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方法論記事

株マウス一次運動ニューロンによるシャルコー ・ マリー ・ トゥース病の in Vitroモデル化

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DOI：

10.3791/57988

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2019年1月7日

 ,  , 
1Institut NeuroMyoGène, CNRS UMR5310, INSERM U1217, Université Lyon, 2Unité Fonctionnelle de Neurogénétique Moléculaire, Hospices Civils de Lyon, 3Centre de Biotechnologie Cellulaire, Hospices Civils de Lyon

この記事について

サマリー

この手法の目的は、一次運動ニューロン (MNs) マウスの脊髄からの高濃縮文化を準備することです。ミネソタ病気を引き起こす突然変異の結果を評価するために述べるこれらの分離が magnetofection で、トランスフェクションの MNs とを分離するここ。

要約

(MNs) 脊髄運動ニューロンの変性は、すべて性筋萎縮症に関連付けられている筋萎縮性側索硬化症、シャルコー ・ マリー ・ トゥース病、脊髄性筋萎縮など神経学的障害の大きいスペクトルに関与しています。脊髄の MNs の初代培養は、このような病気に特異的な遺伝子の関与を示し、それらの変異体の細胞の結果を特徴付けるに広く使用されています。このプロトコル モデル主な MN 文化は 20 年以上も前にヘンダーソンと同僚の精液の仕事から派生します。まず、我々 はマウスの胚から脊髄の前方の角を解剖と隣接する密度勾配を利用した細胞から MNs を分離する方法を詳しく説明します。その後、効率的に magnetofection を用いた発現プラスミドを持つ MNs を株の新しい方法を提案する.最後に、我々 を修正する方法と immunostain プライマリ MNs。 ニューロ フィラメントをシャルコー ・ マリー ・ トゥース病のタイプ 2 を引き起こす突然変異を使用して、このプロトコルは、興味の蛋白質を表現することへの関与を勉強して質的な方法を示して説明します。ミネソタの増殖、保守、および生存。

概要

神経筋疾患には、様々 な筋肉や神経系の変化によって特徴付けられる臨床的に、遺伝的に異なる病態が含まれます。最後の十年の間に識別された何百ものこれらのまれな疾患の責任遺伝子の配列の技術が進歩したため (筋疾患センターで利用可能なリスト http://neuromuscular.wustl.edu/index.html)。識別された突然変異の様々 な異なった表現型と疾患1,2,3単一の遺伝子の異なる変異が発生することし、異なる遺伝子の突然変異が類似した表現型を作り出すことができることを示します4,5します。 このコンテキストでは、突然変異の結果、病理学的メカニズムを分析するための強力なツールになることができる細胞モデルの開発に取り組む。

脊髄 MNs 脊髄、骨格筋を対象と神経筋接合部におけるアセチルコリンのリリースを通して自主的な動きを可能にするフォーム長い軸索の腹側の角にある大きな細胞体があります。MNs は筋萎縮性側索硬化症などの神経筋疾患によって影響を受ける、同僚博士ヘンダーソンと脊髄性筋萎縮症、シャルコー ・ マリー ・ トゥース病 (CMT)、開発の耕作のために許可されて最初のプロトコル6in vitro における因子 GDNF7 (グリア細胞派生神経栄養因子) の脊髄 MNs と神経栄養因子の発見。脊髄 MNs と FACS8を使用してそのサブタイプのより正確な浄化のため許可されているそれ以来、技術的な改良が密度勾配による濃縮のまま強力かつ広く使用されているプライマリ脊髄 MNs 作業は現在研究所9,10,11,12,13,14します。 その後、表面マーカー p75(NTR)15,16,17を利用して immunopanning を通じて高い MN 精製グレードを得ることが可能ですも。

脊髄前角の背腹軸内の位置によって異なる中央と外側のモーター列だけでなく、胸椎、頸椎・腰椎の MNs の異なるサブタイプが含まれているし、目標の中で、彼らは8,を支配します。18. プライマリ MN 文化は生理学的な割合でこれらの MN のサブタイプのすべてを回復できます。この手法の主な制限は、MNs のプロシージャの終わりに取得数が少ない実際には、それが顕微鏡が生物化学実験用を制限することに適している六つの胚から約 105 MNs を取得する期待できます。標準化されたサブタイプと豊富な MNs 実験を行う (> 10 の6セル)、胚性幹細胞由来の MNs は、18を考慮すべき。

プライマリ MNs に野生型・変異遺伝子のノックダウンの内因性遺伝子トランスフェクションは、マウスモデルを使用できないときに特に physiopathological 経路を解読するための迅速かつ便利なツールです。Magnetofection は、株の一次ニューロンは、リポフェクション関連毒性なしと同様の技術のひとつです。さらに、いくつかの日に体外エレクトロポレーション9に基づく技術とは異なり、成熟したニューロンのトランスフェクションを実行できます。ただし、この方法の欠点の 1 つは、ビーズが文化、DAPI のラベル付けでノイズの原因で核酸をバインドです。ウイルス感染は株 MNs; の最も効率的な方法で可能性が高いしかし、magnetofection では、ウイルスの生産および細胞の感染に必要な特定の安全手順は必要ありません。

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プロトコル

動物を含むすべてのプロシージャは、機関の倫理委員会によって受け入れられました。

1. ソリューションの準備

  1. 4% BSA L-15 中透析の 10 mL を準備します。
    1. L-15 培地 10 mL に 4% (w/v) でのウシ血清アルブミンの粉を溶解します。
    2. 20 kDa カットオフの 20 mL の透析カセットにソリューションを追加します。L-15 培地 500 mL に対して 4 ° C で動揺の下で 3 日間の dialyze します。L-15 媒体は毎日変更します。
    3. 0.22 μ m 膜と 15 mL の管の因数を使用してソリューションをフィルター処理します。-20 ° C でチューブを格納します。
      注: このプロトコルは、次の参照を使用する: 変更されていない raw L-15 媒体 L-15 媒体、酸性 L-15 媒体を = = pH、L-15 と基本 L-15 培地 = 炭酸 L-15。
  2. PH L-15 の 200 mL を準備します。
    1. L-15 培地の pH を調整する: 最初に、ドライアイスのいくつかの部分で洗浄ボトルを埋めます。色がオレンジ色に変わったら L-15 媒体注入ガス (CO2) (~ pH 6.4 〜 40 圧力)。標準的な pH メーターで pH も調整できます。
    2. 1 ヶ月の 0.22 μ m 膜と 4 ° C でストアを通じて媒体をフィルターします。
  3. 重炭酸塩 L-15 の 100 mL を準備します。
    1. L-15 媒体の 97.5 の mL に 7% 重炭酸ナトリウム 2.5 mL を追加し、4 ° C で保存
  4. IPCS (インスリン Putrescin コンアルブミン亜セレン酸) サプリメントを準備します。
    1. インスリン 0.1 M HCl。 追加の二重蒸留水 4.5 mL の 0.5 mL で 2.5 mg を溶解します。
    2. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の 5 mL のプトレシン 8 mg を溶解します。
    3. 10 mL の PBS のコンアルブミンの 100 mg を溶解します。
    4. 19.3 mL の水に亜セレン酸ナトリウム 1 mg を溶解、pH 7.4 に調整し、ソリューションを 10 倍希釈します。
    5. 3.1 mL IPCS 補足ソリューションを取得するナトリウム亜セレン酸溶液 0.1 mL、1 mL のコンアルブミン、プトレシン溶液 1 mL インスリン溶液 1 mL を組み合わせます。-20 ° C でソリューションを格納します。
  5. 0.02 mM プロゲステロン ソリューションを準備します。
    1. 80% エタノール 1.6 mL にプロゲステロンの 1 mg を溶解します。
    2. ソリューション 100 で 100% エタノールを希釈し、-20 ° C で保存
  6. 完全 L-15 培地 100 mL を準備します。
    1. PH、最終濃度が 3.5 mg/mL のブドウ糖 L-15 の 92 mL に 1.8 mL の D-グルコース溶液 (200 mg/mL) を追加します。
    2. 100 の 1 mL を組み合わせるペニシリン-ストレプトマイシン x (10,000 U/mL)、熱不活化馬血清の 2 mL、IPCS ミックスの 3.1 mL、0.1 mL のプロゲステロン溶液 (2 × 10-5 M)。
    3. 0.22 μ m の膜の中にフィルターを適用し、4 ° C で保存
  7. 密度勾配溶液 (5.5% の最終的な集中) 実験あたり 5 mL を準備します。
    1. L-15 の 4524 μ L に商業 60% 密度勾配媒体の 476 μ L を追加 (; 相間で視覚的コントラストを高める赤いフェノールなく可能であれば、1:10. 5 の希釈比)。
    2. 2 週間で 4 ° C ソリューションを格納または-20 ° C の凍結
  8. 培地 10 mL を準備します。
    1. 9.6 mL ニューロン細胞培養液にサプリメント中の 200 μ L を追加します。
    2. グルタミンを 25 μ l 添加し、10 μ L 2-メルカプトエタノールの熱不活化馬血清 (グリア細胞前駆体と増殖に対して作品を区別するために傾向がある) を 200 μ L を追加します。
    3. 0.22 μ m のフィルターを通してメディアをフィルター処理します。
    4. 次の神経栄養因子を追加: 1 ng/mL の濃度で最終的なグリア細胞派生神経栄養因子 (GDNF) と脳派生神経栄養因子 (BDNF) 毛様体神経栄養因子 (CNTF) 10 ng/mL の最終的な集中で。
    5. 4 ° C でメディアを保管します。
  9. 郭清メディアの 50 mL を準備します。
    1. HBSS 47.05 mL にブドウ糖 (200 mg/mL) の 2.25 mL を追加します。PH 7.4 1 m HEPES 700 μ L を追加します。4 ° C でメディアを保管します。
  10. 4 %pfa ソリューションを準備します。
    1. 500 mL の PBS の PFA の 20 g を溶かします。
    2. 化学のフードの下で 60 ° C への解決策、解決策が明らかになるまで 1 メートル naoh 水溶液を数滴を加えます。
    3. フィルター ペーパーを通してソリューションをフィルター処理し、7.2 pH を調整します。-20 ° C で保存します。
      注: また、他市販 PFA を使用でき PBS で 4% に希釈します。
  11. 鉗子、はさみ、シリコーン料理使用前に 70% のエタノールと石鹸など解剖道具の清掃、使用後の水洗い。

2. ポリ-オルニチン/ラミニン (Po/L) 皿コーティング

注: ボリューム コート 24 ウェル プレートに適応されます。

  1. 必要な場合に、井戸滅菌 12 mm coverslip。
  2. 500 μ L の水に溶解した 10 μ g/mL ポリ L-オルニチン ソリューションと井戸をコートします。
  3. 1 時間室温で解決する井戸をしましょう。
  4. ポリ L-オルニチン ソリューションを削除し、30 分間空気乾燥します。
  5. 500 μ L の重炭酸塩 L-15 で 3 μ G/ml ラミニンと 37 ° C で一晩井戸をコートします。
    注: 井戸は 37 ° C でインキュベーターで 7 日間保存できます。長い孵化の中の蒸発を避けるために井戸の間滅菌 PBS を追加することができます。

3. 郭清

  1. 妊娠中のマウスを犠牲にされる胚は、胚段階 E12.5。腹を 70% エタノールで拭きます
  2. 2 つの卵管や膣を切断することによって子宮を取り外して (せずに Ca2 + Mg2 +) 冷 PBS でいっぱいシャーレに入れてください。
  3. すべての胚を収集し、新鮮に転送ペトリ皿 (せずに Ca2 + Mg2 +) 冷 PBS。
  4. シリコーンでコーティングとの完全郭清メディア (HBSS、4.5 G/L グルコースと 7 mM HEPES pH 7.4)、1 つの胚を皿に置きます。
    メモ: 胚解離はきれいな微細鉗子、はさみを使用して顕微鏡下で実行されます。また、解離のシリコーンなし正規ペトリ皿を使用できます。
  5. 頭、尻尾、内臓、ハサミ、鉗子を使用してを削除します。
  6. 鉗子とシリコーンに対して腹を持つ胚を維持します。
  7. 鉗子の 2 番目のペアの 1 つのヒントを吻側脊髄の中心管挿入します。
  8. 背側の組織が数ミリの涙に鉗子を閉じます。
  9. 尾側に向かってこの操作を繰り返して、全体の脊髄が開いている (図 1 b)。
  10. 身体から脊髄 (大脳のトランク) の吻側部をデタッチします。
  11. シリコーンに対して開いている脊髄を維持するために胚をオンにします。
  12. 脊髄の吻側部をピンチ、脊髄を抽出する頭部によって胚を引き出します。
    注: 髄膜と後根神経節 (Drg) 胚に添付しておきます。そうでなければ、慎重に引いて離れて残りの脳膜と脊髄にまだ接続されている Drg。Drg は、この段階で、敏感なニューロンの文化のためまた集めることが (議論を参照)。
  13. シリコーンの脊髄を平らにし、メスを使用して各側面の真ん中に沿って切断することによって脊髄の背側の半分を削除します。メス、10 個に真ん中の部分をカットし、作品を新しいチューブに転送します。

4. 脊髄細胞懸濁液

  1. この解剖の手順 6 に 8 脊髄に対して繰り返します。
  2. 脊髄部分チューブの下部に収集し、ハム F10 培地 1 mL、HBSS に置き換えるができます。
  3. トリプシン (2.5 w/v; 最終濃度 0.025%) の 10 μ L を追加します。37 ° C で 10 分間のチューブを孵化させなさい
  4. 酵素消化を停止するには、DNase (L-15 中 1 mg/mL) の 100 μ L、100 μ L 4% (w/v) BSA の完全 L-15 培地 800 μ L を含む新しい 15 mL チューブにフラグメントを転送します。
  5. P1000 ピペットを使用して 1 つの mL を吸引によって回カップ刻んだ。フラグメント 2 分収集新しい 15 mL チューブに上清のために解決しなさい
  6. 断片、完全 L-15 培地の 900 μ L、100 μ L 4% (w/v) BSA の DNase (L-15 中 1 mg/mL) の 100 μ L を追加します。
  7. P1000 ピペットを使用して 1 つの mL を吸引によって6 回をカップ刻んだ。フラグメント 2 分 15 mL チューブに上清が 4.5 の手順で得られた追加のために解決しましょう。
  8. 断片、完全 L-15 培地の 900 μ L、100 μ L 4% (w/v) BSA の DNase (L-15 中 1 mg/mL) の 100 μ L を追加します。
  9. P1000 ピペットを使用して 1 つの mL を吸引によって10 倍をカップ刻んだ。フラグメント 2 分 15 mL チューブに上清が 4.5 の手順で得られた追加のために解決しましょう。上清を続行します。
  10. P1000 ピペットを使用して、そっと上澄み管の下部に 2 mL BSA 4% (w/v) クッションを置きます。5 分 470 × g で遠心分離機します。
  11. 上澄みを除去し、完全 L-15 培地 2 mL で細胞ペレットを再懸濁します。

5 勾配の密度によってマンガン濃縮

  1. 細胞懸濁液を 15 mL の管を 2 つ (各 1 mL) に分割します。完全 L-15 培地 2 mL を加えます。6 胚にはじまって、培地 3 mL にチューブごと 3 胚の相当を使用します。
  2. 密度勾配液 2 mL をゆっくりとシャープなインターフェイスを取得する各チューブの下にソリューションを追加することによって追加します。
  3. 室温で 15 分間 830 × g で遠心分離機します。この手順の後小細胞は MNs など大型細胞は密度勾配ソリューション/媒体インターフェイスでする必要があります一方管の下部にする必要があります。
  4. インターフェイスで細胞を収集で 1 または 2 mL を吸引し、新鮮な 15 mL チューブに転送します。L-15 pH 媒体と 10 mL にボリュームを調整します。
  5. 470 x g で室温で 5 分間遠心管の底に 4 %bsa クッションの 2 mL を追加します。
  6. 上澄みを除去し、完全 L-15 培地 3 mL にペレットを再懸濁します。
  7. 5.5 のステップを繰り返します。
  8. 上澄みを除去し、2 ml の完全培地の細胞ペレットを再懸濁します。診断と位相差顕微鏡下での生存率と細胞数をカウントします。
    注: 6 脊髄細胞の数は約 1 × 105 MNs と予想します。

6. ミネソタの文化

  1. 適切な密度、MNs、通常 5,000、10,000 細胞/24 ウェル プレートのウェル培養液 500 μ L を希釈します。
    注: は、それぞれ 6、96 ウェル プレート、30,000 と 1,500 のセルの周囲は播種密度です。
  2. P1000 とラミニン ソリューションを削除します。
  3. すぐに乾燥を防ぐためコーティング プレートに培養培地で希釈した MNs を転送します。
  4. 37 ° C で 2 日間の文化を孵化させなさい

7. MNs の Magnetofection

注: 次の手順で使用される量の 24 ウェル プレートの 1 つの井戸の transfection のためものです。別の形式の製造元のプロトコルを参照してください。

  1. DNA の準備のため神経細胞培養培地と 5 の渦の 50 μ L の DNA の 1 μ g を再懸濁します s。
  2. ビーズ チューブの準備、神経培養液 50 μ L でビーズの 1.5 μ L を再懸濁します。
  3. 50 μ L の DNA 溶液を 50 μ L ビーズ ソリューションを追加し、室温で 20 分間インキュベート (合計量 100 μ L を =)。
  4. この潜伏中にトランスフェクションが井戸から培養液 100 μ L を撤回します。
    注: は、37 ° c. にそれを暖めるためのインキュベーターで磁気板を置く
  5. まあに 100 μ L の DNA/ビーズ ミックスを転送し、プレートを孵化させなさい磁気プレート 37 ° C で 20-30 分
  6. CDNA 発現の検出前に少なくとも 24 時間を待ちます。

8. 固定および汚損

  1. PBS で 2 回文化を洗います。
  2. 4% で室温で 20 分間文化をインキュベート PFA/PBS。
  3. PBS で 2 回文化を洗います。
  4. 室温で 1 時間ブロッキングのバッファー (PBS 4% BSA 2% 正常な血清、0.3% トリトン X-100, 0.1 M のグリシン) を 500 μ l 添加の文化を孵化させなさい。
    注: 正常な血清は、(例えば、通常ヤギ血清) 二次抗体と同じ種から派生する必要があります。
  5. 4 ° C で一晩文化をブロック バッファーの 250 μ L で希釈した一次抗体とインキュベートします。
    注: たとえば、1/1000 で TUJ1 を使用、SMI32 が 1/1,000 で使用される、Lc3b、1/200 で使用されます。
  6. PBS で 3 回文化を洗います。
  7. 室温で 1 時間ブロッキング バッファーの 250 μ L で希釈した蛍光標識二次抗体と文化を孵化させなさい。
  8. PBS で 3 回文化を洗います。
  9. メディアをマウントを使用してガラス スライド上にマウントします。

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結果

文化で 24 時間後運動ニューロン (MNs) 既に重要な軸索の成長 (少なくとも 6 回以上相馬サイズ) が表示されます。次の日に軸索は成長し、分岐 (図 2) を表示し続ける必要があります。サブタイプ特異性により異なる形態があります。たとえば、中央列軸の筋肉を支配する MNs 肢筋肉18を支配する側のモーター柱 MNs より短くより分岐した軸索であります。

これらの分離と培養技術上記最近ニューロ フィラメント遺伝子 CMT13常染色体優勢軸索フォームを引き起こす NEFH の新しい突然変異の特性評価に使用されています。この場合、めっき後、2 日精製 MNs は eGFP を融合した NEFH の変異フォームまたは eGFP を融合した野生型フォームのプラスミドを導入させた。2 日後、突然変異体 ...

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ディスカッション

このプロトコルの重要なポイントの 1 つはマウス胚が開発 (E12.5) 末に得た MNs の量を最適化する時に正確な時間ウィンドウで解剖してです。また、最適な収率の解剖を実行朝または午後の早い段階でする必要があります。E12.5 (例えばE11.5 で)、前に郭清は髄膜の除去について特に困難です。E12.5 後、得られた MNs の数が大幅に低下します。開発の胚段階を制御するには、成人女性と男性最初をまとめて配置して、一日の終わりに。次の朝、大人を区切られ、女性が膣にプラグインの有無をチェックします。プラグインが存在する場合、胚はこの時点で開発の E0.5 日すると考え。これらの実験では、通常は積極的な生産マウスの線を使用します。ミズーリ州の繁殖コロニーから発信された前駆細胞がこのプロトコルで使用されていた、CF1 と名付けたひずみ (Carworth 農場ひずみ 1)。この歪みは、1967 年にチャールズ川研究所フランスで導入されたし、名前 OF1 (Oncins フランス 1)。

2 番目の重要な点は、文化の純度に大きく影響する遠心分離手順です。MNs を表...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

我々 は、「協会の流し込みル開発銀行デ ラ neurogénétique」博士 Jacquier の親睦と AFM テレソンの MyoNeurAlp 戦略的な計画を支援に感謝したいと思います。我々 はまた博士クリス ・ ヘンダーソン、博士ウィリアム ・ カムカム、博士ブリジット Pettmann、博士セドリック ラウルと博士のゲオルク Haase、開発および技術の改善に参加し、知識を広める人に感謝したいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Material
シリコン解剖皿リビングシステム計装DD-90-S-BLK-3PKシルガード
丸型カバースリップNeuVitro, ニットガラスGG-12-Pre12mm
スライド A ライザーカセットThermoFisher Scientific6603020,000 MWCO ; 30 mL
フィルターユニットミリポアSCGVU02RE
GP滅菌シリンジフィルターミリポアSLGP033RS
4ウェルプレートサーモフィッシャーサイエンティフィック167063ナンクロンデルタ処理プレート
鉗子FST デュモン11252-20#5鉗子
はさみFST デュモン14060-10ファインハサ
ミメスメスFST10035-20湾曲した刃
メスFST デュモン10316-14マイクロナイフ メス
シャーグライナー 663102ø x h = 100 x 15
mm 15 mL ポリプロピレン チューブファルコン352096
フィルターペーパーワットマン1001125サークル、直径 125 mm
ガラス チャンバー スライドLab-Tek1545264チャンバー
プラスミド pCAGENAddgene#11160
Name企業名カタログ番号コメント
Solutions and mediums
ウシ血清アルブミンSigma-AldrichA9418
L-15 mediumサーモフィッシャーサイエンティフィック11415056
L-15 ミディアム、レッドフェノールなしサーモフィッシャーサイエンティフィック21083027
インスリンSigma-AldrichI6634
プトレシンSigma-AldrichP5780
コンアルブミンΣ-AldrichC7786
亜セレン酸ナトリウムSigma-AldrichS5261
プロゲステロンSigma-AldrichP8783
Poly-DL-OrnithineSigma-AldrichP8638
LamininSigma-AldrichL2020
トリプシン 2.5%、10xThermoFisher Scientific15090046
DNAseSigma-AldrichDN25
PBS w/o Ca Mgサーモフィッシャーサイエンティフィック14190144Mg2+ Ca2+
重炭酸ナトリウムサーモフィッシャーサイエンティフィック25080094
ニューロン細胞培養培地サーモフィッシャーサイエンティフィックA3582901Neurobasal Plus 培地
HBSSSigma-AldrichH6648-500ML
HEPESバッファー 1 MThermoFisher Scientific15630056
密度グラデーション培地Sigma-AldrichD1556Optiprep
サプリメント培地ThermoFisher ScientificA3582801B-27 Plus
馬血清熱不活化ThermoFisher Scientific26050-088
L-Glutamine 200 mMThermoFisher Scientific25030024
2-メルカプトエタノールサーモフィッシャー サイエン31350010
ペニシリン/ストレプトマイシンサーモフィッシャー サイエンティフィ1514012210,000 U/mL
名前会社名カタログ番号コメント
strong<>Immuno蛍光
PBS、10xThermoFisher ScientificX0515Mg2+Ca2+
>パラホルムアルデヒド(PFA)Sigma-Aldrich441244 正常な
ヤギ血清Sigma-AldrichG6767
グリシンSigma-AldrichG7126
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
コリンアセチルトランスフェラーゼ (CHAT)ChemiconAb144P
Neurofilament H non phosphorylated (SMI32)BiolegendsSMI-32PIF at 1/1000
Islet-1DSHB40.2D6
Islet-2DSHB39.4D5
Hb9DSHB81.5C10
Vectashield封入剤Vector LabH-1000
Beta3 tubulin (Tuj1 clone)Biolegends801201IF at 1/1000
Lc3bCell Signaling Technology#2775IF at 1/200
のレ ティフィック ック 、

参考文献

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