核と細胞骨格との間の機械的統合を測定するための直接力プローブ

Summary

このプロトコルでは生きている細胞の核に直接制御力を適用するマイクロ ピペット法について述べる。このアッセイでは、生活、付着性の細胞で核の力学特性の尋問をことができます。

Abstract

核の機械的性質は、細胞で生成された機械的な力への応答を決定します。核が細胞骨格の分子に連続しているため付着細胞での力学的挙動を調べるための方法が必要です。ここでは、付着性細胞の核に直接力を適用するためのツールとして直接力プローブ (DFP) について述べる。我々 は、吸込みを伴う核の表面に細いピペットを添付します。マイクロ ピペットは、翻訳を変形させ、核を引き起こす核から変換されます。復元力が吸引力に等しい、核はデタッチし、弾性を緩和します。吸引圧が正確に知られているために、核の表面に働く力が知られています。このメソッドは、ナノの力が変形し、付着細胞で核を翻訳するのに十分なされ、力に抵抗する核を可能にする骨格の要素を明らかにしました。DFP を使用して、細胞内の核の力学特性に細胞や原子力部品の貢献を分析できます。

Introduction

癌などの疾患は、核の形状と構造^1,2, '' 核^3,4の軟化に伴う一般的に変化を含みます。原子力機械変形抵抗は、隔離された核⁵に力を適用することで一般的に特徴づけられています。

細胞核は細胞骨格に Nucleoskeleton リンカーと細胞骨格 (バイオス) 複雑な^6,7,8,9分子接続されます。その結果、核は、細胞骨格と、細胞-基質間の癒着、細胞外マトリックスを機械的に統合されています。機械的に付着性細胞の中の核を探るこの機械的統合への洞察力を提供できます。マイクロ ピペット吸引^10、11、および原子間力顕微鏡^12,13....

Protocol

1. イメージング用細胞を準備

注: 任意の付着性のセルのタイプの直接力プローブ (DFP) を使用できます。ここでは、NIH 3T3 マウス線維芽細胞は、このプロトコルのモデル細胞ラインとして使用されます。

1. 文化 NIH 3T3 線維芽細胞でダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) 1% と 10% ドナー牛血清ペニシリン-ストレプトマイシン 35 ミリメートルのガラスの下に目的の confluency まで皿します。37 ° C と 5% の CO₂の細胞を維持します。
   1. 必ずイメージングのための NIH 3T3 細胞を播種する前に 5 μ g/ml のフィブロネクチン (または類似の ECM 蛋白質) のすべての 35 mm ガラス底培養皿をコートしてください。
      注: セルする必要が完全に普及して実験用皿に付着。DFP メソッドが動作するための密度の面で制約があります。
2. 実験直前にセルを洗浄して完全な培地で一回の洗浄が続く PBS で 2 回。
3. ガラス底皿に完全な成長培地 3 mL を追加します。

2. 顕微鏡と画像の取得

注: 倒立蛍光顕微鏡 (または同等) 側の腕は、メーカーの推奨事項に従ってインストール マイクロマニ....

Results

図 2 aは、NIH 3T3 マウス線維芽細胞核の強制を示しています。マイクロ ピペット チップの右側に翻訳核変形、最終的にマイクロ ピペット チップから切り離します。吸引力 (図 2 b) とともに増加する核の長さのひずみが見られます。核 (端を引っ張ってマイクロ ピペット) の前面の端を形成する核の突起とトレーリング エッジが元の位置からずれています。突起の長さはトレーリング エッジの変位 (図 2)、核と細胞質の間の緊密な統合を示唆よりも大きくなります。時間スケールが核の前面の端のための短いリラクゼーション (< 1 s)、および核の背面の端 (< 2 s) (図 2 D)。

Discussion

彼らはいずれかの隔離された核 (核は細胞骨格から分離) を必要とするためピペット吸引¹⁶など、最新の方法のための挑戦は、細胞骨格に核の機械的統合を測定または核浮遊細胞 (細胞外の力、牽引力などは欠席)。力は、軸ひずみを膜^17,18; に付着性のセルに適用することで、核に適用されています。ただし、この手法は、核の力が不明であるという事実によって制限されます。原子間力顕微鏡 (AFM) プローブは、そのまま細胞に核をインデントに使用されています。これらのオファーは、彼らが中に核の力学特性を明らかにする利点は、細胞骨格と統合されて。核^12,13,14を特徴付けるため既存の体内手法を加える機械的付着細胞で核をプローブにしたまま簡単で堅牢な方法を開発しました。周囲の骨格に統合されて.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
フルオロディッシュ	WPI	FD35
SYTO 59	サーモフィッシャーサイエンティフィック	S11341
フェムトチップ	エッペンドルフ	930000043
InjectMan NI2	エッペンドルフ	NA	販売終了、現行相当機種:InjectMan 4
FemtoJet	Eppendorf	NA	現行モデル FemtoJet 4i
Plan フッ素油浸 40x	Nikon	NA
Apo TIRF 油浸 60x	Nikon	NA
ドナーウシ血清 (DBS)	ThermoFisherScientific	16030074	NIH 3T3 血清
Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM)	Mediatech cellgro	MT10013CVRF	NIH 3T3 medium
Penicillin-Streptomycin	Mediatech	MT30004CIRF	NIH 3T3 ミディアムサプリメント
浸漬油タイプ LDF 非蛍光	Nikon	77007	対物レンズ用浸漬油