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方法論記事

シナプス小胞の培養神経細胞シナプス蛋白質の過剰発現でリサイクルのため光アッセイ

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DOI:

10.3791/58043

⸱

2018年6月26日

 ,  ,  , 
1Institute for Anatomy and Embryology, University Medical Centre Göttingen

この記事について

サマリー

シナプス小胞 (SV) 培養神経細胞におけるリサイクルの光分析について述べる。このプロトコルを組み合わせて二重トランスフェクション シナプス マーカーおよび興味の蛋白質を表現する容量をリサイクル、シナプス小胞のシナプス前のサイトを見つけて、興味の蛋白質の役割を決定することができます。

要約

アクティブのシナプス前神経終末では、シナプス小胞は exo とエンドサイトーシスのサイクルを受けます。リサイクル中に SV 膜貫通タンパク質の内腔のドメインは細胞表面でさらされます。これらの蛋白質の 1 つは、シナプトタグミン 1 (Syt1) です。培養液に追加した Syt1 の内腔のドメインに対する抗体は、エキソ エンドサイトーシス サイクル中にとられます。この吸収は SV が再資源化量に比例して蛍光抗体法で定量化することができます。ここでは、培養海馬神経細胞の二重トランスフェクション Syt1 抗体吸収と組み合わせています。これにより (1) 遺伝子組換えシナプス マーカー シナプトフィジン発現に基づくシナプス前サイトのローカライズ (2) Syt1 吸収を使用して機能を判断し、(3) 対象を特徴付けることと興味、GFP Rogdi の蛋白質の効果。

概要

シナプス小胞のリサイクルを勉強は、シナプス前のプロパティが変更されたシナプス可塑性中またはシナプス機能の摂動応答の方法を決定するのに重要です。抗体吸収シナプトタグミン 1 (Syt1) を勉強して SV リサイクルの量を測定する方法の 1 つを提供します。Syt1 は Ca2 +センサーとして機能し、神経伝達物質1,2の分泌のリリースに必要な SV 関連タンパク質です。SV 外 C 末端の細胞質ドメインと SV3中 N ターミナル内腔ドメイン膜貫通蛋白質であります。エキソサイトーシス、時 Syt1 の内腔のドメインは外部メディアに露出になります。この外部の媒体には、エンドサイトーシス中に内面になる細胞質ドメインに対する抗体を追加します。これらの抗体は、どちらかはあらかじめ fluorophores が付いてまたは二次抗体4,5,6,7immunostained 共役することができます。結果 immunosignal の蛍光強度は SV リサイクルの量に比例します。このアプローチは、6、8をリサイクル構成と脱分極誘導の SV を決定する使用できます。

Syt1 取り込みアッセイは、料理のほぼすべてのセルにウイルス媒介性遺伝子導入後、または少数の細胞の疎なトランスフェクション後に実行できます。本手法は、リン酸カルシウムの9を使用してプライマリの海馬ニューロンのスパース ダブル トランスフェクションとアッセイを兼ね備えています。我々 は神経終末を検索し、Rogdi の興味の私達の蛋白質をノザン蛍光タグ シナプトフィジン、presynapses で蓄積する知られていた遺伝子組換えマーカー蛋白質を使用します。Rogdi ターゲット機能がシナプスし、リサイクル SV に影響を与えるかどうかをテストことができます。Rogdi 遺伝子はもともと障害メモリ10によって特徴付けられるショウジョウバエ変異体の画面で同定されました。人間では、Rogdi 遺伝子の変異は、Kohlschütter Tönz 症候群と呼ばれる稀で、壊滅的な病気を引き起こします。患者は苦しむエナメル奇形、pharmacoresistant てんかん、精神運動遅延;しかし、遺伝子産物の細胞内局在は、とらえどころのない11を残った。したがって、Syt1 取り込みアッセイは、機能的なシナプス9時 GFP 付けられた Rogdi の局在化のため重要な証拠を提供しました。

この摂取方法には、いくつかの利点があります。まず、SV リサイクル観察できます両方リアルタイムでライブ イメージング7,12, を実行し、後に固定6,9 Syt1 蛍光ラベルの蛍光強度を測定することによって。さらに、いくつかの Syt1 抗体バリエーションが開発されています。固定後の免疫染色標準プロトコルの二次抗体を標識できますタグなしの変形そして既にアタッチされている蛍光ラベルを持つ共役事前の変形があります。最後に、抗体を用いた蛍光は使用できる市販のセカンダリまたは共役染料の大規模な選択のため有利です。

とき固定と染色ニューロンそれはまた追加タンパク質の染色し、共局在解析を実行することが可能。これはリサイクルの SVs に関連して保存されている場所を決定することができます。蛍光ラベルの強度は SV リサイクル量の直接測定です。さらに、抗体は選択的に Syt1 含む構造、高い特異性と小さなバック グラウンド蛍光4の結果をラベルします。脱分極のバッファーや電気刺激プロトコル9,12,13,14など、異なる刺激のプロトコルも使用できます。ただし、基底の SV のリサイクルは神経文化15を刺激することがなく測定できます。

本手法は特に固定後二次抗体反応二重 transfected ニューロン Syt1 抗体吸収を対処します。しかし、我々 はプロトコル固有のニーズに適応する機会を視聴者に我々 の議論のアッセイのすべての日常的に使用された変形を参照します。

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プロトコル

生きている動物を用いた研究を行ったないです。文化は、認可を受けてローカル動物保護当局 (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin ゲッティンゲン) によって承認されたセルを取得する動物の安楽死を含む実験番号 T10/30 です。承認されたプロトコルで実験を行った。

1. 主な海馬細胞培養

  1. 日 1916,17に海馬の解離細胞の培養を準備します。50,000-60,000 細胞/ウェルの密度で 24 ウェル料理ポリエチレンイミン (PEI) でコーティング 12 mm coverslips に細胞をプレートします。商工会議所と段階の対照の光学を数えるセルを用いた密度を確認します。
  2. 3 日間 (1 日体外(DIV) 3) 5% CO2と 37 ° C でインキュベーターで 24 ウェル プレートでニューロンの文化.
  3. 透過光顕 (例えば段階の対照の光学 10-20 倍の倍率で) を使用して細胞の健康の指標、coverslips を評価します。健康の次のインジケーターを確認: 明確なフェーズ コントラスト ハロー、ビーズ構造を持たない神経突起と相馬のクラスタ リングや突起をバンドルします。

2. トランスフェクション

注: 次のプロトコルは、3 井戸のダブル トランスフェクションを指します。ただし、プロトコルは 4 井戸の十分な量を準備するときに最適です。

  1. エルレンマイヤー フラスコ 500 mL のトランスフェクション バッファー (274 mM NaCl、KCl、10 mM 1.4 mM Na2HPO4、15 mM グルコース、42 mM HEPES) を準備します。
    1. 400 mL の三角フラスコに蒸留水に HEPES の 5.0 g、グルコース、1.35 g Na2HPO40.095 g KCl の 0.37 g 塩化ナトリウム 8.0 g を溶かします。
    2. PH メーターを使用して 1 M NaOH で 6.95 に pH を調整します。
    3. 500 mL の蒸留水で音量を調整し、pH 計を用いて pH を確認してください。
    4. 注 1 により pH 値が次のトランスフェクション バッファーの 20-30 mL 因数トランスフェクション バッファーに M NaOH: 6.96、6.97、6.98、6.99、7.00、7.01、7.02、7.03、7.04、7.05、7.06、7.07、7.08、7.09、7.11。
      注: トランスフェクション バッファーの pH は、トランスフェクション効率の重要です。
    5. 7.11 に 6.96 から各 pH 値をテスト、バッファーが transfected セルの最大数につながるトランスフェクションをテストします。2.2 2.11 および検証されたプラスミドを gfp で説明したトランスフェクション法を使用します。どのバッファーの最高の作品を評価するトランスフェクション バッファー pH 値ごとに coverslip あたり transfected セルの数を決定します。
    6. 分注 2 mL の遠心管に最も高いトランスフェクション効率を持つバッファーは凍結し、-20 ° C でチューブを格納
  2. あらかじめ減少血清培地、細胞培養培地と水のバスで 37 ° C に蒸留水を温めます。
  3. 1.5 mL 遠心チューブにトランスフェクション ミックスを準備します。滅菌の労働条件を確保するため層流フードの下で動作します。
    1. 各エンドトキシン フリー DNA (シナプトフィジン mOrange と mGFP/GFP-Rogdi) の 4 μ g と 2 M 塩化カルシウムのミックス 7.5 μ。1.5 mL 遠心チューブに 60 mL の容量に到達する水を追加します。
    2. 60 mL のトランスフェクション バッファーをミックスに追加します。最良の結果を得るためには、渦の DNA ミックスを軽く振りながら滴下トランスフェクション バッファーを追加します。
    3. 室温 (RT) で 20 分間インキュベートします。培養時間の間に層流フードの横にチューブを配置することによって培養管を振動を避けてください。
  4. 層流フードの下で 1000 mL のピペットを使用して井戸から細胞培養培地 (「馴化培地」) を削除、インキュベーターで別の容器に保存できます。
  5. 低血清培地 500 mL を各ウェルに追加します。20 分潜伏期間 (ステップ 2.3.3) が終わるまでは、37 ° C および 5% の CO2のセルを孵化させなさい。
  6. 各ウェルに数滴をピペッティングによるトランスフェクション ミックス 30 mL を追加します。チューブの底部の残基を破棄します。
  7. すべての井戸は、トランスフェクション ミックスで指定されている後、培地でトランスフェクション ミックスの配分を確保するため 24 ウェル プレートを軽く振る。
  8. 井戸を 37 ° C、5% CO2で 60 分間インキュベートします。
  9. 削除しトランスフェクション ミックスを破棄し、細胞培養液で 3 回洗います。各ウェルに細胞培養液の 1 mL と媒体のルート削除 750 mL で 30 秒間インキュベートして新鮮な媒体の同じ量を追加します。これを 3 回繰り返します。
    注意: 洗浄のステップは重要です。最低媒体もそれぞれがない時間を保つ (すなわち。、取り外して交換する - も) 優しく洗浄媒体を追加。
  10. 削除し細胞培養液を破棄し、エアコン中--も 450 mL を追加します。
  11. 37 ° C、5% CO2 DIV 10 でインキュベーターで成熟したニューロンをしましょう。

3. 刺激と Syt1 吸収

注: 次のプロトコルは、3 の井戸に取り込みを適用します。ウェルズの他の数の脱分極の量を調整します。

  1. 50 mL の三角フラスコに 10 の x 脱分極バッファー (640 mM NaCl、KCl、700 mM 10 mM MgCl2、20 mM CaCl2, 300 mM グルコース、200 mM HEPES、pH 7.4) を準備します。
    注: 脱分極バッファーは 4 ° C で数週間保存できます。非脱分極性のソリューションも使用する場合、準備に 10 1290 mm で構成される x Tyrode のソリューション NaCl、KCl、10 mM MgCl2、50 mM 20 mM CaCl2, 300 mM グルコース、200 mM HEPES pH 7.4 を比較するために刺激誘起自然とリサイクルリサイクルしています。1 倍に希釈後、活動電位発生をブロックを使用する前にテトロドトキシンの 1 μ M を追加します。
    1. NaCl、KCl、MgCl2-6 H20 0.1 g、CaCl2-2 H2O の 0.15 g、グルコース 1 H2O の 3.0 g と 50 mL の三角フラスコに蒸留水で HEPES 2.38 g の 2.61 g 1.87 g を溶解します。水酸化ナトリウムと滅菌フィルター ソリューションで pH を調整します。1 倍の濃度を達成するために蒸留水で、バッファー 1:10 を希釈します。
  2. 1 × PBS (pH 7.4) で刺激した後固定用 4% パラホルムアルデヒド (PFA) を準備します。
    1. 4% の 500 mL の 1x PBS で PFA 分解蒸留 H2o. の 450 mL のパラホルムアルデヒドの 20 g
      注: ソリューションを加熱、溶解のスピードが、PFA が崩壊する、ソリューション 70 ° C 以上の加熱はしないでください。
      注意: PFA は有毒、潜在的発癌性および催奇形性です。PFA を使用するときは、手袋を着用、発煙のフードの下で働く、経口摂取を避けます。
    2. Rt ソリューションを冷ます、10 x PBS 原液 50 mL を加えます。水酸化ナトリウム/塩酸 pH メーターを使用して 7.4 に pH を調整します。
  3. 事前脱分極バッファー x 1 600 mL とセル培地水のバスで 37 ° C の 10 mL を温めます。
  4. 脱分極のバッファーと渦 x 1 に 10 秒間マウス抗 Syt1 抗体 (クローン 604.2) の 1 つの mL を追加します。
  5. 取り外して細胞から細胞培養液を廃棄します。まあ各インキュベーターで CO2を 37 ° C、5% で 5 分間インキュベートし脱分極抗体ミックス 200 mL を追加します。
  6. 削除し脱分極抗体ミックスを破棄し、細胞培養液で 3 回洗います。各ウェルに細胞培養液の 1 mL と媒体のルート削除 750 mL で 30 秒間インキュベートし、新鮮な媒体の同じ量を追加します。3 回繰り返します。
  7. 削除し細胞培養液を破棄し、4% の 300 mL を追加 1x PBS で PFA。4 ° C で 20 分間インキュベートします。
  8. 1x PBS で 5 分ごとに 3 回洗います。
    注: プロトコルはここで一時停止することができます。

4. 免疫細胞化学

  1. 50 mL のブロック バッファーを準備します。
    注: 数ヶ月-20 ° C で保管できるバッファーをブロックします。
    1. 10 x PBS 原液 5 mL に 2.5 g のショ糖とウシ血清アルブミン (BSA) の 1 g を溶解します。10% 中性洗剤ストック溶液 1.5 mL を追加します。すべてのコンポーネントが適切に溶解しているし、50 mL の最終的なボリュームに到達するまで蒸留 H2O を追加までソリューションをかき混ぜます。因数ソリューション、ストレージのための因数を凍結します。
  2. 200 mL の 1: 1000 希釈でのブロック バッファーの (プライマリ Syt1 抗体種に対して指示される) セカンダリ、fluorophore つながれた抗体を希釈します。
  3. 取り外してよく観察を含む各から 1 × PBS を廃棄します。
  4. 各ウェルにバッファー抗体ミックスをブロックの 200 mL を追加し、室温 60 分間インキュベート
    注意: 二次抗体は感光性であるために前進のすべての手順は暗闇の中で実行する必要があります。
  5. インキュベーション後、1 mL の 1x PBS で 5 分間、3 回洗浄します。
  6. 埋め込みメディアと顕微鏡のスライド coverslips を埋め込みます。
    1. 顕微鏡スライド上に媒体を埋め込みの 7 mL のドロップを追加します。24 ウェル プレートから注射器でそれを持ち上げて、それを鉗子でつかんで、coverslip を削除します。
      注意: カバーガラスの表面の細胞が簡単に破損している、ので、鉗子は、注意して処理する必要があります。
    2. PBS を外し、慎重に軟部組織への 1 つの端に触れることによってそれを乾燥に蒸留水に、coverslip を浸し。
    3. 細胞を運ぶ表面がそれによって埋め込み媒体にセルを埋め込み、顕微鏡スライドを向くように、埋め込みメディア液滴に coverslip を反転します。
  7. 1-2 h のためのフードの下で乾燥するスライドを残す (光の露出を避けるためにそれらをカバー)、4 ° C で顕微鏡スライドのボックスに保管
    注: プロトコルはここで一時停止することができます。

5. 顕微解析

  1. Coverslips 乾燥後目的とカメラと顕微鏡下でそれらを配置します。
  2. いくつかのピクセルはグレー値の最大分布を確保するため露出オーバーすべてのチャネルのための露光時間を調整します。
    注: チャンネル間露光時間が異なる場合があります、それはず、coverslips 間の比較可能性を確保するための 1 つのチャネルのための定数です。
  3. Coverslip の利子 (ROIs) の 10 の地域のためのマルチ チャンネル画像を取得します。投資収益率の点状される GFP 蛍光をチェックして transfected ニューロンからの軸索のプロセスが含まれていることを確認します。

6. 統計解析

  1. .Tif ファイルとしてイメージをエクスポートします。OpenView18にファイルをクリックして画像を読み込む |イメージファイルをロードします。
  2. チャネル 1 としてシナプトフィジン mOrange 画像、Rogdi-GFP/mGFP 画像 2、チャネル、およびチャネル 3 として Alexa647 蛍光画像を選択します。
  3. Roi のしきい値。
    1. クリックして分析|涙点の場所区域。のみ点状信号チャネル 1 のイメージ (表すシナプトフィジン mOrange 蛍光) を残して、拡散反射光蛍光が除外されて視覚検査時にしきい値とデルタの強度の値を選択します。すべての画像に同じしきい値を維持します。
  4. 今すぐ実行をクリックする (GFP-Rogdi/mGFP 蛍光) 対応するチャンネル 2 にこれらの Roi と coverslip 区分の 3 (Syt1 蛍光) を転送します。
    注: Roi ダブル transfected セルがある場合考慮するべきのみ。このメソッドは、mOrange と GFP 蛍光ははっきりと見えるはずです。
  5. 分析ログ エディターにデータを保存するには、ログ データをクリックします。
  6. [ Windows ] タブの分析ログ エディターを開くし、各チャンネルの値をコピーします。別のチャンネルの値をスプレッドシートに貼り付けます。
  7. 両方のトランスフェクション条件 (GFP Rogdi および mGFP) で・ ロワで Syt1 チャンネルの平均蛍光強度を決定します。
  8. 有意差を決定する学生のt テストなど適切な統計テストを適用します。

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結果

このアプローチの結果ウェルあたり 50,000 ニューロンの密度で約 50 倍 transfected ニューロン coverslip あたりの位置です。各ニューロンの軸索は、蛍光タグ シナプトフィジンの蓄積、クラスターの訓練を示す複数のホット スポットを表示する予定です。機能のシナプス部位で遺伝子組換えシナプトフィジン信号は点状の Syt1 蛍光 colocalizes します。ダブル トランスフェクションを使用すると、(図 1) 興味の蛋白質として GFP Rogdi またはコントロールと mGFP は組換えシナプトフィジン発現。

この実験では、GFP Rogdi または mGFP のいずれかを表現するニューロンのシナプス前サイトでリサイクル SV を分析します。制御タンパク質、mGFP、全体のセル全体に分散され均一共同ンエ濃縮されて第 2 蛋白質を使って必要があるし、シナプスのサイトでそ...

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ディスカッション

日常的にシナプス小胞 (SV) リサイクルを研究するために使用 3 つの試金があります。最初の 2 つの使用を含む、) 蛍光スチリル色素など FM1-43 (これは膜に組み込む、エンドサイトーシス、中に細胞小器官にとられ、開口放出後にリリースされる);b) 蛍光付けられた (これは、過剰発現時にタンパク質のリサイクル機械を組み込む) 遺伝子組換えの SV 蛋白質。添付の fluorophores が付いて、pH によってその蛍光を変更する場合、は、エルサルバドルの酸性の内部と細胞中の pH の変化を監視する使用できます。GFP の pH に敏感なバリアント タグ組換えタンパク質は、Phluorins と呼ばれます。説明 2 つの試金は両方されている前に特色に19、20とそれぞれの賛否両論も見直し21をされています。

ここでは、3 分の 1、確立された方法4,

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

サポート ヴァイスシュヴァルツは、専門的な技術支援を感謝いたします。この作業は、顕微鏡、ナノメートルの範囲のための卓越性のクラスターと (CNMPB, B1-7、両手を使ったのため) 脳の分子生理学を介して DFG によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
B27Gibco17504-044
BSASigmaA7030-50g
CaCl2Sigma-AldrichC3306-100g
CoolSNAP HQ2フォトメトリクス
dH2OInvitrogen15230
DABCOMerck8.03456.0100
ロバ 抗マウス アレクサ 647ジャクソン・イムノリサーチ715605151抗体
DMEMInvitrogen41966
DPBSGibco14190
エッペンドルフチューブエッペンドルフ30120094
マルチウェル 24ウェルフィッシャーサイエンティフィック087721H
チューブ (50mL)Greiner Bio-One
FBS superiorBiochromAGS0615
GlucoseMerck1,083,421,000
HBSSInvitrogen14170
HEPES ΣH4034-500g
Hera Cell 150 (Inkubator)サーモエレクトロン社
KCLSigma-AldrichP9541-500g
L-グルタミンGibco25030
MgCl2>HoneywellM0250-500g
顕微鏡スライドFisher Scientific10144633CF
Microsoft ExcelMicrosoft
Mowiol4-88Calbiochem475904
NaClBioFroxx1394KG001
Na2HPO4BioFroxx5155KG001
NeurobasalInvitrogen21103049
OpenView Experiment Analysis Applicationフリーソフトウェア、。イスラエル工科大学、ハイファ、イスラエル
PBS (10x)Roche11666789001
OptimemInvitrogen31985
PenstrepGibco15140-122
PFASigmaP6148-1kg
安全フードThermoElectronシリアル番号 40649111
スクロースneoFroxx1104kg001
Synaptotagmin1Synaptic Systems105311mouse monoclonal; clone 604.2
Triton X-100Merck1,086,031,000
Vortex Genius 3 IKA3340001
ウォーターバスGFL1004
ツァイスオブザーバーZ1 ツァイス
227261Noam E. Ziv、Technion &ndash によるコメントを参照してください

参考文献

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