さらに生体内で部分的な肝、将来工学を勉強するための前提条件としてラット生体内単一肝葉潅流モデルの新しい手術手技を確立します。
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この記事について
サマリー
要約
臓器工学は、移植に使用できる肝臓臓器の代替を生成する新たな戦略です。最近生体内で肝臓エンジニア リング、体内臓器 decellularization 再作成が続くなどとして浮上している有望なアプローチ前のヴィヴォ肝エンジニア リング。ただし、術後は実現しなかった。本研究の目的体内肝エンジニア リングのための前提条件としてラット生体内で選択的肝葉灌流の外科的手法を開発することです。我々 は左葉外側を介してのみ回路バイパスを生成します。その後、左葉外側はヘパリン生理食塩水で灌流します。実験は 4 つのグループで実行されます (n = グループあたり 3 ラット) 20 分、2 h、3 h、4 h、生存の異なる灌流時の色の目に見える肉眼的変化と血液細胞の組織学的決定の不在に基づいて、ポータル トライアドと正弦波、成功モデルの構築のための指標として使用されます。左葉外側の選択的灌流後、左葉外側が淡い黄色への赤からになって確かに、遵守しています。組織学的評価の血液細胞が、正弦波、中心静脈、門脈の枝に表示されません。左葉外側ブロックの船を再度開いた後赤に変わります。12/12 ラットは、1 週間以上のプロシージャを生き残った。最初の 1 週間以上の長い生存期間を持つ単一の肝葉灌流の生体内での外科的モデルを報告しております。以前に発行されたレポートと対照をなしてここで示した手法の最も重要な利点は、全体の手順全体で 70% の肝の灌流を維持します。この手法の確立は、体内のラット、decellularization、recellularization などの部分的な肝工学の基盤を提供します。
概要
臓器移植の適応は常に拡大しています。対照的に、臓器提供率が、臓器全体の品質が低下して移植の需要の増加に 。肝移植待機リストに追加される候補者の数が増加し (例えば、アメリカ合衆国で 11,340 患者は、2016 年に追加されたに比べ 10,636 2015 年)1。相当な努力にもかかわらず、利用可能な臓器の数は、臨床ニーズを満たしていません。肝臓病の増加率のため多くの患者末期肝疾患死ぬ前にドナーの臓器移植待機リスト登録が可能になります。生体肝移植のための巨大な需要を満たすためには、エンジニア リングの原則を積極的にされている肝臓のティッシュを使用して代替アプローチは2を追求しました。今日では、肝工学の新しく開発された生物学的手法は、この不足を克服すること可能性があります。
肝エンジニア リングは 2 つの手順で構成されています: 無細胞の足場は、足場の再作成後の世代。生物学的無細胞性肝の足場を得るためには、explanted 肝臓は灌流を介して肝臓から細胞材料を除去できるイオン性または非イオン性洗剤と血管系です。ほとんどの前の研究で生物学的無細胞性肝足場はドデシル硫酸ナトリウムと TritonX100 の組み合わせで肝臓の血流によって達成されました。その結果、細胞外マトリックスの構造が維持されたに対し、すべてのセルが削除されました。オルガン足場が成熟細胞、肝細胞、血管内皮細胞、肝細胞血管内皮細胞や間葉系幹細胞 (MSC) の同時適用の有無で再シード。ほとんどの研究者は焦点体外肝エンジニア リング3,4,5,6,7,8,9,10、 11,12,13,14。ただし、前の調査、再作成される足場キューブの小さな部分のみが異なる異所性着床に移植されました。いくつかの研究に部分的な再作成される足場は補助グラフトとして移植されました。ただし、最大報告された生存時間は 72 h8,14だけだった我々 の知る限り、再作成される全肝移植の同所性同種移植がまだ実行されたりについて出版しました。長期的な機能と人工臓器の移植もまだ初期段階の。したがって、前のヴィヴォ肝工学への代替アプローチが必要です。
工学生体内で肝臓が生理的条件下で肝の再作成を研究する代わりにあります。生体内で肝臓工学エンジニア リング前のヴィヴォ肝に比べての利点は多様です。生体内で再作成の部分肝足場は、適切な温度、十分な酸素、栄養素、および人工培養液で灌流前のヴィヴォと対照をなして成長因子の生理学的、血液灌流を受けます。さらに、残りの部分の正常肝主長期生存を許可する、肝機能を維持します。その体内部分肝 engineeringwould 最終的になって思い描いて注入前のヴィヴォ設計肝移植はまだその肝機能8で実験動物の長期生存を維持ことが可能なので、さらに前のヴィヴォよりも長く生存観測と人工肝臓の進化を研究する有望なモデル。
最近では、1 つの研究グループ (パンや同僚) 手法を提示した、初めて、工学生体内で肝臓の。彼らは解剖学的および技術的な課題にもかかわらず生きているラットの右下肝葉の単離灌流を達成しました。彼らは、生体内で再作成がラット一次培養肝細胞系を使用しての最初の術中の結果を報告しました。ただし、パンらの体内手術用灌流モデル欠点があります。彼らは単一の肝葉潅流ラット門脈・下大静脈、動物に深刻な害を引き起こす可能性がありますが完全にブロックを犠牲にして達成しました。実験的ラットが術中の観察時間のわずか 6 時間後犠牲になった。したがって、肝葉体内灌流法がさらに術後生存率を達成するために改善が必要。
体内肝葉潅流、ラット16、門脈穿刺でマウス17、および生体肝の血行動態モニター法の肝の解剖学の以前の研究に基づく小説生存モデル開発を行った18,19.図 1A - 1Eにプロシージャの主な手順を示します。
この手法は化学切除臓器疾患として薬の注入、生体内でdecellularization 部分臓器治療に関する基礎的研究にこの実験的体内灌流モデルを使用する人のために適している (など、肝臓癌)、体内細胞の培養前のヴィヴォ二次元と三次元を比較する decellularized マトリックス細胞培養システム20,21,22,23,24,25,26, と体内肝 decellularization と再作成によるエンジニア リングします。
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プロトコル
ハウジングと実施のすべてのプロシージャはドイツの動物保護の立法に従いでした。ガーゼ、カバーの服、手術器具はオートクレーブと操作の前に準備されました。無菌条件下ですべての手順を実行します。
1. 手術のラットの準備
- 部屋に誘導ラットを置き、イソフルラン気化 4% と 100% 酸素 0.5 L/分、約 3 分間のラットの麻酔ラットの麻酔が完全になるまで。
- 誘導室からネズミを取るし、その体重を測定します。
- 腹部外科領域の毛を剃る。
- 裏では動物を麻酔を深めるためにさらに 2 分間イソフルラン室に配置します。
- ラットを仰臥位での操作表に配置します。
- ラットの河口域に麻酔マスクを修正し、イソフルラン気化 2% と 100% 酸素 0.5 L/分の流量で連続的なガスの流れと麻酔動物を維持します。
- テープの断片で手足を固定します。
- 乾燥を防ぐために両方の目に獣医軟膏を適用します。
- ブプレノルフィンを管理 0.05 mg/kg 皮下、運用期間中に痛みを和らげるために。
- 70% アルコールの 2 ラウンドに続いてヨード チンキの 3 ラウンドは、腹部の手術野を消毒します。
- 場所は滅菌ガーゼのみ公開される腹部の操作フィールドのままに切開する場所周辺です。
- ラットのつま先ピンチ逃避反射がない場合は、操作の実行に進みます。
2. ラットの開腹
- 横腹部皮膚と筋肉の切開はさみや電気凝固装置を使用してください。
- 修正し、4-0 ポリプロピレン縫合糸を使用しての頭に向かって、剣状突起をプルします。
注: は、肝臓より良い公開する垂直方向に剣状突起を持ち上げるが、重度の呼吸制限や窒息を避けるために慎重に進むに注意を払います。 - 肝臓を公開する 2 つの弓下フックで頭に向かって腹部壁の両側に引いて腹膜腔を開きます。
- 十二指腸や乾燥を避けるために湿らせたガーゼで腹腔内で小腸をカバーします。
- 湿らせたガーゼを使用して左と右中央葉を持ち上げ、肝門部より良い公開する胸郭に対してそれらを保持します。
- 実体顕微鏡 (8 倍) でラットを配置します。
- ドロップいくつかの温かい生理食塩水に腹部、肝臓や腸の表面に数分おき、全体の手順中に乾燥防止のため。
3 左葉外側内バイパス通路の設置
- 左の門脈の解剖し、基地 (図 2 a) で 6-0 シルク縫合糸で縛る。
- 左中央の葉 (図 2 b) 液の流れを防ぐためにマイクロのクランプで左肝動脈、門脈左中央、左正中肝動脈および左中央胆管とともに左胆管をブロックします。
- マイクロのハサミで葉の周囲の靭帯を切断して左葉外側を区切ります。
- マイクロ クランプ (図 2) で左の外側の葉の基部にクランプして左の外側の肝静脈をブロックします。
メモ: は、間違えて左の門脈は同様でクランプしていないことを確認してください。 - 左の門脈の合字を保持し、静脈穿刺後の適切な緊張感を保つ使用蚊クランプ。
- 慎重に 24 G 針住居カテーテル (図 3 a) で穴をあけることによって左の門脈の前壁に切開を行います。
注: バイパスを作成するには、左の門脈, 肝静脈の血管アクセス ポイントが必要です。この手順では、はさみを使用して大きな切開を作成するのではなく、針で血管を穿刺してバスキュラー アクセスを作成することが好ましい。これは出血とその後の狭窄のリスクが減ります。 - カテーテルし、針無料 24 G カテーテルを取得するカテーテルから針を取る。
- 灌流管にカテーテルを接続、他のエンドポイントが 40 の 15 mL と 20 mL の注射器に接続するの U/mL ヘパリン血流ポンプの生理食塩水。
- チューブと針無料カテーテルから空気を排出するためのチューブを灌のポンプをオンに。
- 灌流ポンプをオフにします。
- 再度、左の門脈を介して静脈 (図 3 b) にパンクチャド切開に針無料カテーテルを挿入します。
注: カテーテルを固定するための非常に限られたスペースがあるという事実のため、この時点で固定されていません。したがって、外科医は、気をつけてください ● キャニュレイテッド カテーテルの変位を避けるために。 - 慎重に 22-24 G 針住居カテーテル (図 3) で穴をあけることによって左外側肝静脈の露出領域の余白に別の切開を作る。
注: カテーテルが血管よりわずかに小さいことをお勧めします。 - カテーテルし、針無料 22 G カテーテルを取得するカテーテルから針を取る。
- 経由で左葉外側にヘパリン生理食塩水を灌流する血流ポンプ流量を 0.5 mL/min で左の門脈の 24 G ● キャニュレイテッド針無料カテーテルを入れます。
- 左の外側の肝静脈切開周辺外流れる廃液を吸収するのにドライ ガーゼを使用します。
- Cannulate、左外側肝静脈を介して腹腔内汚染 (図 3 D) を最小限に抑えるためにコンセントの流体を生成する、22 G 針無料カテーテルで静脈のパンクの切開。
注: 肝葉 ● キャニュレイテッド カテーテルを修正する技術的に困難です。したがって、外科医は、カテーテルの変位を避けるために注意を払う必要があります。また、カテーテルを左外側肝静脈の穿刺なし廃液も吸収できるだけ乾いたガーゼで静脈切開部で。 - 約 20 分 (グループ 1) ヘパリン生食液左葉外側を灌を維持、その際 2 h、3 h、4 h (グループ 2、グループ 3、およびグループ 4 それぞれ) を生理食塩水に。
- 灌流を停止するポンプをオフにします。
4 左葉外側の生理的再灌流
- 門脈左と左の外側の肝静脈から両方のカテーテルを外してください。
- 11-0 ポリアミド縫合糸で左の門脈の切開を閉じる。
- 11-0 ポリアミド縫合糸同様で左外側肝静脈切開を閉じる。
- 左の外側の肝静脈をアンクランプします。
- 門脈の左中央、左胆管および左肝動脈をアンクランプします。
- 合字の左の門脈静脈を再開するを遮断します。
5. 腹部壁の閉鎖
- 4-0 吸収 polyglactin 910 縫合糸で縫合を中断して腹壁の筋層を閉じます。
- 4-0 polydioxanone 吸収性縫合糸で縫合を中断して腹壁の皮膚層を閉じます。
- 腹部を閉じた後 70% アルコールで皮膚切開を消毒します。
6. ラットの術後
- 地球温暖化パッド約 10 分間の蘇生のために動物を置き、新しいケージに入れます。
- ブプレノルフィンを管理 0.05 mg/kg 皮下 2 倍術後痛みを解放する連続した 3 d の日。
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結果
12 男性 (高齢者 12 - 13 週) ルイス ・ ラット肝葉の選択的灌流の影響を評価するために使用されました。4 つのグループで実験を行った (n = グループあたり 3 ラット)。20 分の異なる血流期間を使用すると、2 時間、3 時間、4 時間、上記で説明した手順に従って達成すること単一葉潅流生体内で。
生体内で左葉外側の灌流:
門脈左左外側肝静脈と門脈左成功したヘパリン生理食塩水で灌流後外側肝静脈カニュレーションを確認ことができます左の正確な解剖学的同定。成功した識別、カニュレーションの最初のインジケーターは、出納の混合血が (図 4 a) ...
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ディスカッション
ブロックと流体の入口としてカテーテルを左の門脈と流体の出口として別のカテーテルを左外側肝静脈を cannulating、正常に生成した左葉外側内の体内流体バイパス示すテクニックは非常にチャレンジングなカニュレーションの容器のサイズが小さく、出血を引き起こすリスクが高いためが可能です。4 時間の長い灌流期を迎えているラットも生き残ったラットがこの手術を容認できることを示す、少なくとも 1 週間。
次のセクションでは、3 つの技術的に最も困難かつ重要なステップと正常にそれらを習得する方法について説明します。まず、対象となる門脈周囲の肝実質の位置関係が近いため、左の門脈枝の結紮と分離の過程で容器の分離は出血を引き起こす危険性が高い。我々 は慎重に左の門脈を取り巻く接続無血管組織を離れて引き裂くことによって左の門脈を分離するハサミではなくマイクロ鉗子を使用してお勧めします。第二に、左の門脈の前壁に切開面で切開修復の難易度と血管吻合術後後狭窄の原因のチャンス左の門脈の正面の壁に大型の切開が増加します。適切なサイズの切開を作るためのはさみではなく針住居カテーテルを使用をお勧め...
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
著者は解剖学研究所からイェンス Geiling を感謝したい私は、ラット肝臓の解剖の図を生成するためのイエナ大学病院。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 灌流ポンプ | |||
| Perfusor VI | B. Braun, Melsungen | ||
| Catheter | |||
| Versatus-W カテーテル | テルモ | SR+DU2419PX | 24G、0.74倍;19mm |
| バーサス-W カテーテル | テルモ | SR+DU2225PX | 22G、0.9回;25mm |
| マイクロ手術器具 | |||
| マイクロハサミ | F·S&ミッドドット;L | No. 14058-09 | |
| マイクロ serrefine | F·S&ミッドドット;L | No.18055-05 | |
| マイクロクランプアプリケーター | F·S&ミッドドット;L | No. 18057-14 | |
| ストレートマイクロ鉗子 | F·S&ミッドドット;L | No. 00632-11 | |
| 湾曲したマイクロ鉗子 | F·S&ミッドドット;L | No. 00649-11 | |
| マイクロニードルホルダー | F·S&ミッドドット;L | No. 12061-01 | |
| 一般外科用器具 | |||
| 標準はさみ | F·S&ミッドドット;L | ||
| 蚊クランプ | F·S&ミッドドット;L | ||
| 鋸歯状鉗子 | F·S&ミッドドット;L | ||
| 歯付き鉗子 | F·S&ミッドドット;L | ||
| ニードルホルダー | F·S&ミッドドット;L | ||
| 縫合糸 | |||
| 4-0 prolene | ethicon | ||
| 4-0 ETHICON*II | ethicon | ||
| 6-0 silk | ethicon | ||
| 11-0 polyamide | ethicon |
参考文献
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