核と細胞骨格との間の機械的統合を測定するための直接力プローブ

Summary

このプロトコルでは生きている細胞の核に直接制御力を適用するマイクロ ピペット法について述べる。このアッセイでは、生活、付着性の細胞で核の力学特性の尋問をことができます。

Abstract

核の機械的性質は、細胞で生成された機械的な力への応答を決定します。核が細胞骨格の分子に連続しているため付着細胞での力学的挙動を調べるための方法が必要です。ここでは、付着性細胞の核に直接力を適用するためのツールとして直接力プローブ (DFP) について述べる。我々 は、吸込みを伴う核の表面に細いピペットを添付します。マイクロ ピペットは、翻訳を変形させ、核を引き起こす核から変換されます。復元力が吸引力に等しい、核はデタッチし、弾性を緩和します。吸引圧が正確に知られているために、核の表面に働く力が知られています。このメソッドは、ナノの力が変形し、付着細胞で核を翻訳するのに十分なされ、力に抵抗する核を可能にする骨格の要素を明らかにしました。DFP を使用して、細胞内の核の力学特性に細胞や原子力部品の貢献を分析できます。

Introduction

癌などの疾患は、核の形状と構造^1,2, '' 核^3,4の軟化に伴う一般的に変化を含みます。原子力機械変形抵抗は、隔離された核⁵に力を適用することで一般的に特徴づけられています。

細胞核は細胞骨格に Nucleoskeleton リンカーと細胞骨格 (バイオス) 複雑な^6,7,8,9分子接続されます。その結果、核は、細胞骨格と、細胞-基質間の癒着、細胞外マトリックスを機械的に統合されています。機械的に付着性細胞の中の核を探るこの機械的統合への洞察力を提供できます。マイクロ ピペット吸引^10、11、および原子間力顕微鏡^12,13,14生きた細胞中の核を操作するメソッドが含まれます。最近生活付着性のセル¹⁵に核に直接機械的な力を適用する直接力プローブ (DFP) について述べる。

ここでは、我々 は付着性細胞の核に直接知られているナノ機械的な力を適用する顕微鏡施設で利用可能なインジェクション システムを使用する手順を概説します。Femtotip (0.5 μ m 径マイクロ ピペット チップ) がマウントされ、チューブでのインジェクション システムに接続されています。まで核の表面に隣接して、培養皿の表面に対して 45 ° の角度で配置されている、先端が低下します。チューブは切断し、核の表面に負の吸引圧を作成し、核の表面に対してマイクロ ピペット先端をシール大気開放します。マイクロ ピペット チップの翻訳を通じて核は変形し、最終的に (力の大きさ) によって、マイクロ ピペットを切り離します。この剥離は、核および細胞、によって出される、復元 (耐熱) 力、ピペットによって適用される吸引力の等しい場合に発生します。核の変位を測定することによって分析を行うことが長さひずみ (式 1)、または領域のひずみ (図 1 a)。

Protocol

1. イメージング用細胞を準備

注: 任意の付着性のセルのタイプの直接力プローブ (DFP) を使用できます。ここでは、NIH 3T3 マウス線維芽細胞は、このプロトコルのモデル細胞ラインとして使用されます。

1. 文化 NIH 3T3 線維芽細胞でダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) 1% と 10% ドナー牛血清ペニシリン-ストレプトマイシン 35 ミリメートルのガラスの下に目的の confluency まで皿します。37 ° C と 5% の CO₂の細胞を維持します。
   1. 必ずイメージングのための NIH 3T3 細胞を播種する前に 5 μ g/ml のフィブロネクチン (または類似の ECM 蛋白質) のすべての 35 mm ガラス底培養皿をコートしてください。
      注: セルする必要が完全に普及して実験用皿に付着。DFP メソッドが動作するための密度の面で制約があります。
2. 実験直前にセルを洗浄して完全な培地で一回の洗浄が続く PBS で 2 回。
3. ガラス底皿に完全な成長培地 3 mL を追加します。

2. 顕微鏡と画像の取得

注: 倒立蛍光顕微鏡 (または同等) 側の腕は、メーカーの推奨事項に従ってインストール マイクロマニピュレーターと。顕微鏡は、37 ° c、温度および 5% の CO₂レベルを維持するために環境チャンバーを装備する必要があります。マイクロマニピュレーターとマイクロインジェクター顕微鏡に接続も必要です。油浸漬 40 x/1.3 NA または 60 x/1.49 NA (または同等の目標) は実験のためにお勧めします。顕微鏡は、除振台にマウントする必要があります。

図 1.核変形と顕微鏡の焦点
A. 最大の核変形と核変形の緩和。最大の核の変形を計算する前に核の形態の背面のエッジが変形核の翻訳を修正する最初一致しました。ピペット先端部が抜け出る瞬間に核の形は引く前に初期の原子核の形にかぶせてありました。2 つの図形間の領域の違いを測定した Δ₁。最大の核の変形は ΔA₁ 元の核の面積で割った値として定義されました。同様に、2 番目のパラメーター、Δ₂、元の原子核の形でマイクロ ピペット剥離後最終的な定常状態の原子核の形を重ねることによって定義されるかもしれません。B. 焦点平面にセル、平面 B マイクロ ピペット チップを見つけるまで焦点の平面を移動します。画像の中に、マイクロ ピペットは右 (オレンジ色の矢印の方向) に翻訳しました。この図は、Neelamらから変更されています。¹⁵.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

1. 製造元のプロトコルごとマイクロインジェクターを入れます。
2. 対物レンズの上に液浸オイルの一滴を適用、浸漬オイル ドロッパーを使用します。
3. 料理を皿ホルダーにしっかりとクランプし、ステージ上に皿ホルダーをロードします。
   注: セルは、実験を通じて CO₂を 37 ° C、5% に保たれなければなりません。
4. 焦点 (平面 A図 1 b) にセルを持って目的の高さを調整します。
5. 目的のセルを検索する顕微鏡ステージに移動します。
6. ピペット ホルダーをトップの位置に移動するマイクロマニピュレーターにジョイスティックを回転させます。0.5 μ m 径のヒント マイクロ ピペット ピペット ホルダーに読み込みます。
   1. ピペットへの細胞接着を避けるためには、あらかじめ室温で 0.3 mg/ml の 1 h の PLL g ペグ ソリューション マイクロ ピペット チップを扱います。任意の吸引圧力なし核にマイクロ ピペットを触れるし、核からピペットを翻訳密着性をテストします。密着性の不在は、核変形と翻訳の完全な欠如から識別できます。
      注: パッケージを開く製造の提案に従ってください。
7. 細かい制御を調整することによって面 A と面 B のセルの上部の客観的焦点面を上げる (図 1 b、ステップ 2.4 を参照)。
8. 粗制御に変えればエンブリオバイオプシーに対応を設定します。ゆっくりピペットが焦点に完全にくるまをマイクロ ピペットのシルエット見て平面 B にマイクロ ピペットをもたらします。
9. マイクロ ピペットのチップは、フォーカス、マニピュレーターを微調整に設定します。
10. (平面 A、図 1 b) 細胞の赤道面に目標を下げるし、(図 1 b、破線ピペット) 平面の上約 15 μ m のマイクロ ピペットを下げます。
11. 圧が得られる; マイクロインジェクター on 補正圧力 (P_c)圧力を安定させるために数秒を待ちます。
    注: 最適な圧セット ポイントはセルの種類および実験の特定の目的に依存します。ほとんどの場合、300 hPa は良い出発点になります。
12. マイクロマニピュレーター パネルのクリーン設定を使用して、マイクロ ピペット チップから出てくる空気の泡を確認するためにチェックして、ピペットが詰まっていないことを確認します。
13. 先端は核の表面を軽く触れるまでマイクロ ピペットを徐々 に下げることによって、先端をセルに挿入します。
    注: マイクロ ピペットを下げるとマイクロ ピペット チップのシルエットが焦点になるよう明確ななります。マイクロ ピペットに触れる核、前に上げる目的のフォーカス、核 (同じ x と y 座標、z 面の高い) とマイクロ ピペット チップを合わせます。フォーカスを核 (平面 A、図 1 b) の赤道面に戻り、マイクロ ピペット チップを徐々 に下げます。
14. それにより大気中にマイクロ ピペット チューブの端を開くマイクロインジェクション システムから圧力供給管を切断してマイクロ ピペット チップと核膜のシールを作成します。この手順は、核の表面にP_cに等しい負圧を作成します。
15. 顕微鏡画像コレクション ソフトウェアが画像を取得します。Avi ファイルの取得 (ビデオの) または nd 取得 (イメージ) をコレクションの画像ソフトで設定します。
    注: 任意のイメージング ソフトウェアを取得、リアルタイムのビデオ画像や短い時間間隔でタイムラプス映像買収を設定します。
16. 対応するイメージング チャンネルに切り替え (すなわちGFP、RFP、等)、イメージングを開始。
17. (右側、図 1 b) にセルの体からマイクロ ピペット チップを翻訳核は、マイクロ ピペットから外れるまで引っ張ります。
    注: は、(ビューのフィールドの右側) に肯定的な x 方向のヒントを引き出します。引き率のプログラムやコンピューターによって制御されるジョイスティックを手動で移動することがでくことができます。引っ張って相関が見つかっていない率と核変形¹⁵を強制的に主に弾性応答を示唆しています。

3. データ分析

1. 利用できる基本的な画像処理ソフトウェアで画像解析を実行します。長さひずみ (Ɛ) または領域のひずみ (図 1 a) のいずれかによって核変形の程度を定量化することができます。式 1 を使用して長さひずみを定量化、L と L₀はそれぞれ最大変形と初期位置で核の長さを表します。
   (関係式 1)

Results

図 2 aは、NIH 3T3 マウス線維芽細胞核の強制を示しています。マイクロ ピペット チップの右側に翻訳核変形、最終的にマイクロ ピペット チップから切り離します。吸引力 (図 2 b) とともに増加する核の長さのひずみが見られます。核 (端を引っ張ってマイクロ ピペット) の前面の端を形成する核の突起とトレーリング エッジが元の位置からずれています。突起の長さはトレーリング エッジの変位 (図 2)、核と細胞質の間の緊密な統合を示唆よりも大きくなります。時間スケールが核の前面の端のための短いリラクゼーション (< 1 s)、および核の背面の端 (< 2 s) (図 2 D)。

Discussion

彼らはいずれかの隔離された核 (核は細胞骨格から分離) を必要とするためピペット吸引¹⁶など、最新の方法のための挑戦は、細胞骨格に核の機械的統合を測定または核浮遊細胞 (細胞外の力、牽引力などは欠席)。力は、軸ひずみを膜^17,18; に付着性のセルに適用することで、核に適用されています。ただし、この手法は、核の力が不明であるという事実によって制限されます。原子間力顕微鏡 (AFM) プローブは、そのまま細胞に核をインデントに使用されています。これらのオファーは、彼らが中に核の力学特性を明らかにする利点は、細胞骨格と統合されて。核^12,13,14を特徴付けるため既存の体内手法を加える機械的付着細胞で核をプローブにしたまま簡単で堅牢な方法を開発しました。周囲の骨格に統合されて...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
フルオロディッシュ	WPI	FD35
SYTO 59	サーモフィッシャーサイエンティフィック	S11341
フェムトチップ	エッペンドルフ	930000043
InjectMan NI2	エッペンドルフ	NA	販売終了、現行相当機種:InjectMan 4
FemtoJet	Eppendorf	NA	現行モデル FemtoJet 4i
Plan フッ素油浸 40x	Nikon	NA
Apo TIRF 油浸 60x	Nikon	NA
ドナーウシ血清 (DBS)	ThermoFisherScientific	16030074	NIH 3T3 血清
Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM)	Mediatech cellgro	MT10013CVRF	NIH 3T3 medium
Penicillin-Streptomycin	Mediatech	MT30004CIRF	NIH 3T3 ミディアムサプリメント
浸漬油タイプ LDF 非蛍光	Nikon	77007	対物レンズ用浸漬油