回して軽く混ぜます。クロロホルムを 25 μ l 添加、穏やかに混合し、4 ° C で保存
    4. パッケージ化されたバクテリオファージの 100 μ L と細菌 LE392MP の 100 μ ....

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Results

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初めてした Qdot というラベルの付いたオークと、アルスの相互作用を視覚化するには、λ ARS317 DNA 基板を構築します。ARS317 を含んでいる DNA のフラグメントは統合されたXhoに私は (図 1 a) の相同組み換えによるネイティブ λ DNA の (33.5 kb) をサイトします。遺伝子組み替え品はエキスを使用してパッケージ化され、パッケージ化されたバクテリオファージの粒子は LB プレート (図 1 b) で培養しました。肯定的な phage プラークは PCR によって選別され、(図 1) の配列によって確認します。Λ ARS317 DNA は液体の溶解液 (図 1) から精製した.

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Discussion

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ここでは、した Qdot 標識タンパク質およびフロー セル内の観察を使用して site-specifically 変更された λ DNA 間の相互作用を観察するためのプロトコルを提案する.必要な手順には DNA 基板、ビオチン化 DNA、coverslip 洗浄し高機能化、フロー セル準備、および単一分子イメージング サイト固有の変更が含まれます。注意すべき 2 つの重要なポイントがあります。まず、すべての λ DNA と手順は、例えば、任意の可能な被害を減らすため優しく操作する必要があります繰り返し上下にピペッティングにより混合を避けること。第二に、非常に、coverslip がそのバック グラウンド ノイズを最小限に抑えるため十分にきれいであることを確認することが重要です。Coverslip のクリーニングと機能化プロセス中に水超純水レベルに到達する必要があり、空気であるべきほこり無料します。Coverslip の高機能化・ クリーン ベンチのフロー セル ・ アセンブリを行うことをお勧めします。

蛋白質 DNA 相互作用を研究するため単一分子アッセイ、λ D.......

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Disclosures

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著者が明らかに何もありません。

Acknowledgements

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我々 は博士・ ハサン ・ Yardimci に感謝し、種類のフランシスの Crick 研究所の Dr.Sevim Yardimci は、単一分子の実験博士ダニエル Duzdevich、コロンビア大学の博士エリック ・ グリーンの研究室から北京大学の博士タマ太陽との Chunlai ドクター有用な議論の清華大学。本研究は、国家自然科学基金、中国の 31371264、31401059、CA 学際的革新チームと、ニュートン高度な交わり (NA140085) 英国王立協会からによって支えられました。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ラムダDNAニューイングランドバイオラボN3011ストア25 μLアリコートは-20°Cです。
XhoI酵素サーモフィッシャーサイエンティフィックFD0694
クイックフュージョンクローニングキットBiotoolB22611
MaxPlax Lambda
包装 抽出物		EpicentreMP5110細菌株 LE392MP
は、このパッケージに含まれています。
MgSO4Sinopharm化学試薬Co.、株式会社10013092どのブランドでも受け入れられます。
TrisAmresco0497-5KG
NaCl北京化学作品N/Aどのブランドでもかまいません。
MgCl2Sinopharm化学試薬Co.、株式会社10012818
クロロホルム北京化学作品N/A任意のブランドが受け入れられます。
NZアミンアムレスコJ853-250G
カサミノ酸Sigma-Aldrich22090-500G
PEG8000 BeyotimeST483
磁気攪拌装置IKAKMO2 塩基性
15 mL エッペンドルフ チューブエッペンドルフ3012215115 mL 滅菌、バルク、500pcs
RnaseSIGMAR4875-100MG
DnaseSIGMAD5319-500UG
Proteinase KAmresco0706-100MG
ビオチン化プライマーサーモフィッシャーサイエンティフィックN/A
T4 DNAリガーゼ、T4 DNAリガーゼ、反応バッファー (10x)ニューイングランドバイオラボM0202
カバースリップサーモフィッシャーサイエンティフィック22266882
エタノールSinopharm化学試薬Co.、Ltd10009259
水酸化カリウム(KOH)Sigma-Aldrich306568-100G
アセトンサーモフィッシャーサイエンティフィックA949-4
H2SO4Sinopharm化学試薬Co.、Ltd80120891硫酸
H2O2Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10011218 30% 過酸化水素
メタノールSigma-Aldrich322415-2L
酢酸Sigma-AldrichV900798
APTESSigma-AldrichA3648
mPEG
(メトキシポリエチレングリコール)		LysanmPEG-SVA-5000
ビオチン-PEG
(ビオチン-ポリエチレングリコール)		LysanBiotin-PEG-SVA-5000
NaHCO3Sigma-Aldrich31437-500G
真空乾燥器天津分公社 Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd.IPC250-1
真空シーラーマジックシールWP300
ダイヤモンドチップガラススクライブ電子顕微鏡 SCIENCES70036
ガラススライドセイル ブランド7101
インレットチューブSCI(サイエンティフィックコモディティーズ)BB31695-PE/2内径0.38mm、外径1.09mm。
アウトレットチューブSCI(サイエンティフィック・コモディティーズ社)BB31695-PE/4内径0.76mm、外径1.22mm。
両面テープSigma-AldrichGBL620001-1EA
エポキシLEAFTOP90055分 エポキシ
ストレプトアビジンSigma-AldrichS4762
蛍光顕微鏡オリンパスIX71
注入/回収
プログラム可能なポンプ		ハーバード大学装置70-4504
532 nm レーザーCoherentSapphire-532-50
640 nm レーザーCoherentOBIS-640-100
EMCCD カメラAndorDU-897E-CS0-BV
W-View Gemini Imaging
splitting optics		浜松ホトニクスA12801-01
TIRF照明システムオリンパスIX2-RFAEVA2
60回;TIRF対物リンパスAPON60XOTIRF
クアッドエッジレーザーダイクロイック
ビームスプリッターSemrock		Di01-R405 / 488 /
532 / 635-25x36
ワッドバンドバンドパスフィルターSemrockFF01-446 / 510 /
581 / 703-25
クロイックビームスプリッターSemrockFF649-Di01-25x36
蛍光フィルタークロマ技術CorpET585/65m
蛍光フィルターChroma Technology CorpET665lp
FocalCheck 蛍光、顕微鏡テストスライド #1Thermo Fisher ScientificF36909
SYTOX OrangeThermo Fisher ScientificS11368
Qdot705 Streptavidin ConjugateThermo Fisher ScientificQ10163MPStore4時とordmで。C、凍結しないでください。
ATPAmresco0220-25GddH2Oを使用して200 mM ATP溶液を調製し、pHを7.0に調整し、10 μLアリコートは-20°Cです。
DTTアムレスコM109-5GddH2Oを使用して1M溶液を準備し、10μ-20°Cのアリコート
レンズオクダイ。

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fu, Y. V., et al. Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase. Cell. 146 (6), 930-940 (2011).
  2. Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. C....

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Single Molecule ImagingDNA Protein InteractionQuantum Dot LabelingLambda DNA SubstrateSite Specific ModificationTIRF MicroscopyFlow Cell AssemblyStreptavidin Coated QdotsORC Qdot705 LabelingSYTOX Orange Staining

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