蛋白質の集合とのショウジョウバエモデルの中枢神経系におけるオートファジーのフラックスの蛍光イメージングによる細胞生物学的研究から定量的なデータを抽出する単純なと適応のワークフローを開発しました。神経変性疾患。
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この記事について
サマリー
要約
神経変性疾患の有病率上昇、ますます神経機能障害や損失につながる基本的な病態を理解することが重要です。まだイメージング研究から定量データを抽出するための公平な再現性のある、そしてアクセスのアプローチの必要性はまだ蛍光ベースのイメージング ツールとテクノロジを使用細胞神経生物学プロセスの前例のない分析.神経変性疾患のショウジョウバエモデルを用いた蛍光イメージング研究から定量的なデータを抽出する単純なと適応のワークフローを開発しました。具体的には、フィジー/ImageJ を使用した 2 つの細胞プロセスの分析に従って簡単、半自動化されたアプローチについて述べる: 最初に、私たち定量化タンパク質集計コンテンツとプロファイルを使用して蛍光タグ変異ショウジョウバエ視葉でhuntingtin 蛋白質;第二に、我々 はオートファジーのタンデム蛍光レポーターのレシオ メトリックに基づく定量化とショウジョウバエ視覚系におけるオートファジー ・ リソソーム フラックスを査定し、なさい。重要なは、ここで説明したプロトコルは、すべての蛍光灯の構造分析選択バイアスを最小化し、微妙な比較の解像度を上げるように半自動抽出法の手順を説明します。このアプローチは、他の細胞生物学的構造の分析の延長が可能し、同様、膜結合区画タンパク質涙点 (ストレス顆粒とシナプス複合体) などの神経変性疾患に関与するプロセス (ミトコンドリアと膜輸送小胞)。まだ適応参照画像の解析と定量化のためのポイントし、フィールド間で信頼性と再現性を促進し、最終的に神経変性のメカニズムの理解を高めるため、標準化されたこのメソッドを提供します。
概要
神経変性疾患は毎年数百万人に影響を与えるし、高齢化人口1の発生率が増加しています。各神経変性疾患では、ユニークな病因を持っているが、誤って折りたたまれたタンパク質の凝集およびプロテオステイシス ネットワークの内訳は、これらの疾患の多くの共通の病理学的特徴です。これらの基礎的かつ相互に関連するプロセスの中断がゆがんで行く方法を解明神経の機能不全や細胞の死に貢献する治療上の介在を導くと同様、神経変性疾患を理解することにとって重要です。蛍光ベースのイメージング ニューロンにおけるこれらの複雑で動的なプロセスの調査と神経細胞生物学の私達の理解に大きく貢献しています。蛍光付けられた蛋白質の分析は挑戦的な特に実験生体内で、コンパクトな組織、多様な細胞の種類、形態の多様性などを行った。手動でアシスト定量化手頃な価格と簡単な多くの場合時間がかかり、人間バイアスの対象です。したがって、イメージング研究から定量データを抽出するための公平な再現性のある、そしてアクセスのアプローチの必要性があります。
蛍光イメージング研究の実験モデルから定量的なデータを抽出する強力で自由にアクセスできる画像処理ソフトウェア2,3, フィジー/ImageJ を使用してワークフローをシンプルかつ適応を概説しました。ショウジョウバエ....
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プロトコル
1. 注意事項と画像解析実験を設計するための準備
- たとえば適切な解剖学的、携帯電話、または異なるサンプルの間で利益 (率 ROI) の地域を標準化するためのランドマークとして機能する細胞内のマーカーを事前に定義 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 膜マーカー、ローカライズされた蛍光タンパク質等
- 興味の構造のバック グラウンド レベルを超える離散点を区切ることができます蛍光マーカーを選択します。
注: このプロトコルは、タンパク質の構造 (例えば、誤って折りたたまれたタンパク質凝集体) と膜結合型細胞小器官 (例えば、オートファジー記者) に最適です。蛋白質の集合を可視化、138 の繰り返し (RFP hHttQ138) の病原性 polyQ 管とヒトの Htt 蛋白質 RFP タグ N 末端フラグメントは使用5です。変異体の Htt タンパク質は細胞質骨材elav GAL45,6など神経の特定のドライバーの下で表される場合を形成します。オートファゴソームとリソソームのフラックスを視覚化するには、アクチン GAL4は普遍的タンデム mCherry GFP Atg8a レポーターの発現をドライブに....
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結果
数、地域、およびショウジョウバエ視葉の蛍光タグ変異 Htt 骨材の強度の定量化
ハンチントン病、タグ付きの RFP の突然変異のショウジョウバエモデルの中枢神経系におけるミスフォールド蛋白質の集合を調査する非病理学 (UA RFP hHttQ15) または病理学的拡張 (と HttUAS-RFP-hHttQ138) 膜 GFP (UA mCD8::GFP)11名あったパン神経ドライバー elav GAL4下共発現。雌成虫羽化 (DAE) 後 2 日の脳解剖、固定、DAPI 染色プロトコルのセクション 2 によると。共焦点レーザ走査型顕微鏡は、油浸対物レンズ、1.30 開口数 (NA)、ピクセルあたり 8.0 μ 秒のスキャン速度と 1024 の空間解像度を 1024 ピクセル (ピクセルあたり 12 ビッ.......
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ディスカッション
ここで説明されているプロトコルは、しっかりと再現性をもって量的蛍光ベースのイメージングで可視化した細胞生物学的プロセスに使用できます。生物学的文脈と技術的な制限は、実験的なデザインを導くため慎重に検討する必要があります。蛍光マーカー、興味の細胞レベル下の構造の形態と強度によって背景の上区別する必要があります免疫組織化学的、染料ベース、または遺伝的に表現されるかどうか。ショウジョウバエの標的遺伝子の発現をドライブにUA/GAL4システムを用い。次に示す例は蛋白質の集合と中枢神経系におけるオートファジーを調査するのに UA エンハンサーの制御の下で蛍光付けられた蛋白質の転写をアクティブにするのにトランスジェニック系統 GAL4 ドライバーを使用しました。実験の UAS 遺伝子の同時発現が蛍光レポーター遺伝子と共に必要な場合に、対照群にも GAL4 投与量、たとえばの制御を取るに足らない遺伝子の過剰発現の co を含める必要があります。UA GFPまたはUA lacZ。標準化試料ショウジョウバエ中枢神経系および郭清, 固定, マウントを汚す抗体からの視覚.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
この作品は、シーラとデビッド フエンテ神経因性疼痛研究プログラム大学院研究員 (J.M.B.) に支えられて、ロイス教皇生活フェロー プログラム (セ、Y.Z.、および J.M.B.) (セ) にスナイダー ・ ロビンソン財団を経てフェローシップ博士ジョン T.(セ) にマクドナルド財団契約、(R.G.Z.)、健康 (NIH) の HHSN268201300038C、R21GM119018、および R56NS095893 の国立衛生研究所からの助成金と泰山学者プロジェクトによって (山東省、中国の人々 の共和国) (R.G.Z.)。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| SYLGARD(R) 184 シリコーン エラストマー キット | ダウ コーニング コーポレーション | PF184250 | 解剖皿 |
| ファルコン 35 mm TC処理されていない イージーグリップ スタイル 細菌学 ペトリ皿 | コーニング | 351008 | 解剖皿 |
| デュモン #5 鉗子 | ファイン サイエンス ツール | 11251-20 | 解剖ツール |
| 塩化ナトリウム | シグマ | S3014 | PBS 溶液 |
| リン酸二塩基酸ナトリウム | シグマ | S5136 | PBS 溶液 |
| リン酸カリウム モノベーシック | シグマ | P5655 | PBS 溶液 |
| トリトン X-100 | Sigma | T9284 | 洗浄剤および抗体インキュベーター溶液. |
| 37% ホルムアルデヒド | VWR | 10790-710 | 固定 |
| 用使い捨て微量遠心チューブ (0.5mL、青) | VWR | 89000-022 | 固定、洗浄、抗体インキュベーター。 |
| プレーンおよびつや消しマイクロスライド(25回;75mm) | VWR | 48312-004 | 共焦点イメージング用スライド |
| マイクロカバーグラス、長方形 (22回;40mm) | VWR | 48393-172 | 共焦点イメージング用スライド |
| ラバーセメント | スライム | 1051-A | マウンティング |
| VECTASHIELD 退色防止マウンティング Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| スコッチマジック810インビジブルテープ取付 (19mm;25.4m) | 3M Company | 810 | Mounting |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | Antibody incubaton |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | D1306 | 核酸染色。脱イオン水に溶解して5 mg / mLのストック溶液を作り、-80°Cで保存します。PBTx中のg / mL。 |
| 3.5X-90Xステレオズーム検査工業用顕微鏡 | AmScope | SM-1BNZ | 解剖スコープ。6W LEDデュアルグースネックイルミネーター |
| を装備 ImageJ/Fiji | NIH | v1.51u | SCF_MPI_CBGプラグイン付き(バージョン1.1.2) |
| FV1000-IX81 共焦点レーザー走査型顕微鏡 | オリンパス | ||
| 組換えコンストラクト | ブルーミントン ショウジョウバエ ストックセンター | BL37749 |
参考文献
- Erkkinen, M. G., Kim, M. -O., Geschwind, M. D. Clinical Neurology and Epidemiology of the Major Neurodegenerative Diseases. Cold Spring Harbor perspectives in biology. , a033118(2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-imag....
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再版と許可
