方法論記事

隔離の乳酸脱水素酵素試金-哺乳類細胞における一括 Autophagic 隔離活動を決定するシンプルで信頼性の高い方法

DOI：

10.3791/57971

⸱

2018年7月27日

 ,  , 
1The Autophagy Team, Centre for Molecular Medicine Norway (NCMM), Nordic EMBL Partnership, University of Oslo

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここで哺乳類細胞における一括 autophagic 貯留活性を測定する簡単なよく検証されたプロトコルが記述されています。メソッドは、sedimentable セル画総細胞 LDH レベルと比較して乳酸脱水素酵素 (LDH) の割合を定量化に基づいています。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

一括オートファジーは、ダブル/多 membrane 構造オートファゴソームと呼ばれる細胞質の大部分の隔離によって特徴付けられます。ここでこのプロセスを監視する単純なプロトコルを説明します。また、典型的な結果と各種培養細胞におけるオートファジー誘導下法の実験的検証を提供します。一括オートファジーの中にオートファゴソームは、細胞質、およびそれによりまた他のオートファジーの貨物と一緒に、可溶性細胞質蛋白質を隔離します。LDH は、安定と高い非選択的にオートファゴソームに隔離されます豊富な水溶性のゾル性細胞質酵素です。LDH 貯留量したがって一括 autophagic 貯留量が反映されます。Sedimentable 中の酵素活性の測定に続いて、ゾル性細胞質の LDH から sedimentable から効果的に分離分別の electrodisruption ベース プロトコルを用いて効率的かつ正確にセルで LDH 隔離の決定、全細胞サンプル対分数。オートファジーの隔離は、sedimentable その扱われた細胞から未処理細胞の LDH の割合を減算して決定されます。LDH 隔離アッセイの利点は、どちらかが隔離プローブまたは半定量的なプロテアーゼの異所性発現を含む他の方法ではなく、内因性の貨物のオートファジーの隔離の定量的測定を与えることオートファジーのマーカーや受容体の解析を保護。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

オートファジー (「自己を食べる」のギリシャ語) は、細胞内物質の液胞/ライソゾームの分解の進化保存されたプロセスです。酵母とヒトのオートファジーのために重要であるオートファジー関連 (「ATG」) 遺伝子の発見時に実現オートファジーは、人間の健康と病気 (2016年ノーベル医学・生理学によって認められる重要な役割を果たしています。大隅良典)、オートファジーは細胞生物学1,2で最も激しく学びのプロセスの 1 つになるすぐに。

Macroautophagy (以下「オートファジー」といいます) 延長で特徴づけられると効果的に隔離密閉、ダブル membrane の構造 (「オートファゴソーム」) に細胞内膜 cisternae ("phagophores") の折りたたみ、細胞質の残りの部分からそのただ中の材料。オートファゴソーム リソソームとの融合、時に内側 autophagosomal 膜と隔離の貨物は劣化や再生します。オートファゴソームは、ランダムな (非選択的オートファジー) と選択 (選択的オートファジー) マナーの両方で細胞質材料を隔離することができます。最も可能性の高い一括オートファジーは、非選択的、選択的オートファジーのミックスを表します。

1960 年代および 70 年代 (「形態」の時代オートファジー研究)、オートファジー隔離主に微細構造分析によって評価しました。1980 年代と 1990 年代 (「生化学的時代」) あたり Seglen と同僚の初め-初代ラット肝細胞でオートファジーを勉強した-定量的 autophagic 隔離アクティビティ3を測定する最初方法を開発しました。これらの試金を使用して、Seglen 定義しオートファジー ・ リソソーム経路4、5の異なるステップを特徴と、発見し amphisome6 (エンドソーム オートファゴソーム融合の製品) を鋳造し、初めてオートファジー規制7蛋白質のリン酸化の役割を説明します。ただし、1990 年代に ATGs (「分子時代」) の発見と哺乳類 ATG8 蛋白質の最初の特徴の後微小管結合蛋白質 1A 1B 光鎖 3 (LC3) の 2000年8、ATG タンパク質ためのマーカーとしての使用、オートファジーの古いより困難な生化学的置き去りになったプロセスはすぐに人気を得た。実際には、過去 18 年間、西部のしみ、LC3 の蛍光顕微鏡による解析で最も人気となっている (と多くの場合、唯一) 哺乳類細胞におけるオートファジーの勉強の手段。利点は、これらの方法を実施したことが比較的容易です。欠点は、1 つは実際のオートファジーの貨物ではなくカート コンポーネント (LC3) を勉強しています。これは、状態や隔離対経路を介して LC3 のフラックスと貨物のフラックスとの関係は非常に不透明なためより深刻な不利な点です。実際には、我々 はバルク貨物フラックスを条件下で高いレベルで保つことが、示されているセル9共役 LC3 の存在にもかかわらず、LC3 フラックスがないです。さらに、我々 はバルク オートファジー効率的 LC3 枯渇による影響はありません、したがって可能性が高い LC3 独立9を示した。この発見は後 LC3 ノックアウト研究10、11、パーキン依存 mitophagy (ミトコンドリアの選択的オートファジー) は LC310,11 の独立をも示すによって確認されています.

要約すると、明確な貨物に基づく試金 autophagic 活動を監視するために必要です。最適適用、明確、かつ簡単に実行、このような試金を広くする必要があります。最後の数年間で121980 年代にあたり Seglen によって開発された、sedimentable、autophagic 液胞を含む細胞へのゾル性細胞質の LDH の転送を測定に基づく LDH の隔離の試金に特に興味を採用して分数。LDH は、phagophores enwrap 細胞質の貨物と共同隔離が容易に安定した、水溶性ゾル性細胞質蛋白質であります。したがって、LDH の隔離です autophagic 隔離の一般的なメジャーです。オートファジー ・ リソソーム経路12LDH は低下のみ。したがって、ライソゾームの分解阻害剤バフィロマイシン A1などの存在下で (Baf)13日実験的治療の効果の直接 autophagic 隔離活動に変更を反映します。分解阻害剤がない場合は、LDH の隔離と劣化の変化の正味の効果を測定できます。

LDH はすべての細胞型で高度と普遍的表現され酵素アッセイ14,15によって LDH レベル、正確に定量化することができますので、LDH 隔離アッセイは広く適用可能で。しかし、元プロトコル12 -初代ラット肝細胞の確立、かなり時間がかかるは、開始材料としてカスタムメイド放電コンデンサーを大量を必要があります。段階的に徐々 に簡単で汎用性の高い方法にアッセイを変換している私たち。まず、元のプロトコルは哺乳類の細胞ライン16で使用用に脚色されました。第二に、メソッドは、大幅に縮小した3,9だった。第三に、プロトコルのいくつかの手順が排除された、手順17を骨の折れる密度クッションなど。これは同時に、さらにダウンスケー リング サンプル (すなわちより少ない約 15-fold を開始あたり 12 ウェル プレートから単一の井戸を使用してサンプル16あたり 10 cm の板を使用しての最初の出発点から、メソッドの有効になっています。素材)17。第四に、カスタムメイド放電コンデンサー17を置き換えることができます商業エレクトロポレーション機器を識別されます。

ここで LDH 隔離アッセイは、以前に公開された17と比較してメソッドのいくつかのさらなる簡略化が含まれています私たちの最新のプロトコルが表示されます。さらに、異なる種類の細胞の数で得られた典型的な結果のセットを表示すると、重要なは、薬理学的として遺伝子ノックダウンとノックアウト アプローチを用いた手法の実験的検証の複数行が提供されます。全体のプロトコルの全体フロー方式、図 1を参照してください。

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プロトコル

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1. 細胞と治療

  1. 5% CO2問題のセル型の最寄りの培養液を使用して、37 ° c で加湿のインキュベーターで 75 cm2培養フラスコに細胞を付着。合流の近くの細胞層に達するまで成長する細胞を許可します。
    注: を使用して、10% 牛胎児血清 (FBS) LNCaP HEK293、マウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEFs) BJ の RPMI 1640 培 MCF-7、および網膜色素上皮 - 細胞。
    1. 3 mL 37 ° C リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、pH 7.4 でセルを洗浄します。PBS に置き換えて 3 mL 0.25% (w/v) トリプシン-エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、セルをデタッチ (2-5 分) まで、37 ° C で 5% CO2と加湿のインキュベーターでフラスコを孵化させなさい。
    2. 10% を含む 7 mL 培養液中の剥離細胞を再懸濁します FBS。10 μ L で 10 μ L 細胞懸濁液因数をミックス 0.4 %0.5-20 μ L ピペット チップを用いた微量遠心チューブにトリパン ブルー。カウント チェンバー スライドをすぐに埋めるため同じピペット チップを使用し、自動化された細胞カウンターでセルをカウントします。









  1. figure-protocol-1

  2. figure-protocol-2

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結果

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プロトコルを使用して記載、LAPC4、DU145、Huh7、PNT2A、hela 細胞、VCaP、H3122、Hec1A を含む、別の哺乳類の細胞ライン数の一括 autophagic 隔離活動 MCF 7 T47D、U2OS、PC3、G361、マウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEFs)、網膜色素上皮-1LNCaP、BJ、HEK293 細胞を測定しました。隔離された (完全な栄養豊富な媒体) の基底条件下で査定や細胞における血清およびアミノ酸 ( bona fideオートファジー誘導条件22) 飢えた鋭く。その結果, ldh 飢餓条件下での隔離は広く異なる細胞株、LAPC4, DU145, Huh7 かろうじて検出可能レベルに至るによって異なります、PNT2 細胞 LNCaP 細胞 (図 2 ~1.6%/h (データは示されていない) A)。飢えた初代ラット肝細胞の観察率、上記細胞と通常 2.5–4%/h

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ディスカッション

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要約するは、ここで説明されているプロトコルは哺乳類セルの一括 autophagic 隔離アクティビティを監視する信頼性が高く、広く適用できるメソッドを表します。元法12,16と比較して、いくつかの不要なステップを削除、残りの手順のいくつかを簡略化して実質的なダウンスケー リング手法を導入します。結果として、プロトコルが大幅に効率に関連してコスト- と時間- と同じサンプル量は、元のプロトコルと比較すると半分以下の時間で処理できるようです。24 サンプル手順 2-3 (1 日目) が必要になります準備プラスの約 1/2 h 効率的な作業の 3 h ~ 2 h でステップ 4 (2 日目) を実行できるに対し (時間のことを考えると必要なすべてのバッファーはあらかじめ準備された見積もり)。1 通常 baf は 3-4 時間培養 autolysosomal LDH 劣化の他の阻害剤など細胞治療で前の日に試金から 2 日連続でアッセイを分割すると便利です。しかし、それも、同じ日に全体の分析を実行する可能です。その場合は、それはス...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は利害の対立があります。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この作品は、ノルウェーの研究評議会、オスロ大学、Anders Jahre Foundation、ナンセン財団、ヘンリック ・ ホーマンのメモリで従来によって支えられた財政的に。我々 は、ATG5 の水島昇先生に感謝 + MEFs、ATG5/MEFs、ATG7 の小松雅明博士の + + + MEFs と atg 7生/MEFs、審良静男教授、ATG9A の + + MEFs と ATG9A/MEFs。建設的な方法論的議論のためのテクニカル サポートは、o. Seglen あたり博士フランク Sætre をありがちましょう。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.5 mLおよび2 mLの微量遠心チューブ Eppendorf211-2130 および 211-2120
12 ウェルプレート Falcon353043
Accumax  細胞剥離ソリューションInnovative Cell TechnologiesA7089アリコートを-20°Cに保ちます。Cは何年もの間、そして数ヶ月間冷蔵庫で
バフィロマイシンA1ツォBML-CM110-0100DMSO
BJ細胞ATCCCRL-2522継代で使用します <30
ウシ血清アルブミン (BSA)VWR422361V
バーカーカウンティングチャンバーフィッシャーサイエンティフィック139-658585
カウンテスセルカウンティングチャンバースライドサーモフィッシャーサイエントフィックC10228
カウンテスII 自動セルカウンターサーモフィッシャーサイエントフィックAMQAX1000
バーカーカウンティングチャンバー用カバーガラスフィッシャーサイエンティフィック139-658586
クライテリオントリス-HClゲル、4–20%、26ウェル、15µL、13.3 cm x 8.7 cm(W x L) Bio-Rad3450034
DTTSigma-AldrichD0632
Earle's balanced salt solution (EBSS)Gibco24010-043conatains 0.1% glucose
EDTASigma-AldrichE7889
エレクトロポレーションキュベット (4 mm)Bio-Rad1652088
Exponential Decay Wave ElectroporatorBTX Harvard装置 EMC 630
ウシ胎児血清 (FBS)SigmaF7524RPMI 1640 中HEK293細胞中の10%最終濃度
ATCCCRL-1573
イミダゾールSigma-Aldrich56750オートクレーブ 65 mM 溶液を冷蔵庫で数ヶ月間保管
インキュベーター;自動流れ IR 直接加熱 CO2 インキュベーターNuAireNU-5510E
リポフェクタミン RNAiMAX トランスフェクション試薬ThermoFisher13778150
LNCaP 細胞ATCCCRL-1740継代での使用 <30
3-メチルアデニン (3MA)Sigma-AldrichM9281-20°CでRPMI中の100 mMをストックします。ヒートストックを65°CにCを10分間、最終濃度10mMで使用
冷蔵マイクロ遠心機ベックマン・コールター ライフサイエンス368831
ソフトモード機能付きリフチルドミニージュエッペンドルフ エッペンドルフ5417R 
MRT67307塩酸塩(ULKi)Sigma-AldrichSML0702ULKキナーゼ活性を阻害します。DMSOに溶解します。
MaxMat Multianalyzer InstrumentErba DiagnosticsPL-II
MCF7 cellsATCCHTB-22
NADHMerck-Millipore1.24644.001
NycodenzAxis-Shield1002424
Opti-MEM Reduced Serum MediumThermoFisher31985062
Phosphate-buffered saline (PBS)Gibco20012-019
ペットチップ3(0.5-20&マイクロ;L)VWR732-2223Thermo Fischer ART バリアチップ
ピペットチップ (1-200 µL)VWR732-2207 サーモフィッシャーARTバリアチップ
ピペットチップ(100-1,000 & マイクロ;L)VWR732-2355 サーモフィッシャーARTバリアチップ
ピペットサーモフィッシャー4701070フィンピペット F2 GLP キット
ポリ-D-リジンSigma-AldrichP6407-10X5MG滅菌済みのH2Oで1 mg/mLのストック溶液を作ります。この溶液は-20°Cで安定しています。Cを少なくとも1年間。
ピルビン酸メルク・ミリポア1066190050
RPE-1細胞(hTERT RPE-1)ATCCCRL-4000
RPMI 1640Gibco21875-037
SAR-405ApexBio A8883ホスホイノシチド 3-キナーゼ クラス III (PIK3C3) を阻害します。DMSOに溶解します。
サイレンサー セレクト ネガティブ コントロール #1 (siCtrl)サーモフィッシャー/アンビオン4390843
サイレンサー セレクト ATG9 ターゲット siRNA (siATG9A)サーモフィッシャー/アンビオンs35504
サイレンサー セレクト FIP200 ターゲット siRNA (siFIP200)サーモフィッシャー/アンビオンs18995
サイレンサー セレクト ULK1 ターゲット siRNA (siULK1)サーモフィッシャー/アンビオンs15964
Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2)ThermoFisher/Ambions18705
Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP)ThermoFisher/Ambions22362
Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1)ThermoFisher/Ambions24333
Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2)ThermoFisher/Ambions22387
ナトリウム一塩基性二水和物(NaH2PO4 • 2H2O) メルク・ミリポア1.06580.1000
リン酸ナトリウム二塩基性二水和物 (Na2HPO4 • 2H2O ) Prolabo28014.291
糖VWR443816T10%最終濃度の水; 0.45 & microを通してろ過;mフィルターをろ過し、数ヶ月間冷蔵庫で保つ
ThapsigarginSigma-AldrichT9033は、SERCA ERのCa2+ポンプを阻害します。DMSOに溶解します。
トリトンX-405 Sigma-AldrichX4051% 最終
トリパン ブルー染色 0.4%分子プローブT10282
トリプシン-EDTA (0.25% w/v トリプシン)Gibco25200-056
Tween-20Sigma-AldrichP22870.01% 最終
エンに溶解します ピリン酸ショ

参考文献

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