非破壊と長周期のステップでプロトコルの血管リモデリングと生分解性高分子足場ベース組織設計血管拍動性刺激によるリアルタイム文化における足場分解プロセスの監視光干渉断層計を使用してご紹介します。
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この記事について
サマリー
要約
構造と機械的特性自然な血管のように人工血管は動脈バイパスのための高まる需要を満たすために期待されます。成長動態の特性と分解性高分子足場ベース組織設計血管 (TEBVs) 拍動性刺激の改造過程は、維管束組織工学にとって重要です。光学イメージング技術はリアルタイム文化の高分解能イメージングを有効にするに設計された組織の血管新生を監視するための強力なツールとして頭角を現します。このペーパーは、非破壊高速リアルタイム イメージング増加を監視する戦略と光干渉断層計 (OCT) を使用して、長期的な文化の TEBVs の改造を紹介します。異文化タイム ポイントと拍動性刺激の存在で血管改造プロセス、壁厚 TEBV 厚の比較など、幾何学的な形態が評価されます。最後に、10 月拍動刺激下で再建組織のポリマーの劣化の実時間観測の実用的な可能性を提供しますまたはないと各血管によって比較による高分子の劣化評価電子 microscopic(SEM) と偏光顕微鏡をスキャンします。
概要
血管組織エンジニア リング (TEBVs) は理想的な血管1として最も有望な材料です。移植ネイティブ血管として同じような構造と機能特性と臨床的に有用であることを開発するために複数の手法は、血管機能2,3を維持するために設計されています。第 III 相臨床試験4と注入中に許容可能な開存率と設計された船をされているが、また、長期培養と高コストで TEBVs の開発を監視する必要性を示します。バイオミメティック化学力学環境での TEBVs の細胞外今回成長・改造・適応プロセスの理解は、維管束組織工学の開発のための重要な情報を提供できます。
5小口径人工血管の開発を追跡するための理想的な戦略は、非破壊、滅菌、縦、三次元、定量的にする必要があります。異なる培養条件下での TEBVs は、血管移植術前後に変更を含め、このイメージング法によって評価できます。生活設計の船の機能を記述するための戦略が必要です。光イメージング技術は、可視化と組織沈着と生体材料の定量化を許可します。他の利点は、高解像度6,7と深部組織とラベル無料画像を有効にすることです。しかし、イメージ固有の分子とリアルタイム モニタ リングのためのより簡単にアクセス可能な光学機器は、非線形光学顕微鏡の広範なアプリケーションを制限している重要な実用的な障害物です。光干渉断層計 (OCT)、心臓インターベンション治療8を導くための広く使われている臨床ツールとして血管内イメージング法と光アプローチです。文献の 10 月のメソッドは TEBVs9,10, 維管束組織工学研究法の肯定的なイメージと相まっての壁の厚さを評価する方法として報告されました。一方の動力学設計血管成長と改造は観察されなかった。
本稿では、4 週間の文化の生分解性高分子足場ベースの TEBVs の準備を詳しく説明します。ひと臍帯動脈の血管平滑筋細胞 (HUASMCs) が拡張およびバイオリアクター内で多孔性分解性ポリグ リコール酸 (PGA) 足場に播種します。生分解性ポリマーは組織工学のための一時的な基板で役割を果たす、特定劣化率11です。Scaffold の劣化と新組織形成の間の適切な一致を確保するために ECM と PGA 足場効果的な血管リモデリングの重要な要因であります。灌流システムは、ネイティブ血管の力学的な微小環境をシミュレートし、圧刺激の下で一貫した変形を維持します。
提案するプロトコルの目的は、TEBVs イメージングと文化の長期監視のため比較的単純で非破壊戦略を説明します。このプロトコルは、形態学的変化の可視化と異なる培養条件下で設計された容器の厚さ測定に利用できます。また、識別のため足場をエンジニア リング組織で高分子系材料劣化の解析を実行できます。電子スキャンの方法を組み合わせて、microscopic(SEM)、このプロトコル、相関と細胞外マトリックスの分布と PGA 劣化の定量化に使用される偏光顕微鏡可能、評価する足場を促進します。劣化は、OCT イメージングと組み合わせます。
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プロトコル
1. 分解 PGA 足場ベース船文化の組織設計
- PGA 足場作製
- PGA メッシュ (直径 19 mm、厚さ 1 mm) (全長 17 cm、直径 5.0 mm、厚さ 0.3 mm) のエチレンオキ サイド滅菌シリコン チューブ周りを縫う 5-0 縫合糸を使用しています。
- ポリテトラフルオロ エチレン (ePTFE, 1 cm 長さ) PGA メッシュの各端に 4-0 縫合糸で縫うし、2 mm とオーバー ラップします。
- 1 mol/L 空間構造メッシュを調整し、3 回 2 分の組織培養グレードの水に浸して 1 分の NaOH で手で PGA 足場を浸しなさい。優しくパットたびにティッシュ ペーパーで足場を乾燥します。1 h の送風機のフードに足場を乾かします。
- バイオリアクターと OCT イメージングの Y 字分岐管の組立
- 自社開発のガラス円筒型バイオリアクター (10 cm の直径および内部 4 唇と図 1に示すように、炉外 4 つサイドアーム高さ 11.7 cm)、PGA 足場、シリコン チューブを浸す (外径 5 mm、厚さ 0.3 mm)、生体適合性チューブ、コネクタ、攪拌棒、2 h の 95% エタノール タンクの組立用機器。
- Y ジャンクションの別の側面と同様に、コネクタが 1 つの側面に接続されているバイオリアクターのサイドアームをプル PGA 足場使用 10 月ガイドワイヤを提供します。同じ方法でバイオリアクター内で別の PGA 足場を組み立てます。図 1を参照してください。
- 4-0 縫合糸で締めることでバイオリアクターの唇に ePTFE を合わせてください。
- 1 h のために再度エタノール タンクに汚泥を入れ、送風機とフードで一晩の乾燥します。
- HUASMCs 静的バイオリアクター エアコンの播種
- 標準植法によるひと臍帯動脈から HUASMCs を隔離します。
- 拡大し、平滑筋細胞分化培地で細胞から成る DMEM 培地 20% 牛胎児血清、2.36 mg/mL HEPES、100 U/mL ペニシリン G、50 μ g/mL プロリン、20 μ G/ml アラニン、50 μ g/mL グリシン、1.5 μ g/mL CuSO4、50 μ g/mL アスコルビン酸を維持、10 ng/mL 塩基性繊維芽細胞成長因子および 10 ng/mL 血小板由来成長因子。
- 5 × 106セル/mL の PGA の足場の上に上記の培地の濃度でシード HUASMCs。
- バイオリアクター内で撹拌 (1.5 cm) を置きます。シリコーン ストッパー蓋を介してガス交換のため 1 つの栄養チューブ (直径 5 mm、長さ 15 cm) と 3 つの短い配管セグメント (直径 5 mm、長さ 7 cm) を挿入します。
- 各チューブの変更と栄養チューブを 1 つヘパリン キャップに PTFE 0.22 μ m フィルターを取り付けます。13 発/分の攪拌速度と攪拌棒を調整します。文化系にガラス バイオリアクター、シリコーン ストッパー蓋と PGA 足場を組み立てます。
- 左と右のスタンド付き 15 分毎、バイオリアクターを薄くことで 45 分の付着する HUASMCs を許可します。原子炉ポートと継手は、パラフィン フィルムでシールされています。
- 羅を接続-あなたがたのポンプ、PBS バッグ、灌流システムとして生体適合性チューブ ドライバー。PBS のチューブに合わせてドライブを開きます。
- 37 ° C で 5% CO2と加湿のインキュベーターで全体的なバイオリアクターを配置します。450 ml の HUASMCs 培地の培養室を埋めます。
- 停止ボタンを押すし、ドライブのデバイスの電源をオフにします。1 週間静置培養下でシード足場を成長します。
- 吸引チューブと新鮮な培地の相当額が付いているリアクターを補充による古いメディアの半分によって培養培地ごとに 3-4 日を変更します。
- OCT イメージング用灌流システムの作製
- 生体適合性の管や袋に戻って循環する PBS 袋に液体をポンプします。
- ドライバーの電源を開き、分と出力の収縮期血圧 120 mmhg あたり 60 ビートの周波数を持つポンプ設定を調整します。組織エンジニア リング血管文化のニーズに応じて機械のパラメーターを調整します。
- 灌流システムを動作させる実行ボタンをクリックします。一週間静置培養の生体適合性チューブ10,12を繰り返し加圧 3 週間船に固定上の拍動刺激を提供します。
2. OCT 光学イメージングを実行します。
- 光源を使用すると、周波数領域 10 月血管内イメージング システム9TEBV の構造を識別するために 10-20 μ m の軸解像度とイメージ深さ 1-2 mm を確保します。
- 電源スイッチをオンにし、イメージのキャプチャ ソフトウェアを開きます。
- 繊維光学イメージング カテーテル ドライブ モーターと光コント ローラーに接続 (DOC) カテーテル自動後退機能付き。
- 自動撤退速度は 10 mm/s で 1 秒あたり 10 フレームに画像取得率のパラメーターを設定します。
- 18 G 針で Y 字にヘパリン キャップを介してイメージング カテーテルを接続します。
- シリコン チューブにカテーテルを挿入し、バイオリアクターに PGA 足場をロードする前に PGA メッシュの縫合気密性を特定します。
- カテーテル先端を関心領域に置きます。プルバック装置と画像品質8チェック調整します。
- 取得画像 1、4、7、10、14、17、21、28 日間のそれぞれの個々 の TEBV の培養を順番に付けて TEBV 微細構造の実時間挙動観察、表面、内部構造と組成を含みます。
- たびに設計された船舶の正確な測定を得るために 3 回の測定を繰り返します。一連のイメージ キャプチャ ソフトウェアを使用してテスト中の画像をキャプチャします。
3. 画像解析
- TEBV 壁の厚さを測定するのに画像解析ソフトを使用します。分析対象とする画像を選択します。ソフトウェアによって TEBV の内側を自動的に識別し、手動で外側をスケッチする追跡ツールをクリックします。厚さの図は、画面に表示されます。
- 構造の正確な測定を得るために 5 回の測定を繰り返します。取得した情報に目がくらんで 2 つの独立した調査官によって 10 月分析を行った。
4. TEBV とティッシュの処理の収穫
- オープン シリコーン ストッパーふた文化が終わったら、バイオリアクターの上に配置し、培養液を破棄します。バイオリアクターの唇から ePTFE を緩め、ePTFE の外側からシリコン チューブをハサミでカットします。バイオリアクターから TEBVs を収穫し、スキャンの電子顕微鏡検査のためのセクションにカットします。
- TEBVs の残りの部分を取り出して、4 μ m 厚いセクションにカットします。サポートのシリコン チューブを抜くし、4% のパラホルムアルデヒドのセクションを修正します。日常的組織学的染色マッソンのヒアリンとコラーゲンと PGA10,13,14の形態を調べる赤シリウスを実行します。
- PGA コンテンツやコラーゲン成分を評価するには、赤いシリウスは偏光顕微鏡による染色で組織サンプルを観察します。PGA の残党がはっきりと複屈折による区分し、断面積10に基づいて残領域を定量化することができます。
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結果
三次元培養システム培養室、バイオリアクターとクローズド流体サイクル10,13 (図 1) と灌流システムで成っていた。OCT イメージング カテーテルは Y ジャンクションの遠位端に挿入され、イメージング用シリコン チューブの後ろで束ねています。OCT イメージングは、バイオリアクター栽培中に生分解性高分子足場ベース TEBVs の構造キャラクタリゼーションの線引きに初めて使われました。
図 2は示したこれらを通して人工血管リモデリングの過程は断面をリアルタイムに組織の微細構造のイメージングします。拍動性刺激の存在と同様、異文化の時点で壁の厚さ、分解の PGA のコンテンツ、および TEBV の厚さの比較を含む幾何学的...
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ディスカッション
生成する構造を持つ船を設計して血管工学の究極の目標は、機械的性質、ネイティブ血管のよう臨床使用のため時間の短縮につながることができます。光学イメージング技術は、不稔7を損なうことがなく文化環境に文化および露出の移植を通して個々 の構成を監視できない組織血管の特定コンポーネントの可視化を許可します。この記事では、培養室は灌流システムから分離されます。比較的独立した灌流システムは、文化においての汚染の減少のリスクと 10 月ガイドワイヤの配置を保証します。一方この腔内画像モダリティ採用簡単と安全監視 TEBVs の病理を TEBV 成長の状態の評価をより実用的に作られ、も高解像度に近づいていると内臓に期待する前にされるか後のインプラント。
現在のプロトコルは、カテーテル ベースの OCT を用いた分解性ポリマー ベースの設計された容器の開発を評価する容易に利用可能な高速リアルタイム、非破壊イメージング戦略を示します。動的過程の観察を通して血管工学に影響を与える主な要因汚染などや比類のない組織の損失をもたらした物質-細胞相互作用が識別される...
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開示事項
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があるを宣言します。
謝辞
我々 はこの作業を支援する科学と技術計画プロジェクト中国の広東省 (2016B070701007) を確認したいと思います。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| PGAメッシュ | Synthecon | ||
| シリコーンチューブ | コールパーマー | ||
| コネクタ | コールパーマー | ||
| 血管内OCTシステム | セントジュードメディカル株式会社 | ILUMIEN™オプティス&トレード;SYSTEM | |
| 走査型電子顕微鏡 | フィリップ | FEI フィリップス XL-30 | |
| 偏光顕微鏡 | オリンパス | オリンパス BX51 | |
| 縫合 | ジョンソン &ジョンソン | ||
| 脈動ポンプ | 広東心臓血管研究所 | ||
| LightLab イメージングソフトウェア | セントジュードメディカル社 |
参考文献
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